O potencial diagnóstico das proteínas amiloidogênicas, parte 2

4.1. Níveis de proteínas amiloidogênicas na neurodegeneração

Até agora, as estratégias de detecção mais comuns sondam proteínas amiloidogênicas específicas, independentemente de suas conformações ou PTMs, fornecendo informações sobre a quantidade total de proteína amiloidogênica em condições de doença.

A relação entre doença e memória é um tema de grande preocupação e de grande importância para a saúde humana. Uma boa memória é uma manifestação da sabedoria humana, que pode nos ajudar a processar melhor as informações e a tomar decisões com mais precisão. Na vida, muitas pessoas muitas vezes temem que algumas doenças prejudiquem a sua memória, mas na verdade, uma atitude positiva perante a vida e hábitos de vida saudáveis ​​​​podem ajudar-nos a proteger a nossa memória e a prevenir várias doenças.

Primeiro, um bom sono pode ajudar a manter a memória. Estudos demonstraram que o sono é uma parte fundamental do sistema de memória do cérebro, incluindo a codificação, preservação e processo de memória. A falta de sono pode ter efeitos adversos nesses processos, levando à perda de memória. Portanto, manter horas de sono suficientes todos os dias pode ajudar a retardar o declínio da memória.

Em segundo lugar, uma dieta saudável também é fundamental para manter a memória. O corpo humano precisa de nutrientes para nutrir o corpo e o cérebro, e os alimentos que podem melhorar a memória incluem nozes, peixes, frutas e vegetais. As nozes são ricas em proteínas e ácidos graxos, que podem promover o desenvolvimento saudável dos nervos cerebrais. O peixe contém muitos ácidos graxos ômega{0}}, que são benéficos para a saúde dos sistemas cardiovascular e nervoso. Além disso, frutas e vegetais são ricos em antioxidantes, que ajudam a prevenir comprometimentos cognitivos e doenças como o Alzheimer.

Por fim, uma atitude positiva e a prática de exercícios físicos também podem ajudar a manter a memória. As emoções positivas e o pensamento positivo podem melhorar a capacidade cognitiva do cérebro, ativar as conexões neurais e a proliferação celular no cérebro e, assim, ajudar a melhorar a memória. Além disso, o exercício regular pode promover a circulação sanguínea e o fornecimento de oxigênio, o que é benéfico para a saúde do cérebro. Métodos tradicionais de condicionamento físico, como ioga, Tai Chi e medicina chinesa, também podem ajudar a aliviar a tensão e promover a saúde física e mental.

Em resumo, embora exista uma certa relação entre doença e memória, uma atitude positiva perante a vida e hábitos de vida saudáveis ​​podem ajudar-nos a prevenir e atenuar os danos à memória causados ​​por diversas doenças. Portanto, devemos sempre manter uma boa atitude, exercitar-se ativamente, seguir uma dieta razoável e manter hábitos de vida saudáveis, para avançarmos em direção a uma vida saudável e feliz. Percebe-se que precisamos melhorar a memória, e Cistanche pode melhorar significativamente a memória porque Cistanche tem efeitos antioxidantes, antiinflamatórios e antienvelhecimento, que podem ajudar a reduzir a oxidação e as reações inflamatórias no cérebro, protegendo assim a saúde do sistema nervoso. Além disso, Cistanche também pode promover o crescimento e a reparação das células nervosas, melhorando assim a conectividade e a função das redes neurais. Esses efeitos podem ajudar a melhorar a memória, a capacidade de aprendizagem e a velocidade de pensamento, e também podem prevenir a ocorrência de disfunções cognitivas e doenças neurodegenerativas.

Clique em conhecer maneiras de melhorar a função cerebral

Esses métodos são particularmente eficazes quando o mecanismo patológico depende de mutações genéticas (por exemplo, quando uma variante genética de uma proteína é expressa especificamente em pacientes, Tabela 2), níveis de expressão proteica (por exemplo, quando a expressão da proteína é significativamente alterada em pacientes) ou localização incorreta (por exemplo, quando uma proteína se acumula em regiões específicas do corpo em pacientes).

No caso da DA, os experimentos iniciais focaram na medição da concentração de A total no LCR. No entanto, não foram encontradas diferenças significativas entre pacientes e controles [33]. Em contraste, foram observadas diferenças significativas para a tau total.

Os pesquisadores encontraram um aumento acentuado na tau total no LCR de pacientes com DA em comparação com controles saudáveis ​​[67]. Embora haja uma ligação clara entre a concentração de tau no LCR e na DA, concentrações mais altas de tau também são observadas em acidente vascular cerebral agudo, trauma cerebral e outras formas de demência [66,68], tornando o diagnóstico específico da doença um desafio [44,66].

No caso da DP, descobriu-se que o -syn está presente em concentrações ligeiramente mais baixas no LCR de pacientes em comparação com indivíduos saudáveis ​​em pequenos estudos de coorte [68–70]. Isto foi observado também no plasma e na saliva.

Em estudos maiores, o CSF-syn tem uma concentração significativamente menor do que os controles saudáveis ​​[69]. Esta menor concentração de fluidos corporais inacessíveis -syn pode ser uma consequência da agregação intracelular da proteína [69]. No entanto, o uso de -syn sozinho não é suficiente como um único biomarcador para o diagnóstico de DP [69]. Devido à sua baixa concentração, o TDP-43 é difícil de medir de forma confiável no sangue [71,72].

No entanto, no LCR, foi demonstrado que a concentração de TDP{{0}} é maior em pacientes com ELA (6,92 ± 3,71 ng/mL) do que em indivíduos saudáveis ​​(5,31 ± 0,94 ng/mL) e pessoas afetadas por outras doenças. condições, por exemplo, DP, esclerose múltipla e síndrome de Guillain-Barré [73].

Estudos recentes sugeriram que o TDP-43 presente no LCR poderia ser um biomarcador para o diagnóstico de ELA, ELA/DFT, mas não apenas para DFT [74,75]. Em particular, deve notar-se que as proteínas, incluindo o TDP-43, podem difundir-se do sangue para o LCR.

Além disso, o TDP-43 também é abundante em outras partes do corpo além do cérebro [54,76]. Assim, o TDP-43 no LCR pode se originar de outras regiões do corpo e pode não representar adequadamente a patologia cerebral na FTD. Atualmente, os esforços de pesquisa estão se concentrando no monitoramento do TDP-43 contido nos exossomos do LCR, que são derivados do cérebro e, portanto, representam melhor a patologia cerebral [77].

No geral, até agora, apesar das evidências convincentes de que a expressão e as concentrações de proteínas estão alteradas na doença, a investigação da concentração total de proteínas por si só não produziu uma abordagem diagnóstica amplamente adotada.

4.2. PTMs associados à neurodegeneração

Como mencionado anteriormente, os PTMs afetam a propensão de agregação de proteínas amiloidogênicas e desempenham um papel crítico no mecanismo patológico de doenças neurodegenerativas [27,28].

Além disso, os PTMs também são encontrados em amostras biológicas de pacientes [27–29]. Os PTMs aberrantes podem ocorrer bem antes dos sintomas clinicamente observáveis. Esta observação torna os PTMs potencialmente adequados para serem usados ​​como biomarcadores para diagnóstico precoce (Tabela 1).

4.2.1. Fragmentação e Clivagem

A clivagem de proteínas é uma PTM comumente associada à agregação amilóide e tem sido extensivamente investigada tanto in vitro quanto in vivo. Na DA, por exemplo, vários fragmentos de APP têm sido associados à doença, sendo A 42 e A 40 os mais investigados. No entanto, outras formas de A também possuem potencial diagnóstico, incluindo A 37, A 38, A 39 e A 43 [32].

Verificou-se que a concentração de A 42 no LCR é menor em pacientes com DA do que em controles em aproximadamente 50% dos casos [78].

No entanto, atualmente, a razão de concentração no LCR A 42/A 40 é considerada diagnóstica mais precisa, pois leva em consideração as flutuações fisiológicas interindividuais da expressão proteica [78,103].

Além de A 40 e A 42, a concentração de A 43 é menor no LCR de pacientes com DA de início precoce, mas também em pacientes com comprometimento cognitivo leve e outras formas de demência [79].

Pelo contrário, o A 38 está presente em concentrações mais elevadas em pacientes com DA e discrimina especificamente a DA de outras formas de demência [66]. Assim, a relação A 42/A 38 pode correlacionar-se com diferentes tipos de demência e ser utilizada em abordagens diagnósticas de detecção combinadas [103,104].

Apesar de -syn e TDP-43 também serem capazes de sofrer fragmentação, o que desempenha um papel em seus mecanismos patológicos, poucos estudos detectaram isoformas truncadas -syn e TDP-43 em fluidos corporais e seus papéis como potenciais biomarcadores permaneceu desconhecido [28,54,105,106].

4.2.2. Fosforilação

Em A, acredita-se que a fosforilação de Ser8 e Ser26 aumenta a abundância e a estabilidade de agregados tóxicos. O enriquecimento dessas modificações em espécies oligoméricas A, em comparação com monômeros, foi demonstrado usando anticorpos mono ou policlonais específicos para fósforo [80,81].

Como consequência da hiperfosforilação, a tau dissocia-se da rede de microtúbulos e agrega-se. Portanto, a fosforilação da tau é considerada um evento chave na formação do NFT [27].

Nos últimos anos, vários anticorpos foram desenvolvidos para reconhecer especificamente o p-tau e uma variedade de protocolos ELISA foram desenvolvidos para diferentes epítopos fosforilados.

Recentemente, foi demonstrado que p-tau em Thr217 (p-tau217) é um biomarcador robusto de plasma [86] e LCR [107] para DA, pois distingue a DA de outras doenças neurodegenerativas, incluindo outras tauopatias. fosforilado em múltiplos resíduos. Digno de menção é a variante de -syn que transporta a fosforilação de Ser129 (p- -syn129).

Esta modificação ocorre por múltiplas quinases e afeta a agregação e a toxicidade de -syn tanto in vitro [95,96] quanto in vivo [108]. A espectrometria de massa (MS) e experimentos baseados em anticorpos descobriram que os LB isolados dos cérebros de pacientes com DP são enriquecidos em p- -syn129.

Eles também demonstraram que a concentração de p- -syn129 nos fluidos corporais é maior em pacientes com DP e se correlaciona com a gravidade da doença [109,110]. A quantificação de p- -syn129, juntamente com -syn total, no LCR foi sugerida para auxiliar na modelagem da DP e, potencialmente, no diagnóstico diferencial da DP em relação a outros parkinsonismos [110,111].

Vários anticorpos específicos para TDP fosforilado-43 (por exemplo, em Ser409 e Ser410) foram desenvolvidos.

No entanto, o TDP-43 sofre diversas outras modificações, e investigar apenas o estado de fosforilação da proteína não descreve com precisão o estado da doença. As abordagens de detecção atualmente em desenvolvimento envolvem o uso combinado de diferentes anticorpos visando diferentes modificações e conformações do TDP-43 [75,77].

4.2.3. Acetilação

A acetilação é outro PTM importante envolvido na DA. Foi relatado que os níveis gerais de acetilação de agregados A 42- e tau são significativamente maiores no hipocampo com DA em comparação com indivíduos saudáveis ​​(112).

Além disso, vários estudos demonstraram que a acetilação de Lys16 e Lys28 de A altera a agregação do peptídeo in vitro [38]. Em particular, a acetilação de Lys16 leva à formação de agregados amorfos em vez de amilóides [38,39].

Tau sofre acetilação em vários resíduos. Em particular, a acetilação em Lys174, Lys274 e Lys280 recebeu mais atenção, pois demonstrou também regular a função da proteína [87].

Entre essas modificações, Lys280 foi especificamente encontrado acetilado em camundongos transgênicos e tecidos do hipocampo dos pacientes [87]. No caso de DP e demência com LBs (DLB), foi relatado que os tecidos cerebrais (córtex temporal e córtex pré-frontal dorsolateral) de pacientes contêm -syn solúvel e agregado N-terminalmente acetilado [113].

Descobriu-se que a acetilação N-terminal altera significativamente a estrutura do -syn monomérico in vitro. Este PTM induz o dobramento helicoidal do terminal N de -syn [97], que foi sugerido para promover a associação patológica da proteína às membranas [114]. TDP -43 é outra proteína que sofre acetilação.

Este PTM anula a ligação ao RNA e promove a agregação da proteína. Em particular, o TDP-43 atLys145 acetilado pode ser detectado em lesões em pacientes com ELA, mas não em pacientes com DFT, sugerindo que a-43acetilação do TDP estava ligada à patogênese da ELA e poderia ser usada para discriminar ELA de DFT, o que é útil como um biomarcador se for facilmente detectável em fluidos corporais [29].

4.2.4. Oxidação e Nitração

O estresse oxidativo foi descrito como um fator contribuinte em doenças neurodegenerativas [115]. Na DA, a oxidação de A no Met35 foi detectada post-mortem no córtex occipital em pacientes com DA (116).

No entanto, foi demonstrado que esta modificação retarda a agregação da proteína in vitro [30,82] e serão necessárias mais investigações para esclarecer o papel exato na doença. Em vez de visar proteínas amiloidogênicas oxidadas, as abordagens diagnósticas atuais concentram-se principalmente na medição de biomarcadores de estresse oxidativo (por exemplo, produtos de oxidação e metabólitos específicos) [115].

No entanto, estes biomarcadores não são específicos para a neurodegeneração, uma vez que o stress oxidativo também é induzido pela inflamação e no contexto de várias patologias, incluindo o cancro [115]. O desenvolvimento de anticorpos direcionados contra proteínas amiloidogênicas oxidadas, como tau e TDP-43, aliado a abordagens altamente sensíveis pode auxiliar no diagnóstico.

A nitração de resíduos de Tyr foi encontrada em diversas proteínas amiloidogênicas de amostras de pacientes (por exemplo, Tyr10 em A, Tyr29 em tau, Tyr39 em -syn) [28,30,37,89].

Em particular, verificou-se que os níveis de sin nitrado nas células do sangue periférico (monócitos e eritrócitos) são especificamente mais elevados em pacientes com DP. Assim, esta modificação é atualmente considerada como um potencial biomarcador de diagnóstico, embora sejam necessários estudos em maior escala [99,117].

Moléculas de estresse nitrosativo são atualmente avaliadas como potenciais biomarcadores. No entanto, também neste caso, não são específicos para neurodegeneração e são necessárias mais investigações [118].

4.2.5. Glicosilação

Estudos encontraram A-O-glicopeptídeos curtos (A 1-15 a 20) em amostras de LCR com DA e sugeriram que eles poderiam ser biomarcadores úteis, e os perfis e concentrações de glicopeptídeos precisam ser confirmados em estudos prospectivos muito maiores (119) (Tabela 1 ).

Também foi demonstrado que a Tau sofre N- e O-glicosilação. Curiosamente, a O-glicosilação desempenha um mecanismo protetor contra a hiperfosforilação e a formação de PHF (91). Níveis mais baixos de tau O-glicosilada são encontrados em cérebros com DA em comparação com controles saudáveis ​​[91].

Em contraste, a N-glicosilação demonstrou facilitar a hiperfosforilação da tau, promovendo assim a sua acumulação no PHF. A N-glicosilação foi encontrada em cérebros com DA em humanos, mas não em cérebros de controle, o que poderia ser uma modificação relevante para o diagnóstico (83).

Na DP, glicosilado ligado a O com N-acetilglucosamina de -syn também foi encontrado in vivo (100).

As abordagens diagnósticas baseadas na detecção de proteínas amiloidogénicas glicosiladas ainda são largamente inexploradas e novas técnicas estão em desenvolvimento. A avaliação dos padrões de glicosilação em pacientes inclui o perfil de N-glicoma utilizando glicoblotting e MS [120,121].

4.2.6. Ubiquitinação

A ubiquitina marca proteínas mal dobradas e as direciona para degradação através do sistema ubiquitina-proteassoma. Acredita-se que o acúmulo anormal de amiloides possa resultar da alteração da via ubiquitina-proteassoma [122].

Verificou-se que a ubiquitina está presente em concentrações mais elevadas nos tecidos corticais dos pacientes com DA, em comparação com controlos saudáveis ​​[122,123]. Embora estudos iniciais tenham mostrado que a maior parte da ubiquitinação ocorre quando a tau é agregada nos emaranhados, a ubiquitina também foi encontrada na tau solúvel, por exemplo, via conjugação Lys63 [92,93].

Notavelmente, descobriu-se que Lys48 e, particularmente, a poliubiquitinação ligada a Lys, bem como modificações de monoubiquitina, contribuem para a biogênese dos emaranhados.

Análises adicionais poderiam se concentrar na detecção de tau ubiquitinada Lys63 para avaliar seu valor diagnóstico (94). -Syn é encontrado, mono-, di- e tri-ubiquitinado, em LBs de tecidos corticais de cérebros de pacientes com DLB autopsiados [124].

Embora a ubiquitinação em Lys6, Lys12, Lys21, Lys43 e Lys96 tenha demonstrado ter um efeito inibitório na formação de fibrilas, a ubiquitinação em Lys10 e Lys23 tem o efeito oposto e pode ter um papel patológico.

No entanto, sua presença em fluidos corporais e sua conexão com a patologia da DP permanecem desconhecidas [28]. O TDP ubiquitinado-43 é um componente importante dos agregados em cerca de 50% dos casos de DFT e 97% dos casos de ELA, e parece estar a jusante de fosforilação. No entanto, os efeitos da ubiquitinação na agregação de TDP-43 ainda precisam ser mais esclarecidos [29].

Atualmente, possíveis abordagens diagnósticas concentram-se na medição da ubiquitina livre não conjugada, em vez de proteínas ubiquitinadas no LCR (125). Foi observado que a quantidade de ubiquitina no LCR reflete o número de agregados proteicos no cérebro e pode servir como biomarcador [125,126].

4.3. Agregados amilóides e sondas sensíveis a amilóides

Atualmente, os esforços crescentes de pesquisa estão concentrados na geração de ferramentas biomoleculares para atingir conformações agregadas específicas (Figura 2). A lógica subjacente a esta estratégia consiste no facto de que as proteínas amiloidogénicas são geralmente pouco tóxicas quando monoméricas, enquanto a sua toxicidade aumenta significativamente quando são agregadas [13].

Evidências recentes mostram que os oligômeros são particularmente tóxicos [13], portanto, para monitorar a progressão e gravidade das doenças neurodegenerativas, pode-se quantificar especificamente a concentração dos amilóides e/ou dos oligômeros (Tabela 2, Figura 3).

Neste contexto, várias sondas para amilóides e agregados semelhantes a amilóides foram desenvolvidas, incluindo sondas fluorescentes de moléculas pequenas, anticorpos seletivos para conformação e aptâmeros (127–130).

Em particular, estudos de moléculas únicas utilizando moléculas fluorescentes sensíveis à amiloide foram capazes de sondar agregados solúveis individuais presentes nos fluidos corporais dos pacientes.

Para isso, têm sido utilizadas moléculas pequenas, como a tioflavina T (ThT), que aumenta sua fluorescência ao se ligar ao componente de folha cruzada dos amilóides. Usando esta abordagem, os pesquisadores conseguiram quantificar agregados solúveis do tipo amilóide em amostras de DA e PDCSF [131,132].

Além do ThT, outras moléculas com propriedades fluorescentes semelhantes foram desenvolvidas, incluindo rotores moleculares [133,134], como a tioflavina X [135].

Além dessas sondas de moléculas pequenas, foram desenvolvidas biomoléculas altamente específicas, como fragmentos de anticorpos e aptâmeros capazes de sondar oligômeros de diferentes proteínas amiloidogênicas [127,136,137].

Recentemente, a microscopia de super-resolução com aptâmero específico para amiloide e acúmulo de pontos de DNA em topografia em nanoescala foi capaz de detectar -syn e A agregados em amostras de pacientes com DP sem a necessidade de um fluoróforo conjugado (138).

Tradicionalmente, os anticorpos têm sido gerados usando técnicas bem estabelecidas, in vivo por tecnologias de imunização e hibridoma [139,140] ou in vitro usando tecnologias de exibição [141].

O surgimento de novos métodos de descoberta de anticorpos in silico permitiu a geração de anticorpos de maneira econômica e econômica (142). AbDesign, um algoritmo baseado em estrutura que utiliza design combinatório e baseado em energia, tem sido bem-sucedido no projeto de fragmentos de anticorpos direcionados à insulina e à proteína transportadora de acil micobacteriana (143).

Sucessos semelhantes foram obtidos usando procedimentos baseados em estrutura, como OptMAVEn (144) e design de anticorpos Rosetta (145). Mais recentemente, o método Cascade [128] foi desenvolvido para projetar peptídeos complementares a um epítopo alvo que pode ser enxertado na região determinante de complementaridade de uma estrutura de anticorpo.

O método Cascade foi previamente empregado no projeto de anticorpos específicos de conformação para atingir amiloides e oligômeros A 42 [127,146].

4.4. PET Neuroimagem de amilóides no cérebro

A imagem PET utiliza radiotraçadores para rastrear a presença de amilóides no cérebro in vivo (147). Os radiotraçadores são caracterizados por alta lipofilicidade, o que lhes permite atravessar a barreira hematoencefálica.

O composto B de Pittsburgh (11C-PiB) é um análogo fluorescente de ThT e foi usado pela primeira vez para rastrear fibrilas amilóides usando PET em 2004. 11C-PiB está atualmente entre os radioligantes mais usados ​​para imagens PET de patologia cerebral A (148) (Tabela 2) .

O PET-amilóide pode distinguir a demência do comprometimento cognitivo leve e do envelhecimento normal. No entanto, não pode discriminar diferentes formas de demência. Além disso, essas técnicas são caras e os atuais radiotraçadores usados ​​clinicamente refletem apenas o nível de agregados insolúveis no cérebro.

Em contraste, novos radioligantes baseados em anticorpos estão em desenvolvimento para detectar formas A oligoméricas e protofibrilares solúveis e foram testados em camundongos transgênicos [149,150].

For more information:1950477648nn@gmail.com