Visão mecanística da neuroproteção induzida pela diosmina e melhoria da memória no modelo de rato com ácido intracerebroventricular-quinolínico: ressurreição de funções mitocondriais e antioxidantes, parte 2

2.8. Nova tarefa de reconhecimento de objetos (NORT).

O protocolo padrão foi seguido conforme fornecido por Kumar e Bansal [23].NORT é um arquétipo exteroceptivo não lucrativo e não hostil empregado para avaliar a memória recordativa do tipo funcional explorada através da conduta de sondagem impulsiva de roedores. A investigação é realizada em um recipiente cuboidal de compensado aberto na cobertura (80 cm × 42 cm × 62 cm), posicionado em uma área tranquila, iluminado por um LED de 60W para gerenciar brilho consistente no recipiente.

Os roedores são um tipo de pequenos mamíferos que vivem na Terra. Eles geralmente vivem em pastagens, florestas e outros lugares. Eles vivem uma vida gentil e são baixos e fofos. Em comparação com outros organismos, os roedores têm uma forte vantagem na memória, e muitos estudos mostraram que a memória dos roedores está muito além da nossa imaginação.

Os cérebros dos roedores são muito flexíveis, principalmente quando se trata de tarefas relacionadas ao armazenamento de informações. Muitas experiências mostraram que a memória dos roedores pode até exceder a de outros grandes mamíferos. No experimento, alguns pesquisadores forneceram a roedores, como ratos e hamsters, muitos lugares, objetos, eventos e outras informações diferentes, e então observaram suas reações e o processamento dessas informações. Verificou-se que esses roedores tinham um desempenho de memória muito bom, podendo até lembrar muitas informações e cenas diferentes, ainda melhor do que a maioria dos humanos.

Então, por que os roedores têm melhor memória do que outros animais? Isto é inseparável do ambiente de vida dos roedores. Esses pequenos animais vivem frequentemente em ambientes perigosos, por isso devem aprender a se adaptar rapidamente e a sobreviver. Para manter a sua sobrevivência e reprodução, os roedores precisam de compreender as mudanças no ambiente circundante e informações como as trajetórias de atividade de outros animais e plantas. Isso exige que tenham excelentes habilidades de observação e memória para que possam se adaptar melhor ao ambiente de vida.

Além disso, o estilo de vida e os hábitos comportamentais dos roedores também podem ajudar a melhorar a memória. Alguns estudos mostraram que os roedores gostam de colecionar e armazenar itens, o que pode promover a sua memória e percepção espacial. Além disso, os roedores também gostam de realizar algumas atividades rotineiras, como percorrer um determinado percurso e realizar o mesmo tipo de tarefas. Esse comportamento rotineiro também pode ajudá-los a fortalecer sua memória e habilidades de formação de hábitos.

No mundo biológico, os roedores têm uma memória única e fortes habilidades de observação, memória e adaptação. Para nós, a memória dos roedores pode corresponder às nossas capacidades de aprendizagem e memória. Podemos aprender com os roedores que, desde que continuemos cuidadosos, continuemos a aprender e a acumular nos nossos estudos e na nossa vida, também podemos ter a mesma excelente memória e capacidades de formação de hábitos que os roedores. Isso mostra que precisamos melhorar a nossa memória, e o Cistanche pode melhorar significativamente a nossa memória, pois o Cistanche também pode regular o equilíbrio dos neurotransmissores, como aumentar os níveis de acetilcolina e fatores de crescimento, que são muito importantes para a memória e o aprendizado. Além disso, a Cistanche deserticola pode melhorar o fluxo sanguíneo e promover o fornecimento de oxigênio, o que pode garantir que o cérebro obtenha nutrição e energia adequadas, melhorando assim a vitalidade e a resistência do cérebro.

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Os itens de madeira em forma de cilindro (branco), pirâmide (vermelho) e cubo (preto) (12 cm de altura) (em trigêmeos idênticos) eram sólidos e com peso suficiente para torná-los imóveis por roedores. O NORT foi realizado no 16º dia em 3 etapas (S): fase de aclimatação (S1), aquisição (S2) e exame de reconhecimento de novos objetos (retenção) (S3). Durante S1, três dias consecutivos antes dos testes serem emitidos para descobrir a base vazia do vaso (5 minutos) pelos ratos. Após a conclusão de S1, o animal individual estava habituado a qualquer conjunto de itens sólidos no estágio de aprendizagem (S2).

Coisas semelhantes a gêmeos foram posicionadas em 2 ângulos contrários da embarcação selecionados arbitrariamente (afastamento de 9 cm a 11 cm das muralhas laterais). Separadamente, um roedor foi posicionado no centro do recipiente, voltado para o lado oposto aos dois itens sólidos, e foi-lhe permitido descobrir os dois itens semelhantes durante 5 minutos. Orientar o focinho próximo ao objeto a uma distância menor ou igual a 2–3 cm ou contato físico com o item com o focinho foi considerado conduta investigativa.

Após S2, o roedor foi alojado em gaiola domiciliar, seguido de um recesso intertentativa (ITR) de 60 minutos.

Qualquer item sólido único oferecido em S2 foi trocado por um item sólido diferente, e os roedores foram apresentados novamente aos itens gêmeos, ou seja, uma réplica do item conhecido e do item diferente. diminuir o provável preconceito instigado por uma propensão para certos ambientes ou itens. O recipiente e os itens sólidos foram limpos meticulosamente (álcool etílico 15% e pano seco) após cada investigação para conter os sinais de odor. O período gasto na descoberta de cada item em S2 e S3 foi documentado usando um cronômetro. .e o tempo gasto investigando os dois itens correspondentes em S2 (I1 � Ii1 + Ii2) e o tempo gasto investigando os dois itens diferentes, ou seja, conhecidos e diferentes, em S3 (I2 � Ii3 + Ib) foi gravado. .A variação na duração despendida na investigação do item diferente e na duração da investigação do item conhecido (Ib – Ii3 � DI) revela a retenção da memória lembrada.

DI (índice de discriminação)/S3 duração(ões) de investigação tanto do item conhecido quanto do novo (DI alterado) melhora as parcialidades por variâncias na investigação completa e denota a propensão para itens diferentes em contraste com os conhecidos {DI � (Ib – Ii3 )/(Ii3 + Ib)}. A memória recordatória foi avaliada quantificando a habilidade dos roedores em destacar os itens familiares/novos em S3 e foi declarada como DI (alterada para o período geral de investigação em S3) [24].

2.9. Labirinto Aquático de Morris (MWM). Foi seguido o protocolo padrão, conforme fornecido por Kumar e Bansal [25]. O MWM avalia a memória espacial por meio de testes de natação, nos quais o roedor encontra uma rota de fuga para um pódio escondido.

Um tanque circular de cor preta (2 m de diâmetro, 0,6 m de altura) tinha água (25 ± 1 grau) cheia até uma profundidade de 0,3 m. Este reservatório aquático foi separado no sentido horário em 4 regiões semelhantes (R1, R2, R3 e R4) por meio de duas fibras de náilon, fixadas perpendicularmente no perímetro superior do tanque.

Um estrado (10,5 cm x 10,5 cm) foi posicionado debaixo d'água (1 cm abaixo da água) na região do reservatório R4. A mancha do estrado permaneceu intacta durante todo o período de aquisição. Cada rato recebeu quatro rodadas de aquisição em série (5 minutos ITR) todos os dias. O roedor foi suavemente liberado no reservatório aquático voltado para a parede do tanque, com o local variando a cada tentativa de R1-R4, R2-R1, R3-R2 e R{{ 13}}R3 nos dias 1 a 4, respectivamente, e foram permitidos 120 segundos para detectar o pódio subaquático. Os roedores continuaram a descansar no pódio durante 20 segundos.

Uma falha na detecção da plataforma em 120 segundos indicava a colocação manual dos ratos na plataforma e, em seguida, eram permitidos 20 segundos na plataforma. O tempo de latência de escape (ELT) é a(s) duração(ões) de descoberta do estrado oculto no reservatório aquático. A aprendizagem espacial foi marcada no primeiro dia versus o quarto dia ELT.

No teste da sonda (5º dia), os roedores investigaram o reservatório por 120 segundos, mas foram privados do pódio. .foi registrada a duração média despendida em todo o reservatório (4 regiões). A duração média despendida na sondagem R4 (TSTQ: tempo gasto no quadrante alvo) para o pódio oculto foi considerada como um índice de memória de referência. A configuração comparativa do tanque em relação aos itens do laboratório que atuam como sinais visuais e a posição do investigador permaneceram inalteradas [26].

2.10. Estimativa de Parâmetros Bioquímicos. Após a conclusão dos exames comportamentais, o cérebro completo dos ratos foi coletado e posicionado em cubos de gelo pulverizado, seguido de banho com solução salina esterilizada congelante (isotônica 308 mOsmol/l NaCl) para remoção dos restos mortais e do sangue.

A homogeneização de todo o cérebro foi realizada instantaneamente em um tampão de separação por congelamento (pH 7,4) com a composição D-manitol 215 mM, 20 mM 2-[4-(2-hidroxietil ácido )piperazin-1-il]etanossulfônico, 1 mM,2-bis[2-[bis(carboximetil)amino]etoxi]etano, sacarose 75 mM e 0,1% de BSA. O homogenato foi centrifugado a 4 graus usando força de 13.000 x g por 5 minutos. O sedimento foi rejeitado e o sobrenadante foi separado em duas porções e foi recentrifugado (4 graus) a uma força de 13.000 x g por 5 minutos. O pellet mitocondrial bruto foi separado e novamente centrifugado em um tampão de separação com 1,2-bis[2-[bis(carboximetil)amino]etoxi]etano a 12.500 × g por 11 minutos (4 graus). O depósito semissólido assim obtido compreendendo mitocôndrias não contaminadas foi ressuspenso em um tampão de separação (pH 7,4) contendo sacarose 75 mM, 2-[4-(2-hidroxietil)piperazina-1- 20 mM. ácido il] etanossulfônico e D-manitol 215 mM [27].

Mais tarde, a fração mitocondrial do homogeneizado de todo o cérebro foi usada para determinar os marcadores bioquímicos usando métodos padrão.

2.11. Estimativa do Complexo Mitocondrial

2.11.1. NADH: Atividade da Ubiquinona Oxidorredutase.

A taxa de atividade do complexo I (NADH desidrogenase) foi quantificada (nmol NADH oxidado/minuto/mg de proteína) seguindo a técnica de King e Howard [28]. A geração eoxidativa de NAD+ a partir de NADH é acompanhada pela redução do citocromo c. A mistura de ensaio consistia em citocromo c (10,5 mM), 6 mM de -nicotinamida adeninadinucleotídeo (DPNH) dissolvido usando tampão diglicina 2 mM e tampão diglicina (0,2 M, pH 8,5).

Uma fração mitocondrial solúvel foi incorporada na mistura do ensaio para desencadear a reação. A variação da densidade óptica (DO) em λmax � 550 nm foi acompanhada por 120 segundos.2.11.2. Succinato: Atividade da ubiquinona oxidoredutase. A taxa de atividade da succinato desidrogenase (complexo II) foi quantificada (nmol succinato oxidado/minuto/mg de proteína) seguindo a técnica de King [29].

A acidoxidação succínico é desencadeada por um receptor de elétrons simulado, o cianoferrato de potássio (K3Fe(CN)6). .e mistura de ensaio composta por ácido succínico (00,63 M), 1% de BSA, K3Fe(CN)6 (0.036 M) e Na+-K+ Tampão [PO4]2- (0,23 M, pH 7,6). Uma fração mitocondrial solúvel foi incorporada na mistura do ensaio para desencadear a reação. A variação na DO emλmax � 420 nm foi acompanhada por 120 segundos.

2.12. Determinação de Biomarcadores de Estresse Oxidativo2.12.1. Substâncias reativas ao ácido iobarbitúrico (TBARS). Para avaliar TBARS (nmol por mg de proteína) [30], a combinação de análise (quantidade final ∼4 ml) compreendendo0,10 ml homogeneizado cérebro, 1,51 ml de 4,6-dihidroxi-2-mercaptopirimidina (0,8%), 200 µl de SLS (8,18%), 1,49 ml de ácido glacialacético (21%, pH 3,51) e 0,71 ml de água deionizada foram submetidos a aquecimento em banho-maria a 96 graus por 60 minutos.

Uma proporção de álcool butílico/azabenzeno de 15:1 (5,1 ml) foi suplementada na mistura analisada que foi centrifugada a 4,000 × gpower (10 minutos), e o sobrenadante foi isolado. Com um espectrofotômetro UV1700 de feixe duplo (Shimadzu, Japão), cromóforo malondialdeído-4,6-dihidroxi-2-mercaptopirimidina OD foi avaliado em um comprimento de onda (λmax � 532 nm) e ε � 1,56 × 105/M/cm (coeficiente de extinção molar) foi aplicado para calcular 4,6-adutos de dihidroxi-2-mercaptopirimidina.

2.12.2. Níveis reduzidos de glutationa (Lc-Glutamil-L-Cisteinil-glicina). O procedimento de Ellman [31] foi implementado para avaliar o conteúdo de L-glutationa (GSH). .e a mistura de teste abrangendo homogeneizado (1,1 ml) e 1 ml de ácido 2-hidroxi-5-sulfobenzóico (5-SSA) a 4% foi centrifugado (4 graus) por 11 minutos a 2.500 × g de potência .

Posteriormente, 2,8 ml de tampão Na+-K+[PO4]2- (51,2 mM, pH 7,77) e {{10}},21 ml de 3-carboxi{{13 }}dissulfeto de nitrofenila (00,12 mM, pH 7,89) foram misturados com o sobrenadante separado acima (0,12 ml). O tripéptido (µmolGSH por mg de proteína) foi quantificado com o espectrofotômetro UV1700 de feixe duplo (λmax � 412 nm). aplicandoε � 1,36 ×104/M/cm.

2.12.3. Atividade da Glutationa Peroxidase. A atividade da glutationa peroxidase (GPx) (EC 1.11.1.9) foi avaliada pela implementação da técnica de Mohandas et al. [32]. .eanalisar mistura composta por 100 µl de 10% de homogeneizado, 100 µl de azida de sódio (1,11 mM), 100 µl de EDTA (1,13 mM), 40 µl de glutationa-dissulfeto redutase (GSR, 1 UI/ml) (EC1.8.1.7), 10 µl de H2O2 (0,28 mM), 40 µl de Lc-glutamil-L-cisteinil-glicina (1,2 mM), 100 µl de sal tetrassódico reduzido de coenzima II (0,22 mM ) e 0,12 M 1,49 ml de tampão Na+-K+ [PO4]2-(pH 7,4) em uma quantidade total de 2.000 µl. A perda de tetrassódio reduzido pela coenzima II em λmax – 340 nm foi documentada a uma temperatura de 25 graus.

A taxa GPx foi calculada como nmol NADPH oxidado/minuto/mg de proteína usando ε � de 6,22 × 103/M/cm.

2.12.4. Atividade da Superóxido Dismutase. A taxa de ação da SOD (EC1.15.1.1) (unidades por mg de proteína) foi considerada pelo procedimento de Kakkar et al. [33]. .e a mistura de reação envolveu 0,3 ml de homogeneizado, 100 µl de 5-sulfato de metilfenaziniometil (197 μM) e 1,3 ml de difosfato de sódio usando 200 µl de -nicotinamida adenina dinucleotídeo (DPNH) (780 μM) e interrompido 60 segundos depois usando 1 ml de CH3COOH glacial nesta mistura.

A quantidade de cromogênio gerada foi calculada observando a intensidade da cor em λmax� 56{{10}} nm.2.12.5. Atividade da Catalase. Para avaliar a taxa de ação da catalase (EC1.11.1.6), a discrepância de DO (λmax � 240 nm) da mistura analisada (3,0 ml) compreendendo 50 µl de amostra de investigação, 1,22 ml de H2O2 (0,03 M) em tampão Na+-K+ [PO4]2- (pH7,91, 0,06 M) e 1,63 ml de 0,06 M Na+-K+ [PO4]{{33} } tampão (pH 7,1) foi registrado. A atividade da catalase (µmol H2O2 decaído por minuto por mg de proteína do cérebro) foi calculada aplicando ε � 43,6/M/cm [34].

2.12.6. Nível total de nitritos. .e técnica de Sastry et al.[35] foi implementado para avaliar nitritos cerebrais inteiros (μmolper mg de proteína cerebral). Em tubos de ensaio abrangendo 100 µl de amostra investigativa, 145 mg de amálgama de cobre-cádmio, 500 µl de tampão H2CO3 (pH 8,89), 0,44 M 100 µl NaOH e 119,8 mM 400 µl ZnSO4 foram centrifugados a 4.500 × gpower por 10 minutos e o líquido superior supérfluo(sobrenadante) foi isolado.

O produto químico de Griess (50 µl) foi incluído em 100 µl de líquido supérfluo. Após 60 minutos de incubação, a DO (λmax ± 548 nm de comprimento de onda) foi observada empregando um espectrofotômetro UV1700 de feixe duplo (Shimadzu). Uma curva típica de ácido nitroso sódico (0,02–0,2 mM) foi desenhada e todo o nitrito foi equacionado.

2.12.7. Determinação de Proteínas Totais. O nível global de proteína (mg/ml de homogeneizado) foi calculado usando gráfico de curvatura atípica de albumina sérica bovina com a concentração da solução variando de 0,3 a 3,8 mg/ml. A combinação do exame foi organizada com 250 µl de homogenato, 5,1 ml de reagente de Lowry, tampão Na+-K+ [PO4]2- (900 µl) e 1,1 N 500 µl FCR. .e discrepância de DO foi observada em λmax � 650 nm [36].

2.13. Histopatologia de Seções Cerebrais. Usando uma configuração de difusão alimentada por gravidade, os ratos foram difundidos intracardialmente (via ventrículo esquerdo) com solução de formaldeído tamponado neutro a 10% (NBF a 10%) e anestesiados agudamente. O hipocampo e os setores corticais são imersos em um fixador (fixador 10:1: proporção de tecido), ou seja, NBF a 10% por uma semana (4 graus), acompanhado de natriumazida a 0,04% (pH 7,4).

Álcool etílico (70%) foi empregado como solução de empacotamento para porções fixas de tecido mantidas a 4 graus. Um cortador de micrótomo (tipo rotação) foi empregado para adquirir porções finas (8,0 μm), que foram então tingidas com corante hematoxilina e eosina (H&E). Os slides foram tornados permanentes com resina DPX, que posteriormente foram revestidas e inspecionadas através de um microscópio óptico (binocular) com ampliações de ×40.

2.14. Análise Estatística. Um experimentador habilidoso, cego para diversos regimes de medicamentos administrados a coortes de animais, examinou e avaliou os dados. Os outliers não foram pragmáticos (teste de Grubb) nos dados, e o teste de Kolmogorov-Smirnov e o teste de Levene confirmaram a distribuição normal das variáveis ​​e a homogeneidade da variância (HOV p > 0,05, teste de Levene), respectivamente.

Caso contrário, no caso de variância desigual (HOV p < {{0}}.05, teste de Levene), ANOVA de Welch (p < 0.05, estatística F′) e Testes post hoc de Games – Howell podem ser aplicados. As médias das variáveis ​​normalmente distribuídas foram examinadas e relacionadas por medidas unidirecionais ou repetidas de análise de variância bidirecional (ANOVA). No caso da ANOVA, os resultados são significativos (p < 0,05) na estatística F, foram aplicados testes de comparações múltiplas, nomeadamente HSD de Tukey (diferença significativa honesta) ou Bonferroni. A significância estatística foi considerada p < 0,05 e os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM).

3. Resultados

3.1. Resultados do DSM na massa corporal (g), dieta e ingestão de água de ratos administrados com QA-ICV. O peso corporal, a ingestão de ração e água foram analisados ​​semanalmente, a partir do dia 1. Uma redução significativa (p <{4}} 0,001) na massa corporal (g), consumo de ração e água nos dias 7, 14 e 21 foi pragmática em ratos submetidos à injeção de QA-ICV no dia 1 quando comparados aos equivalentes simulados (Figura 2).

A dosagem de DSM (100 mg/kg) causou um aumento significativo no peso corporal (dia 7p < 0.05, dia 14 p < {{14} }.01, dia 21 p < {{20}}.001), alimentação (dia 7p < 0,05, dia 14 p < 0,01, dia 21 p < 0,001) e ingestão de água (dia 7 p < 0,01, dia 14 p < 0,05) em ratos contra QA-ICV.

DSM (50 mg/kg) também atenuou significativamente a diminuição do peso corporal desencadeada pelo QA-ICV (dia 21 p < 0.05) e ingestão de ração (dia 7 p < 0.05) e ingestão de ração (dia 7 p < 0.{{20}}1) de ratos em relação a ratos que receberam injeções isoladas de QA-ICV. Ratos tratados com QA-ICV e DNP revelaram um aumento significativo na massa corporal (g) (dia 7p <0.05, dia 14 p < 0.001, dia 21 p < 0,001), alimentação (dia 7p < 0,001, dia 14 p < 0,01, dia 21 p < 0,001) e ingestão de água (dia 7, 14, 21 p < 0,01) em relação aos ratos que permaneceram expostos apenas ao QA-ICV.

3.2. Efeito do DSM na Locomoção, Coordenação Motora e Marcha de Ratos contra QA-ICV. Neste estudo, as atividades locomotoras dos animais não foram afetadas pelo QA-ICV ou tratamentos medicamentosos.

O grupo QA não apresentou nenhuma mudança significativa nas contagens médias por 5 minutos no aparelho actofômetro em comparação com o grupo simulado (Figura 3 (a)). Análises de Rotarod e pegada foram utilizadas para avaliar o desempenho sensório-motor e a marcha dos ratos.

Os resultados mostraram que o QA-ICV prejudicou significativamente (p <{1}} 0,001) a coordenação motora (Figura 3 (b)) e a marcha (Figura 3 (c)) de ratos, refletida por uma diminuição na latência para cair da haste giratória e o comprimento da passada de ratos na análise de pegadas em comparação com homólogos falsos.

Os grupos QA + DSM50 e QA + DSM100 retrataram um aumento notável na latência de queda (p < 0,05, p < 0,01) e no comprimento da passada (p < 0,05, p < 0,001)em relação ao grupo GQ.

O tratamento com DNP atenuou significativamente o QA-ICV e desencadeou uma diminuição na latência para queda (p < 0.001) e no comprimento da passada (p < 0,001) quando comparado aos ratos que receberam QA-ICV sozinho. Além disso, o tratamento com DSM (100 mg/kg) apresentou uma melhora significativa (p < 0,01) na marcha em relação ao DSM (50 mg/kg) em ratos submetidos a QA-ICV.

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