Os papéis cruciais do TRPM6 na regulação circadiana da pressão arterial

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Importância do canal iônico renal TRPM6 na secreção circadiana de renina para elevar a pressão arterial

Yosuke Funato, Daisuke Yamazaki, Daisuke Okuzaki, Nobuhiko Yamamoto e Hiroaki Miki

Pressão arterialtem um padrão diário, com valores mais elevados no período ativo. Sua elevação no início do período ativo aumenta substancialmente o risco de eventos cardiovasculares fatais. A secreção de renina estimulada por neurônios simpáticos renais é considerada essencial para esse processo; no entanto, seu mecanismo regulatório permanece em grande parte desconhecido. Aqui, mostramos a importância depotencial do receptor transitório relacionado à melastatina 6 (TRPM6), um canal de cátions Mg2 plus -permeável, no aumento da secreção de renina no período ativo.TRPM6a expressão é significativamente reduzida no túbulo contorcido distal de camundongos hipotensos Cnnm2-deficientes. Geramos específicos para o rimTRPM6-camundongos deficientes e observar uma diminuiçãopressão arteriale um desaparecimento de sua variação circadiana. Consistentemente, a secreção de renina não é aumentada no período ativo. Além disso, a secreção de renina após ativação farmacológica do -adrenorreceptor, o alvo da estimulação neuronal, é anulada, e a expressão do receptor é diminuída nas células secretoras de renina. Esses resultados indicam o papel crucial deTRPM6 na regulação circadiana depressão arterial.

Estima-se que aproximadamente um bilhão de pessoas em todo o mundo tenham hipertensão, o que aumenta significativamente o risco de várias doenças, incluindo doenças potencialmente fatais, como doença isquêmica do coração e acidente vascular cerebral. Sabe-se que esses incidentes fatais relacionados à hipertensão ocorrem com frequência no início da manhã, no início do período ativo, quandosanguepressãosobe abruptamente. A secreção de renina desencadeada por neurônios simpáticos renais desempenha um papel crucial neste processo.pressão arterialelevação, mas seu mecanismo regulatório não é bem compreendido².

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É amplamente aceito que alguns minerais dietéticos, particularmente sódio e potássio, desempenham papéis importantes no controle dasanguepressão. O magnésio é um elemento essencial importante envolvido em uma variedade de atividades biológicas. Estudos epidemiológicos mostraram uma relação inversa significativa entre os níveis de magnésio na dieta e o risco de hipertensão3-6. Além disso, a excreção urinária de magnésio, que se supõe estar em equilíbrio aproximado com a absorção intestinal de magnésio, está inversamente correlacionada com o risco de hipertensão. Esses achados sugerem uma estreita associação entre a homeostase do magnésio do organismo epressão arterialregulação, destacando a importância dos canais e/ou transportadores de Mg2 plus na regulação depressão arterial.

Uma grande quantidade de magnésio é constantemente reabsorvida no rim. A maior parte do magnésio no filtrado glomerular é reabsorvido no ramo ascendente espesso da alça de Henle, mas a etapa final da reabsorção ocorre no túbulo contorcido distal (TDC)8. O último processo é rigidamente regulado para ajustar a quantidade de reabsorção a um nível apropriado para manter a homeostase do magnésio. Análises genômicas de doenças congênitas com sintomas de hipomagnesemia revelaram várias moléculas-chave envolvidas nesse processoTRPM6, codificaçãopotencial do receptor transitório relacionado à melastatina 6(TRPM6), que sofre mutação em pacientes com hipomagnesemia recessiva com hipocalcemia secundária2,10.TRPM6forma um canal iônico permeável a Mg2 mais localizado na membrana apical das células DCT e medeia a ingestão de Mg2 mais a partir do lúmen tubular1. Outra molécula chave é a ciclina M2 (CNNM2) e o transportador Mg2 mais localizado na membrana basolateral das células DCT12,13. Mutações Cnnm2 causam hipomagnesemia familiar dominante, que é caracterizada por defeitos na reabsorção de magnésio no riml2. Camundongos deficientes em Cnmm2-apresentam sintomas semelhantes de hipomagnesemia com perda de magnésio no riml4. O papel molecular preciso do CNNM2 ainda é controverso, mas várias linhas de evidência sugerem que ele medeia o Mg2 mais o efluxo de células DCT através da membrana basolateral15, contribuindo assim para a reabsorção de magnésio. Análises adicionais de camundongos deficientes em Cnnm2-revelaram que esses camundongos também têmsanguepressãodo que ratos de controle4. No entanto, os detalhes mecanicistas e o envolvimento de outros canais/transportadores de Mg2 plus nestesanguepressãoregulamento permanecem desconhecidos.

O DCT renal também é conhecido por desempenhar um papel crítico nasanguepressãoregulação porque reabsorve de forma significativa o sódio e regula o volume de líquidos corporais16. Uma série de canais/transportadores de cátions, como o cotransportador Na-Cl (NCC), canal de sódio epitelial (ENaC) e Na plus/H plus trocador 2 (NHE2), são expressos na membrana apical DCT e alguns dos essas proteínas mediam a entrada de Na+ nas células DCT a partir do lúmen tubular. O Na plus intracelular é então extrudado das células através da membrana basolateral pela Na plus /K plus -ATPase para realizar sua reabsorção. Além do envolvimento direto na regulação do volume de líquidos corporais, o DCT está localizado adjacente à mácula densa, que controla a secreção de renina, hormônio com papel principal na orquestraçãopressão arterialregulamento17,18. Ao detectar os níveis urinários de Cl-, as células da mácula densa estimulam as células justa-glomerulares (JG) próximas a secretar renina.

Neste trabalho, realizamos análises de transcriptoma com rins de camundongos hipotensos Cnnm2-deficientes. Encontramos uma queda significativaTrpm6, levando-nos a gerarTrpm6-camundongos deficientes. Inesperadamente, análises desta linhagem de camundongos revelam um fenótipo qualitativamente diferente daquele de Cnnm2-deficiente: a perda da variação circadiana desanguepressão. Também descobrimos que esse fenótipo é causado pela secreção prejudicada de renina, umpressão arterial-aumento de hormônio cujo nível sanguíneo é normalmente elevado durante a fase ativa.

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Resultados

Downregulation deTRPM6 (potencial do receptor transitório relacionado à melastatina 6)expressão em camundongos deficientes Cnnm2-. Explorar o mecanismo molecular depressão arterialredução em camundongos deficientes em Cnnm2-, realizamos análises de microarranjos de DNA para investigar alterações na expressão gênica no rim de Cnnm2f/il; Seis camundongos 2-Cre, sem ambos os alelos Cnnm2 no riml4. Entre os genes diferencialmente expressos (Tabela 1), optamos por analisar Pvalb eTrpm6, ambos expressos no DCT919. As análises quantitativas de PCR (qPCR) revelaram queTrpm6a expressão foi similarmente reduzida nos rins de ambos Cnnm2fi; Seis2-camundongos Cre e Cnnm2 plus. Uma vez que tanto Cnnm2 mais /A quanto Cnnm2fi/; Seis2-camundongos Cre eram hipotensos4, analisamosTRPM6 expressão com mais detalhes. Análises de imunoblotting de lisados ​​renais confirmaram uma diminuição significativa deTRPM6ao nível da proteína por deficiência de Cnnm2-, enquanto os níveis de NCC e NCC fosforilado (forma ativa) não foram significativamente afetados, a expressão de CNNM2 foi confirmada por sucessivas análises de imunoprecipitação e immunoblotting). A diminuição deTRPM6nos rins de Cnnm2f/i; Seis2-camundongos Cre também foram confirmados por análises de imunofluorescência.

Também examinamosTRPM6expressão em camundongos sem CNNM4, que também apresentam sintomas de hipomagnesemia20, mas têmpressão arterial4. As análises de imunotransferência e imunofluorescência indicaram queTRPM6expressão é aumentada em células DCT de camundongos Cnnm4-deficientes, sugerindo queTRPM6expressão está intimamente associadapressão arterialvalores, mas não está diretamente ligado aos níveis de magnésio no sangue.

Regulação deTRPM6expressão por Mg2 mais intracelular em células DCT. Caracterizar o mecanismo molecular deTRPM6 em camundongos deficientes em Cnnm2-, usamos uma linhagem celular derivada de DCT MDCT21, que expressa dominantemente Cnnm2 e moderadamente Cnnm3 e Cnnm4 entre os genes da família Cnnm. Como CNNM2 e CNNM4 têm forte atividade de Mg2 mais efluxo, enquanto CNNM3 não tem atividade de Mg2 mais efluxol5, realizamos knockdown mediado por RNA de interferência pequena (siRNA) de Cnnm2, Cnnm4 ou ambos. O knockdown de Cnnm2 aumentou os níveis intracelulares de Mg plus ([Mg plus]), e o knockdown simultâneo de Cnnm4 levou à ligeira elevação da média [Mg2]; valor, que não foi estatisticamente significativo. Examinamos em seguidaTrpm6expressão por qPCR e encontraram uma diminuição significativa após o knockdown de Cnnm2 e uma diminuição muito maior após o knockdown duplo de Cnnm2 e Cnnm4. Portanto,Trpm6a expressão parece ser regulada negativamente pelos níveis intracelulares de Mg2 plus, o que é consistente com os relatos anteriores23. Para examinar diretamente a importância de Mg2 plus, cultivamos células MDCT em meios com várias concentrações de Mg2 plus 0,1h, diminuindo a concentração extracelular de Mg2 plus levou à redução no nível intracelular de Mg2 plus e ao aumento deTrpm6expressão, sugerindo um papel supressor de Mg2 plus . No caso de células MDCT de duplo knockdown (Cnnm2/Cnnm4),Trpm6expressão foi suprimida com a diminuição de Mg2 mais

mais concentrações até 0.2 mm, mas reduções adicionais cancelaram o efeito supressor; tanto Mg2 mais intracelular quantoTrpm6os níveis não foram significativamente diferentes das células de controle transfectadas com siRNA em ambas as condições 0.1 e 0.02 mM. Esses resultados indicam um mecanismo regulatório dependente de Mg2 plus deTrpm6expressão, o que explica aTrpm6downregulation nos rins de camundongos Cnnm2-deficientes.

Interrupção condicional deTrpm6 (potencial do receptor transitório relacionado à melastatina 6)no rim. A seguir, buscamos gerarTrpm6-camundongos deficientes para investigar a importância deTRPM6na regulamentação depressão arterial. Usamos um clone de células-tronco embrionárias (ES) carregando umTrpm6alelo (Trpm6-) que contém uma sequência aceitadora de splicing, forçando o splicing prematuro do mRNA e resultando em um mRNA truncado após o exon 6. Camundongos heterozigotos quiméricos foram obtidos por injeção de blastocisto das células ES e a recombinação foi confirmada por PCR. Nós cruzamos essesTrpm6mais /- ratos, mas nãoTrpm6-/--off_spring foram obtidos. Este resultado é consistente com relatos anteriores mostrando letalidade embrionária emTrpm6-camundongos deficientes 24,25

Portanto, realizamos uma ruptura condicional específica do rim deTrpm6usando Six2-Cre, que permite a expressão eficiente e específica da recombinase Cre fundida com GFP no rim embrionário.Trpm6fl/, Seis2-camundongos Cre(específicos do rimTrpm6camundongos deficientes) nasceram na proporção mendeliana esperada. Para determinar a expressão deTRPM6, realizamos análises de immunoblotting usando um anti-TRPM6anticorpo.TRPM6níveis de proteína foram muito reduzidos nos rins deTrpm6fl/fl, Seis2-camundongos Cre, mas nenhuma alteração significativa foi observada em outros órgãos. As análises de coloração de imunofluorescência também não mostraram expressão deTRPM6em células DCT positivas para NCC. Não observamos nada significativoTRPM6-sinal positivo em mais de 100 desses aglomerados de células NCC-positivas, sugerindo queTRPM6a expressão é quase completamente suprimida em células DCT de Trpmfi/; Seis2-camundongos Cre. Esses resultados confirmam a geração bem-sucedida deTrpm6-camundongos deficientes.

Nós primeiro examinamos o efeito de rim específicoTrpm6-deficiência na homeostase do magnésio. Mantivemos os camundongos em gaiolas metabólicas e coletamos amostras de urina e soro, que foram então submetidas à quantificação colorimétrica dos níveis de magnésio usando Xylidyl Blue-I. Os níveis séricos de magnésio foram significativamente mais baixos emTrpm6l/l; Seis2-camundongos Cre em comparação com aqueles no controleTrpm6mais/mais; Seis2-camundongos Cre, enquanto os níveis de magnésio urinário eram mais altos. Também realizamos análises de espectroscopia de emissão de plasma indutivamente acoplado (ICP-ES) para medir vários elementos metálicos principais no soro e descobrimos que apenas os níveis de magnésio foram significativamente afetados em Trpmd/; Seis2-ratos Cre. Esses resultados indicam claramente que camundongos deficientes em Trpm6-específicos do rim apresentam hipomagnesemia com perda renal de magnésio, como observado em micel deficiente em Cnnm2-específico do rim4.

Ausência de variação circadiana desanguepressãoe atividade da renina. A seguir, submetemosTrpm6eu/l; Seis2-ratos Cre parasanguepressãomedidas por radiotelemetria. Sistólica e diastólicapressão arterialos valores foram significativamente mais baixos emTrpm6eu/; Seis2-camundongos Cre do que em camundongos de controle. Vale ressaltar que a variação circadiana usual depressão arterial, com valores altos durante o período escuro e valores baixos durante o período claro em camundongos, não foi observado emTrpm6f/l; Seis2-camundongos Cre. Para examinar se o ritmo circadiano prossegue normalmente, usamos radiotelemetria para medir a atividade locomotora de camundongos e confirmamos uma variação circadiana muito clara emTrpm6eu/; Seis{{0}}ratos Cre. Também examinamos os níveis sanguíneos de vasopressina (AVP) e os níveis de mRNA de dois genes de relógio Bmall e Per2 no cérebro e nos rins; todos são conhecidos por apresentarem variação circadiana típica27,28. Analisamos em seis pontos de tempo diferentes (em 0,4,8 zeitgeber vezes (ZT) para o período claro e em 12,16,20 ZT para o período escuro). Camundongos de controle mostram padrões circadianos claros de sua expressão como relatado anteriormente28 e, novamente, não encontramos anormalidades significativas emTrpm6/il; Seis2-camundongos Cre. Também verificamos o nível de expressão de Trpm7, que codifica um canal Mg2 plus -permeável intimamente relacionado aTRPM6, no rim. Os padrões de expressão foram muito semelhantes em ambosTrpm6mais/mais; Seis2-Cre e Trpm6f/; Seis2-camundongos Cre e não mostraram padrões circadianos claros. Coletivamente, concluímos que o ritmo circadiano prossegue normalmente emTrpm6eu; Seis2-camundongos Cre. Foi considerado quesanguepressãoA elevação durante o período ativo (o período escuro para camundongos e o período claro para humanos) em humanos e camundongos ocorre em resposta a um aumento na secreção de renina no sangue2. Medimos a atividade da renina em amostras de sangue coletadas nos seis pontos de tempo diferentes descritos acima. Um claro aumento na atividade da renina no sangue foi observado durante os períodos escuros em amostras de camundongos de controle, mas nenhum aumento significativo foi observado em amostras de camundongos de controle.Trpm6/lSeis2-camundongos Cre. Também medimos o nível sanguíneo de noradrenalina, cuja liberação é sabidamente estimulada pela ativação do sistema renina-angiotensina29,30. Como esperado, sua variação circadiana também desapareceu emTrpm6, Seis2-camundongos Cre. Enquanto isso, o nível de proteína do sangue angiotensinogênio (AGT), outra molécula limitante da taxa de ativação do sistema renina-angiotensina em camundongos31, não foi afetado porTrpm6 deficiência. Os resultados sugerem que a variação circadiana prejudicada da renina é importante para a perda da variação circadiana desanguepressãoporTrpm6-deficiência.

A proximidade deTRPM6células que expressam a células secretoras de renina. A renina é expressa e secretada pelas células JG no rim17,18. As células JG estão em contato direto com a mácula densa, que está localizada adjacente à DCT e estimula a secreção de renina das células JG em resposta à redução dos níveis urinários de Cl18. A coloração de imunofluorescência para renina e óxido nítrico sintase neuronal (nNOS), um marcador de mácula densa, não mostrou anormalidades no padrão ou na intensidade dos sinais positivos observados perto dos glomérulos emTrpm6f/; Seis2-camundongos Cre. Portanto, as células diretamente envolvidas na secreção de renina e sua regulação não parecem ser marcadamente afetadas porTrpm6deficiência. ComoTRPM6é co-expresso com NCC no DCT, examinamos em seguida a relação espacial entreTRPM6/NCC-expressing cells (DCT) e as células da mácula densa ou JG. Imagens confocais de cortes sagitais DCT mostraram quase uma sobreposição completa deTRPM6e sinais NCC em todo o DCT. Em seguida, coramos para nNOS e NCC e descobrimos que as áreas positivas para nNOS e NCC estão conectadas, sem qualquer sobreposição de sinal.TRPM6/NCC revelou que algunsTRPM6As células que expressam /NCC estão próximas às células JG que expressam renina, sugerindo queTRPM6As células que expressam /NCC, assim como a mácula densa, podem ter um impacto significativo na secreção de renina.

Secreção de renina prejudicada porTrpm6 (potencial do receptor transitório relacionado à melastatina 6)deficiência. Em geral, o sistema nervoso autônomo desempenha um papel crucial na orquestração da progressão do ritmo circadiano. Acredita-se que a secreção de renina das células JG durante o período ativo seja estimulada pela noradrenalina secretada pelos neurônios simpáticos renais32. Para investigar diretamente o efeito de tal estimulação na secreção de renina, preparamos fatias de rim e as estimulamos com isoproterenol, um agonista dos receptores adrenérgicos (AR). Os resultados mostraram uma diminuição muito clara no sinal renina-positivo remanescente na fatia após estimulação com isoproterenol por 30 min. Análises quantitativas mostraram que a porcentagem de glomérulos circundados por sinal renina-positivo diminuiu de aproximadamente 80 por cento para 30 por cento após a estimulação com isoproterenol, indicando a ocorrência de secreção maciça de renina. No entanto, não observamos efeito significativo da estimulação com isoproterenol no sinal de renina em fatias de rim deTrpm6/1; Seis2-camundongos Cre. Para confirmar o resultado, também medimos a atividade da renina no sangue após a administração do isoproterenol. Os resultados mostram que a elevação significativa da atividade da renina sanguínea foi observada apenas em camundongos controle, enquanto o aumento da frequência cardíaca foi comumente observado em ambas as linhagens. Esses resultados implicam que as células JG secretoras de renina não podem responder à estimulação dos neurônios simpáticos renais, consistente com o desaparecimento do aumento circadiano dasanguepressãoe atividade da renina emTrpm6l/fl; Seis2-camundongos Cre.

As células JG também podem ser estimuladas a secretar renina em resposta às prostaglandinas, dentre as quais a prostaglandina E2 (PGE2) é considerada a mais significativa, pois é secretada fisiologicamente pelas células da mácula densa quando os níveis urinários de Cl- diminuem17,18. Além disso, sabe-se também que o PGE, tratamento de fatias de rim, pode estimular a secreção de renina de forma eficiente33. A estimulação de células JG com PGE2 e isoproterenol comumente ativa a produção de AMPc, que por fim causa a secreção de renina. Portanto, também testamos o efeito de PGE, e o análogo de cAMP permeável à membrana, dibutilil-cAMP(db-cAMP).PGE2 e db-cAMP estimularam com sucesso a secreção de renina em fatias de rim de Trpmdi/A, Six2- camundongos Cre e camundongos de controle. Isso indica queTrpm6 A deficiência não anula a maquinaria geral envolvida na detecção de sinais externos, na transmissão de sinais intracelulares e na execução da secreção de renina, mas afeta especificamente a resposta a -AR.

Expressão de -AR diminuída em células JG porTrpm6 (potencial do receptor transitório relacionado à melastatina 6)deficiência. Resposta do receptor -AR prejudicadaTrpm6l/eu; Seis camundongos 2-Cre nos levaram a investigar o status da expressão do receptor -AR e, assim, realizamos imunofluorescência de 1-AR, o principal subtipo -AR expresso em células JG34. Conforme relatado anteriormente34, encontramos o padrão de coloração em banda em seções renais de camundongos controle e Trpmdi/l, Six2-Cre. Sabe-se que 1-AR é fortemente expresso em ambos os vasos sanguíneos e células JG34, e consistentemente, as células 1-AR-positivas no final da coloração em forma de banda no rim de camundongo controle também foram positivas para coloração de renina (mostrado com uma ponta de seta). Em contraste, a coloração de Trpm6l/fl; Seis2-rim de camundongo Cre mostraram um número menor de células duplamente positivas 1-AR/renina, sugerindo que a expressão de 1-AR foi diminuída em células JG. Para corroborar esse achado, isolamos as células JG usando o método de centrifugação em gradiente de densidade de Percoll de acordo com o relato anterior35. As análises de imunotransferência revelaram que as células JG renina-positivas são enriquecidas na fração da banda 3, o que é consistente com seu relato35, e a expressão de 1-AR nesta fração da banda 3 foi especificamente muito menor em Trpmdi/1; Seis2-ratos Cre. Juntos, descobrimos queTrpm6a deficiência diminui o nível de expressão de 1-AR nas células JG, o que é consistente com a secreção de renina prejudicada.

O efeito da intervenção artificial no circadianosanguepressãovariação. No conjunto final de experimentos, testamos o efeito de várias intervenções no ritmo circadiano.sanguepressãovariação. Para confirmar a importância da renina, administramos um inibidor de renina clinicamente disponível alisquireno36 a camundongos do tipo selvagem. CurtiTrpm6ablação, administração de alisquireno implantando cirurgicamente uma minibomba osmótica suprimiu significativamente o ciclo circadianosanguepressãovariação. Em seguida, realizamos operações de desnervação renal, uma vez que a ativação de -AR nas células JG através do sistema nervoso simpático é a principal via para estimular a secreção de renina de forma circadiana2. Mais uma vez, descobrimos que a intervenção suprimiu asanguepressãovariação. Esses resultados estão de acordo com nosso modelo de que defeitos na resposta -AR e secreção de renina são responsáveis ​​pela perda depressão arterialvariação em Trpmdl/l; Seis2-camundongos Cre.

Também testamos o efeito de elevar o teor de magnésio na dieta. Para este propósito, camundongos do tipo selvagem foram alimentados com uma dieta rica em Mg contendo 0,6 por cento (dieta normal:0,3 por cento de magnésio) por 1 mês. Como esperado, esses camundongos apresentaram níveis elevados de Mg no sangue. Em seguida, verificamos o nível de expressão deTRPM6no DCT; diminuiu drasticamente ao alimentar uma dieta rica em Mg, e a extensão da diminuiçãoTRPM6a expressão foi maior do que a ablação de Cnnm2 renal. Quando medimos opressão arterialnesses camundongos, descobrimos que os camundongos alimentados com uma dieta rica em Mg apresentaramsanguepressãovariação do queTrpm6-camundongos deficientes, o que é consistente com nossa noção de queTRPM6é importante para o circadianopressão arterialvariação.

Tabela 1 Genes que foram regulados para cima ou para baixo nos rins de Cnnm2flfl/flfl; Seis2-ratos Cre.

Discussão

Neste estudo, demonstramos a importância deTRPM6 (potencial do receptor transitório relacionado à melastatina 6)na regulamentação depressão arterial. Em particular, mostramos o desaparecimento quase completo da variação circadiana depressão arterialem específico do rimTrpm6-camundongos deficientes. Também descobrimos que a secreção de renina, um hormônio chave que orquestra a pressão arterial, foi severamente anulada emTrpm6-camundongos deficientes, o que é consistente com o observadopressão arterialfenótipo. Vários relatórios mostraram que o TRPM7, outro canal permeável ao Mg2 plus muito semelhante aoTRPM6, também afeta a pressão arterial37,38. TRPM7 impede o aumento depressão arterialapós administração de Angiotensina II por supressão da resposta das células endoteliais vasculares à Angiotensina II37. Pelo contrário, foi relatado recentemente que o TRPM7 também facilita a elevação dapressão arterialapós administração de leptina mediando Mg2 mais influxo nas células do corpo carotídeo38. Assim, o papel do TRPM7 napressão arterialregulamento é ambíguo. No entanto, uma vez que o nível de expressão de TRPM7 no rim não foi afetado porTrpm6ablação (Fig. 5 suplementar), parece que TRPM7 não está diretamente envolvido nos fenótipos observados neste estudo.

Conforme observado em camundongos deficientes em Cnnm2-,pressão arterialos valores foram reduzidos emTrpm6-camundongos deficientes (Fig.2)14. No entanto, deve-se notar que havia uma clara diferença entre esses camundongos. Interrupção Cnnm2 geralmente reduzidapressão arterial, mas a variação circadiana ainda era claramente observável. Em contraste, essa variação desapareceu emTrpm6-camundongos deficientes. Essa diferença qualitativa também é consistente com nossa observação de que a variação circadiana da renina foi preservada em camundongos deficientes em Cnnm2-(Fig.9 suplementar). Deve-se notar que tanto CNNM2 quantoTRPM6são considerados importantes para a reabsorção renal de Mg2 mais a mediação do transporte vetorial de Mg2 mais através do DCT e, de fato, camundongos deficientes em qualquer um dos genes exibiram fenótipo renal idêntico de perda de Mg2 mais (Fig. 1 e ref. 39). A diferença qualitativa depressão arterialfenótipo entre Cnnm2-eTrpm6camundongos deficientes sugerem que o transporte de Mg2 mais no DCT, a função comum das duas moléculas, não está diretamente envolvido na variação circadiana depressão arteriale secreção de renina, sugerindo que o CNNM2-papel independente deTRPM6está subjacente a esses fenótipos intrigantes.

Vários mecanismos trabalham para estimular a secreção de renina das células JG para manterpressão arterial. Entre eles, considera-se que a entrada dos neurônios simpáticos renais desempenha o papel principal no aumento dapressão arterialdurante o período ativo de variação circadiana32. Esses neurônios secretam noradrenalina, que se liga e ativa -AR nas células JG para estimular a produção de AMPc, levando à secreção de renina1732. Em nossos experimentos usando fatias de rim obtidas deTrpm6camundongos com deficiência, estimulação com isoproterenol, um agonista de -AR, não mostrou efeito na secreção de renina, enquanto a estimulação com PGE2 ou db-cAMP aumentou eficientemente a secreção de renina (Fig. 4). A PGE2 é secretada pela mácula densa em resposta a baixos níveis de Cl- urinário e ativa os receptores EP2 e EP4 nas células JG, que, assim como a ativação de -AR, acaba estimulando a produção de AMPc40. Portanto, esses resultados implicam que a sinalização -AR é revogada seletivamente em células JG deTrpm6camundongos deficientes, sem afetar a via de sinalização mediada por cAMP a jusante. Consistentemente, a imunofluorescência de seções de rim de camundongo e o immunoblotting de células JG isoladas revelaram que a expressão de -AR foi significativamente diminuída nas células JG deTrpm6-camundongos deficientes (Fig. 5). Essa expressão reduzida de -AR deve tornar as células JG incapazes de secretar renina em resposta à estimulação do nervo simpático durante o período ativo, eliminando assim a variação circadiana do nível de renina no sangue epressão arterial. Deve-se notar que há um estudo usando camundongos knockout 1/2-AR, que mostraram diminuiçãopressão arterialvariação comoTrpm6-camundongos deficientes41. Eles atribuíram isso à diminuição da atividade locomotora, mas ainda é possível que a redução da variação circadiana da atividade da renina contribua para a diminuição da variação circadiana da atividade da renina.pressão arteriale. Alternativamente, o fundo incomum de seus camundongos (fundo misto de C57BL6/J, 129 e VFB; usamos C57BL6/ fundo puro) pode mascarar o efeito de -AR empressão arterialvariação; origens genéticas são críticas para o circadianopressão arterialvariação42.

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Como a perda deTRPM6 (potencial do receptor transitório relacionado à melastatina 6)em células DCT leva à diminuição da expressão de -AR em células JG permaneceu indescritível. Experimentos usando outros tipos de células mostraram que a expressão de -AR é regulada por várias moléculas conhecidas por mediar a sinalização intercelular: A adição de glicocorticóides ao meio de cultura da linha celular derivada do vaso deferente DDT1 MF-2 aumenta a expressão de -AR43. Além disso, foi relatado que o óxido nítrico (NO) suprimiu a degradação de -AR em células cardíacas através da S-nitrosilação de GRK24. Dentre essas moléculas, destaca-se que o NO é secretado pelas células da mácula densa renal, estimulando as células JG de forma parácrina a aumentar a secreção de renina45. Enquanto a expressão da nNOS, a enzima produtora de NO no rim, é restrita às células da mácula densa, elas estão em contato direto com as células DCT, o próximo segmento do túbulo renal6. Assim, é possível queTrpm6-deficiência em células DCT leva à diminuição da expressão de -AR em células JG, afetando a produção ou liberação de NO das células adjacentes da mácula densa.

Sabe-se que as células JG também se comunicam com outras células formando junções comunicantes com células vizinhas, como as células mesangiais, e recebem Ca2+ para suprimir a secreção de renina7. Embora as células JG e as células DCT não entrem em contato direto umas com as outras, elas ainda estão localizadas próximas (ref.46 e Fig.3) e é possível que essas células usem comunicações juncionais comunicantes através de células intervenientes, como células mesangiais; todos os três tipos de células expressam Cx3747,48, uma isoforma de conexina que oligomeriza e constitui junções comunicantes. Uma análise mais aprofundada pode identificar a molécula e a rota responsável pela sinalização intercelular entre as células DCT e JG, o que é importante para desvendar o mecanismo geral de disrupção circadianapressão arterialvariação porTrpm6-deficiência.

DentroTrpm6camundongos deficientes, a variação circadiana dos níveis sanguíneos não apenas de renina, mas também de noradrenalina desapareceu. A ativação do sistema renina-angiotensina estimula a liberação de noradrenalina na corrente sanguínea29,30 e, assim, parece razoável que o efeito daTrpm6 (potencial do receptor transitório relacionado à melastatina 6)ablação dos níveis de renina e noradrenalina no sangue foi semelhante. Como a noradrenalina também atua no -AR das células JG para promover a secreção de renina, assume-se que as duas moléculas constituem uma alça de retroalimentação positiva, estimulando a secreção uma da outra. No entanto, deve-se notar que os resultados dos experimentos de administração de isoproterenol mostram explicitamente o defeito na secreção de renina (Fig.4) e, portanto, parece ser a causa primária da perda da variação circadiana tanto da renina quanto da noradrenalina.

Até agora, uma variedade de drogas eficazes foram desenvolvidas e usadas para tratar pacientes hipertensos. No entanto, um número significativo de pacientes apresenta resistência aos tratamentos convencionais que utilizam a combinação dos principais anti-hipertensivos de diferentes mecanismos funcionais4. A denervação cirúrgica de neurônios simpáticos renais usando cateteres endovasculares tem sido realizada em caráter experimental para tratar essa hipertensão resistente50. A sua eficácia prática na melhoriapressão arterialcontrole tem sido controverso51,52, mas estudos publicados recentemente mostraram uma redução significativapressão arterialem comparação com controles simulados53,54. Há também resultados mistos sobre o efeito da denervação renal na variação circadiana depressão arterial. Alguns relatórios mostraram que a extensão dapressão arterialdiminuição por denervação renal foi maior durante os períodos ativos53, mas outros não relataram alteração na variação circadiana depressão arterial55,56. Na análise com animais de laboratório, nossas operações de denervação renal contra camundongos suprimiram a variação circadiana depressão arterial(Fig.6). Operações semelhantes também foram realizadas contra ratos, mas mesmo os ratos de controle do tipo selvagem quase não apresentam sinais circadianos.pressão arterialvariação em primeiro lugar57,58, dificultando a avaliação do efeito da operação. Mais estudos são necessários para deixar claro o impacto da denervação renal no circadianopressão arterialvariação, o que também nos ajudaria a entender o mecanismo mais detalhado depressão arterialdesregulação porTrpm6-deficiência.

Medições telemétricas depressão arterial, frequência cardíaca e atividade locomotora. Medições telemétricas depressão arterialforam realizados da seguinte forma4.Pressão arterialtransdutores (TAl1PA-C10, Data Sciences International) foram inseridos cirurgicamente na artéria carótida comum esquerda de 2- camundongos de 3- meses de idade sob anestesia (por administração intraperitoneal de 0,3 mg/ kg de medetomidina, 4 mg/kg de midazolam e 5 mg/kg de butorfanol). Após 3 semanas de recuperação, sistólica e diastólicapressão arterialos valores foram registrados com uma amostragem programada de 2-min a cada 60 minutos usando o software Dataquest ART (Data Sciences International). Os registros foram obtidos por pelo menos cinco dias consecutivos, e as médias das medições feitas no mesmo horário a cada dia foram determinadas para cada camundongo e usadas para análises estatísticas adicionais, exceto para a Fig. 4 Complementar. Com base em Nakamori et al.68, a desnervação foi realizada 2 semanas antes da inserçãopressão arterialtransdutores da seguinte forma. Os rins foram expostos por incisão abdominal e o tecido conjuntivo ao redor dos vasos renais foi dissecado. Em seguida, os vasos renais foram imersos em etanol 95 por cento por 2 minutos e, posteriormente, em PBS por 2 minutos. A operação sham foi realizada usando o procedimento equivalente sem imersão em etanol. Alisquireno foi administrado 25 mg/kg/dia por meio da incorporação subcutânea de uma bomba osmótica (1004, ALZET) e o registro foi iniciado a partir do dia após a introdução da bomba. Para suplementação de magnésio, os camundongos foram alimentados com uma dieta enriquecida com magnésio contendo 0,6% de magnésio (CLEA Japan) por 1 mês antespressão arterialmedição.

A frequência cardíaca foi medida com o mesmo sistema de radiotelemetria, exceto que a gravação foi realizada com uma amostragem programada de 30-s a cada minuto, e uma única medida foi usada para análise posterior.

As atividades locomotoras foram avaliadas usando o mesmo sistema de radiotelemetria, monitorando as mudanças na força do sinal do transdutor devido à locomoção do animal. Neste caso, os transdutores foram inseridos cirurgicamente no espaço subcutâneo no flanco direito. As gravações foram realizadas com os mesmos intervalos de tempo descritos acima.

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Referências

1. Giles, TDCritmo circadiano depressão arteriale a relação com eventos cardiovasculares.J. Hipertensos. 24, S11-S16 (2006).

2. Smolensky, MH, Portaluppi, F.& Hermida, RC emPressão arterialMonitoring in Cardiovascular Medicine and Therapeutics, 3rd EDT.(eds White, WB)Parte II, Ch.6, 105-128(Springer,2016).

3. Witteman, JCet ai. Um estudo prospectivo de fatores nutricionais e hipertensão entre mulheres norte-americanas. Circulação 80,1320-1327(1989).

4. Ascherio, A. et ai. Um estudo prospectivo de fatores nutricionais e hipertensão entre homens norte-americanos. Circulação 86,1475-1484(1992).

5. Ascherio, A. et ai. Estudo prospectivo de fatores nutricionais,pressão arteriale hipertensão entre mulheres norte-americanas. Hipertensão 27,1065-1072(1996).

Observação:o acima não é uma lista de referência completa