Memória aprimorada de reconhecimento de objetos usando estimulação magnética transcraniana repetitiva pós-codificação, parte 2

3. Resultados

Usamos o ORT com um atraso de {{0}}h entre a fase de amostragem e teste para avaliar a eficácia do rTMS na memória. Não houve diferença na atividade do OFT e nos tempos de exploração de objetos na amostragem e teste entre SHAM v TMS (p > 0,05, Fig. 1BD).

A memória é uma parte essencial da vida, ajudando-nos a registar, recordar e inferir experiências passadas, e também afeta as nossas decisões sobre o futuro.

A memória é muitas vezes vista como uma das manifestações da inteligência humana e pode mudar de acordo com os diversos aprendizados e experiências que um indivíduo encontra. Para a maioria das pessoas, a memória tende a diminuir ligeiramente à medida que envelhecem, mas isso pode ser melhorado através de exercícios e treinamento constantes.

A eficácia da memória também é um aspecto muito importante. A memória eficaz pode nos ajudar a compreender melhor nossas experiências e conhecimentos e a nos comunicar melhor com outras pessoas. Também pode ajudar-nos a lidar melhor com os desafios e as pressões e a ter mais sucesso na aprendizagem e no trabalho.

Portanto, precisamos aprender como melhorar a eficácia e a força da nossa memória. Isto inclui o desenvolvimento de bons hábitos de memória, como o estabelecimento de métodos eficazes de tomada de notas e a criação de um ambiente de memória eficiente. Também podemos melhorar a memória adotando um estilo de vida saudável, como dormir o suficiente e fazer exercícios adequados.

Em suma, a eficácia e a força da memória são muito importantes para as nossas vidas. Ao utilizar métodos e abordagens positivas para melhorar a nossa memória e eficácia, podemos lidar melhor com a nossa vida quotidiana e alcançar com mais sucesso os nossos objectivos pessoais e profissionais. Pode-se observar que precisamos melhorar a memória, e Cistanche pode melhorar significativamente a memória porque Cistanche é um material medicinal tradicional chinês com muitos efeitos únicos, um dos quais é melhorar a memória. O efeito do Cistanche vem dos vários ingredientes ativos que contém, incluindo ácido tânico, polissacarídeos, glicosídeos flavonóides, etc.

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Além disso, não houve viés para localização do objeto no teste de aquisição (p > {{0}}.05, dados não mostrados). Os ratos que receberam o TMS durante 72-h tiveram um índice de discriminação significativo do novo objeto (teste t unidirecional t(9)=3.067, p=0,0134), enquanto os ratos SHAM receberam não (teste t unidirecional t(10)=0,705,p=0,496).

Comparando os dois índices de discriminação, o TMS foi significativamente maior que o SHAM (teste t de Student t(19)=2,77, p=0.0122, Fig. 1E). Além disso, apenas o grupo que recebeu EMTr teve um t significativo. Também analisamos a diferença dentro de cada grupo de tratamento de exploração do objeto novo e familiar e encontramos uma diferença significativa entre o objeto explorado e o tratamento dado (Two Way Repeated Measures ANOVA F(1 ,19)=8,305, p=0,0096, hp2=0,304 Fig. 1F).

A análise post-hoc mostrou que o grupo TMS teve um aumento significativo na exploração de novos objetos (p ¼ 0.0092), mas nenhuma diferença no grupo SHAM (p > 0,05), indicando que a EMTr entre os aprendizagem e recuperação do evento consolidaram melhor a memória.

Seguindo esse resultado, estávamos interessados ​​em compreender as alterações neurobiológicas associadas ao melhor desempenho da memória em camundongos que receberam EMTr. Usamos Western Blot para analisar a quantidade de CREB, CAMKII e ERK e sua fosforilação usando o homogenato completo do hipocampo e FC (Fig. 2).

No hipocampo, em geral, houve uma mudança na quantidade de CREB (One-Way ANOVA F(2,15) ¼ 6,20 p ¼ 0.013,hp2¼,488 Figura 2a). A análise post-hoc revelou que isso foi derivado de um aumento no CREB em ambos os grupos que fizeram o teste comportamental, SHAM (p=0,048) e TMS (p=0,016) em comparação ao grupo CONTROLE.

No entanto, foi a fosforilação do CREB que pareceu ser afetada apenas pela EMTr no hipocampo (One-Way ANOVA F(2,15) ¼ 11,813 p ¼ 0.00 1, hp2=0,645 Fig. 2a), uma análise post-hoc mostrou que os camundongos que receberam EMTr apresentaram níveis significativamente maiores de pCREB do que o grupo CONTROLE (p=0,001) e SHAM (p=0,041).

Além disso, encontramos um efeito nos níveis de pCAMKII (One-Way ANOVA F (2,15)=4,817 p=0.029, hp2=0,445, Fig. 2d), onde de forma semelhante a O teste post-hoc pCREB mostrou que a EMTr aumentou a quantidade de pCAMKII em comparação com o grupo CONTROLE (p=0 0,027). No córtex frontal, a fosforilação de CREB pareceu ser afetada pela EMTr (ANOVA unidirecional F( 2,15)=10,572p=0,003, hp2=0,658, Fig. 2b).

A análise post-hoc mostrou que os ratos que receberam EMTr tiveram níveis significativamente maiores de pCREB do que o grupo CONTROLE (p ¼ 0.002)/Houve também um efeito em pCAMKII no FC ( ANOVA unidirecional F (2,15)=6,452 p=0 0,011, hp2=0,498, Fig. 2e), no entanto, a análise post-hoc mostrou que era independente do tratamento, tanto SHAM (p=0,016) quanto Os grupos TMS (0,035) aumentaram o pCAMKII em comparação ao grupo CONTROL.

No FC, o aumento de pCAMKII foi devido ao aumento da fosforilação da CAMKII existente, já que a proporção de pCAMKII para CAMKII também foi aumentada com o teste comportamental (One-WayANOVA F(2,15) ¼ 7,387 p ¼ 0.{{11 }}07, hp2¼.532, Fig. 2e). Testes post-hoc mostraram que tanto SHAM (p=0,026) quanto TMS (0,010) tiveram uma parcela significativamente maior que CONTROL. Tanto no hipocampo quanto no FC não observamos quaisquer alterações significativas na ERK ou na sua fosforilação após a EMTr.

Usamos Western Blot nos homogeneizados sinápticos do hipocampo e FC para determinar o efeito da EMTr em diferentes receptores sinápticos envolvidos na aprendizagem e na memória.

Examinamos a mudança nas subunidades GluR1 e GluR2 do receptor AMPA, bem como no receptor BDNF TrkB. No hipocampo houve diferença nos níveis de GluR2 (Teste de Welch F(2,15) ¼ 6,718 p < 0.001, Fig. 3g) e pGluR2 (One-Way ANOVA F( 2,15)=7,189 p=0,023, hp2=0,461,Fig.

A análise post-hoc revelou que os camundongos SHAM tinham menos GLUR2 do que os CONTROLS (Games-Howell p ¼ 0.022) e os camundongos que receberam tratamento com EMTr tinham níveis significativamente mais altos de ambos GluR2 (Games-Howell p ¼ { {10}}.037) e pGluR2 (p < 0,05) do que os ratos SHAM. No hipocampo, também encontramos alterações no pTrKB (One-Way ANOVA F (2,15)=8,449 p=0,005, hp2=0,585, Fig. 3J).

O teste post-hoc mostrou que tanto os camundongos SHAM (p ¼ 0.008) quanto os camundongos TMS (p=0,013) tiveram menos pTRKb do que CONTROL, o que sugere que esse efeito estava relacionado ao teste de comportamento e independente do tratamento .

Este efeito também foi devido a uma mudança na proporção de TrkB total que foi fosforilado (ANOVA unidirecional F (2,15) ¼ 8,882p ¼ 0.{{10}}04, hp2¼ 0,597, Fig. 3J), tanto SHAM (p=0,042) quanto TMS (p=0,004) foram significativamente menores que CONTROL.

O único efeito no GluR1 foi encontrado no FC onde houve alteração na proporção de GluR1 fosforilado no sítio S845,pGluR1(845) (One-Way ANOVA F(2,15) ¼ 4,170 p ¼ 0,040 , hp2=0,391, Fig. 3e), mas não o site S831.

A análise post-hoc mostrou que houve uma diminuição após a EMTr em comparação com os CONTROLES (p ¼ 0.038). Não houve alteração nos receptores GluR2 no FC, entretanto, encontramos um efeito nos níveis de TrkB (ANOVAF unidirecional (2,15)=13,6 0 1 p=0,001, hp2=0,712, Fig. 3K) e pTrkB (Welch TestF (2,15)=4,745 p=0,035, Fig. 3K ).

A análise post-hoc mostrou que esse efeito foi apenas devido a um aumento nos níveis após o tratamento com EMTr em comparação com os controles para TrkB (p ¼ 0.001) e pTrKB (Games-Howell p ¼ 0,037). .

Como não houve diferença na proporção de pTrKb para TrkB (Fig. 3K), isto sugere que, ao contrário do hipocampo, a alteração no pTrkB foi resultado do aumento global no TrKB.

Finalmente, investigamos o efeito da estimulação da EMTr no aumento e manutenção das conexões sinápticas em áreas do cérebro envolvidas na TRO. Usamos imuno-histoquímica para determinar pontos pré-sinápticos (SV2A) e pós-sinápticos (PSD95) colocalizados para indicar a proporção de sinapses ativas e conectadas nessas áreas.

No geral, houve mudança no número de sinapses colocalizadas na região CA1 do hipocampo (OneWay ANOVA F (2,16)=4,231 p=0. 038, hp2=0,377, Fig. 4a ), o EC (ANOVA unidirecional F (2,16)=4,658 p=0 0,030, hp2=0,392, Fig. 4c) e o PC (ANOVA unidirecional F (2,16)=7,895 , p=0,006, hp2=0,548, Fig. 4d).

Tanto na região CA1 quanto no PC houve aumento da colocalização no grupo TMS para CONTROL (CA1 p ¼ 0.031, PCp ¼ 0.005), entretanto, na CE houve um aumento do CONTROLE em ambos os grupos SHAM (p=0,047) e TMS (p=0,022), sugerindo um efeito global do teste de comportamento nesta região com pouco efeito do tratamento. Não vimos nenhuma mudança significativa no FC.

4. Discussão

Nossos resultados mostram que a EMTr, se administrada entre a codificação e a recuperação, melhora a memória na TRO em camundongos. Esses resultados refletem estudos em humanos que mostraram um efeito semelhante da EMTr pós-codificação ou outras formas de estimulação cerebral não invasiva, na melhoria da memória [2,3].

Estudos predominantemente com roedores se concentraram na pré-codificação da EMTr para melhorar a memória no passado [29e32], portanto, os mecanismos neurobiológicos de consolidação visavam a EMTr, embora para melhoria específica da memória seja mais eficaz do que outros pontos de tempo de estimulação [1], não foram investigados.

Um indicador de LTM persistente é a formação de conexões sinápticas fortes e estáveis. Tanto no PC quanto no CA1, apenas os camundongos que tinham EMTr aumentaram as conexões sinápticas em comparação aos camundongos CONTROL, enquanto os camundongos SHAM não.

O PC e o CA1 dorsal são importantes na memória de reconhecimento de objetos através de mecanismos distintos [33]. Enquanto o PC está envolvido no reconhecimento de objetos com base em sua novidade ou familiaridade, o hipocampo está envolvido na codificação da informação específica do objeto a partir de estímulos sensoriais na memória [33e35]. Como ambas as regiões tinham conexões sinápticas elevadas nos camundongos com EMTr, que melhoraram a memória, isso sugere que a estimulação estava mantendo ambas as conexões importantes nessas áreas que codificam tanto a informação quanto a familiaridade do objeto.

Uma das mudanças biológicas mais marcantes que observamos foi o aumento na expressão de GluR2 na sinapse do hipocampo após o tratamento com EMTr melhorar a memória em comparação com uma diminuição nos camundongos SHAM.

Isto contrastou com muito pouca mudança na expressão de GluR1. Estudos anteriores mostraram que os receptores GluR2 são importantes para o armazenamento de LTM e a remoção dos receptores GluR2 da sinapse está envolvida no esquecimento [36]. Ao contrário, o bloqueio da endocitose do GluR2 evita o esquecimento em ambientes experimentais [37].

Houve apenas alguns estudos que mostraram evidências conflitantes do efeito da EMTr nos receptores GluR2 [26,38,39]. Acreditamos que nossos resultados mostram um efeito único, pois a EMTr foi combinada com a tarefa de aprendizagem que resultou no esquecimento e perda dos receptores GluR2 nos camundongos SHAM.

Portanto, mostramos pela primeira vez que a EMTr pode promover a estabilidade dos receptores GluR2 na sinapse sobre a tarefa de reconhecimento de objetos, o que, conforme demonstrado na literatura anterior, é importante para manter a memória [36,37].

Curiosamente, no FC, a EMTr foi associada a um aumento no TrkB e à fosforilação do TrKB, enquanto no hipocampo, a tarefa de memória reduziu a expressão do pTrkB. A cinética do TrkB na sinapse depende de muitos fatores, pois o TrkB pode ser internalizado na sinapse assim que o BDNF se liga [40].

No entanto, períodos de ativação mais longos do BDNF resultam em uma regulação positiva estável de TrkB, enquanto o BDNF transitório aumenta o TrkB apenas temporariamente [41]. Portanto, a expressão diferente de FC e TrkB do hipocampo pode ser uma indicação dos efeitos específicos da região do BDNF.

No hipocampo, a internalização do TrkB pode ter ocorrido tanto nos camundongos SHAM quanto no TMS em resposta ao teste comportamental, pois a condução da fase de teste pode ter causado algum nível de evento de aprendizagem de reconsolidação em ambos os grupos, o que teria ativado uma resposta curta do BDNF [42e44 ]. Enquanto no FC, como estudos anteriores mostraram aumentos diretos no BDNF da EMTr [18e20], o aumento persistente no BDNF da estimulação ao longo dos três dias pode ter promovido a regulação positiva e a translocação do TrkB para a sinapse [41].

Além disso, o efeito do teste de comportamento causando a internalização do TrkB não teria ocorrido no FC como ocorreu no hipocampo, já que o FC não está envolvido na memória de reconhecimento [45e47]. Isso também foi demonstrado em nosso estudo, pois não houve alteração nas conexões sinápticas nesta região. Estudos futuros devem explorar a EMTr versus os efeitos dos testes comportamentais com mais detalhes para determinar esse mecanismo exato.

A partir de nossos resultados, parece haver uma forte ligação entre CREB e melhor desempenho de memória nos ratos que receberam TMS. No geral, vimos níveis elevados de CREB e sua fosforilação tanto no hipocampo quanto no FC. Este resultado pode estar relacionado a pesquisas anteriores que também mostraram a capacidade da EMTr em aumentar a expressão de CREB e sua fosforilação [20,21].

O aumento do pCREB é importante para a atividade transcricional necessária para converter a memória de curto prazo em um LTM estável [48e50] e o bloqueio do CREB impede a consolidação da memória nas horas seguintes ao evento de aprendizagem [51]. Portanto, na fase de consolidação, seria importante que a EMTr pudesse aumentar o pCREB. No entanto, o papel da activação prolongada da CREB é menos claro.

Este estudo mostra que a fosforilação de CREB foi associada à melhora da memória e, portanto, pode ser importante no melhor desempenho da memória que vimos nos camundongos tratados com EMTr.

A ativação do CREB pode vir de muitas vias sinápticas. Infelizmente, este estudo não determinou o caminho exato que resultaria em pCREB elevado. A fosforilação da CAMKII foi aumentada tanto no hipocampo quanto no FC, o que poderia causar o aumento da fosforilação da CREB [9e11].

Como a EMTr altera os níveis de Ca2+ nos neurônios [18], essa ativação de CAMKII pode ter fornecido uma via direta para ativar CREB. Além disso, a ativação de CAMKII foi diretamente ligada à atividade de GluR2 [52].

No entanto, no FC os camundongos SHAM também apresentaram CAMKII elevado, mas não CREB ou GluR2. A coloração sináptica revelou que o hipocampo desempenha um papel maior na memória de reconhecimento de objetos do que o FC, então talvez haja outras vias regulatórias envolvidas que apoiaram a ativação de CREB de CAMKII após EMTr no hipocampo e não no FC. distinguir se as melhorias da EMTr foram devidas apenas à estimulação dada 3 h após a codificação ou às estimulações dadas dentro de 72- h.

Estímulos de consolidação singulares são eficazes na melhoria da memória em testes em humanos [3], no entanto, em estudos com roedores, a reativação consistente das vias de memória é essencial para a manutenção do LTM [17].

Além disso, a partir dos resultados deste estudo, não podemos identificar se a melhora da memória ou alterações neurobioquímicas resultaram da estimulação da EMTr durante a fase de consolidação, melhorando a consolidação da memória ou se houve um mecanismo secundário alterando a recuperação da memória independente da consolidação.

Os resultados deste estudo mostram alterações de curto prazo na fosforilação de proteínas necessárias à consolidação sináptica e alterações de longo prazo nas conexões sinápticas estáveis ​​necessárias para a manutenção da memória. Portanto, será importante para estudos futuros comparar o efeito de diferentes momentos de estimulação e grupos de controle de ensaio sem sonda para determinar os mecanismos exatos.

5. Conclusão

Juntos, os resultados sugerem que, ao promover maior GluR2 sináptico e prevenir sua endocitose, bem como manter conexões sinápticas no PC e CA1 do hipocampo, a EMTr pode melhorar a memória no teste de reconhecimento de objetos.

Encontramos evidências de que essas alterações estavam possivelmente ligadas às vias CAMKII e CREB nos neurônios do hipocampo. Esses resultados solidificam ainda mais a entrega de EMTr na fase de consolidação da LTM e a alteração da plasticidade sináptica, o que poderia ter maiores implicações no campo da neuromodulação clínica, não apenas para melhorar a memória, mas também nos casos em que uma maior retenção de informações é benéfica, por exemplo, psicoterapia [53].

Estudos futuros poderiam empregar métodos semelhantes para comparar a estimulação de consolidação e manutenção para determinar diretamente o mecanismo molecular que contribui para o efeito, bem como determinar se esse efeito poderia ser estendido com EMTr de manutenção prolongada.

Declaração de contribuição de autoria CRediT

AM Heath: Conceitualização, Análise formal, Investigação, Redação do rascunho original. M. Brewer: Investigação. J. Yesavage: Supervisão, redação e revisão e edição. MW McNerney: Supervisão, Recursos, Aquisição de financiamento, Redação e revisão e edição.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer à Dra. Eugenia Poh por fornecer sua figura para uso no manuscrito. Os autores também gostariam de informar o Ass. Profª Jennifer Roger por fornecer as bobinas TMS personalizadas usadas neste estudo.

Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Assuntos de Veteranos [número de concessão 5IK2BX004105-2]. As informações contidas neste documento não representam as opiniões do Governo dos Estados Unidos, do Departamento de Assuntos de Veteranos ou da Escola de Medicina da Universidade de Stanford.

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