Nanoconjuntos fotossensíveis de pró-drogas que abrigam uma função de dormência quimioterápica potencializam a imunoterapia contra o câncer

Abstrato

A imunoterapia combinada com terapêutica eficaz, como quimioterapia e terapia fotodinâmica, é uma estratégia bem-sucedida para ativar respostas imunes antitumorais para melhorar o tratamento anticâncer. No entanto, o desenvolvimento de nanoimunoestimulantes transformados multifuncionais, biodegradáveis, biocompatíveis, pouco tóxicos, mas altamente eficientes e clinicamente disponíveis, continua a ser um desafio e é muito procurado. Aqui, relatamos e projetamos um novo nano-pró-fármaco fotoquimioterápico livre de transportadores COS-BA / Ce6 NPs, combinando três componentes multifuncionais de ácido betulínico (BA) de molécula pequena natural automontado, um oligossacarídeo de quitosana solúvel em água (COS), e um fotossensibilizador de baixa toxicidade, clorina e6 (Ce6), para aumentar a eficácia antitumoral da imunoterapia contra o câncer mediada por anti-PD-L1-adjuvante imunológico. Mostramos que os nanofármacos projetados abrigavam uma característica de "dormência" inteligente e distintiva no efeito quimioterápico com menor citotoxicidade desejada e múltiplas características terapêuticas favoráveis, incluindo melhor geração de 1 O2 induzida pela redução da lacuna de energia de Ce6, responsividade ao pH, boa biodegradabilidade e biocompatibilidade, garantindo uma fotoquimioterapia sinérgica altamente eficiente. Além disso, quando combinadas com a terapia anti-PD-L1, tanto a quimioterapia baseada em nano-coassembly quanto a quimioterapia/terapia fotodinâmica (PDT) poderiam efetivamente ativar a imunidade antitumoral no tratamento de tumores primários ou distantes, abrindo possibilidades potencialmente atraentes para a imunoterapia clínica.

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PALAVRAS-CHAVE

Imunoterapia contra o câncer; Nanoimunoestimulantes; Dormência quimioterápica; Pró-droga; Auto-montagem; Molécula pequena natural; Ácido betulínico; Terapia fotodinâmica

1. Introdução

A imunoterapia contra o câncer, como a estratégia de bloqueio do ponto de controle imunológico usando PD-L1 ou CTLA-4 para combater o câncer ativando o sistema imunológico do hospedeiro, sem dúvida revolucionou o tratamento do câncer1,2. Infelizmente, a fraca resposta imunitária e os efeitos terapêuticos ineficazes limitaram enormemente as suas perspectivas clínicas3,4. Recentemente, estudos atuais revelaram que uma combinação de imunoterapia com outras modalidades, como quimioterapia5, terapia fotodinâmica (PDT)6, terapia fototérmica (PTT)7 e radioterapia8, pode efetivamente desencadear a imunogenicidade antitumoral, induzindo as células cancerígenas a sofrerem morte celular imunogênica ( CID)9, que sugere o potencial da modulação imunológica para ativar respostas imunes antitumorais. Numerosos projetos inovadores de nanomateriais baseados nessas combinações sinérgicas de estratégias de imunoterapia alcançaram uma atividade anticancerígena significativamente melhorada, incluindo nanopartículas (NPs) inorgânicas10, poliméricas11 e biomiméticas12. No entanto, o desenvolvimento de nanoimunoestimulantes transformados multifuncionais, biodegradáveis, biocompatíveis, de baixa toxicidade, mas altamente eficientes e clinicamente disponíveis, continua a ser um grande desafio e uma enorme procura. Materiais biológicos naturais como ácidos nucleicos13, proteínas12, peptídeos14,15 e produtos naturais de pequenas moléculas16,17 devido aos seus benefícios inerentes (por exemplo, biocompatibilidade, não toxicidade) atraíram um interesse de pesquisa significativo para aplicações médicas. Especialmente nos últimos anos, pequenas moléculas naturais terpenóides (NSMs) bioativas anticancerígenas que possuem uma função de automontagem foram descobertas sucessivamente . Por exemplo, o ácido betulínico (BA), o ergosterol (ET) e o ácido abiético (AA) podem se automontar em partículas micron ou nanoestruturadas. Esses NSMs são blocos de construção atraentes para o desenvolvimento de agentes antitumorais para quimioterapia sinérgica e TFD. Foi comprovado que eles exibem benefícios significativos de fácil nanofabricação, melhor biocompatibilidade e biodegradabilidade, menor toxicidade com redução de lesão hepática e alto sinergismo na terapia antitumoral20e23. Isto fornece alternativas promissoras para o desenvolvimento de nanoimunoestimulantes traduzíveis clinicamente disponíveis para imunoterapia sinérgica. No entanto, a lipofilicidade geralmente mais forte destes NSMs levou à endocitose celular ineficiente, o que enfraqueceu a sua atividade anticancerígena e limitou o seu valor clínico para o tratamento do cancro . Semelhante aos nanocompósitos comumente relatados, as nanoformulações correspondentes de NSMs promoveram a captação celular para aumentar os efeitos quimioterápicos, mas também aumentaram inadvertidamente o risco de citotoxicidade inespecífica para células normais . Portanto, vale a pena pensar profundamente em como maximizar a eficácia anticancerígena dos nanoagentes terpenóides NSM e, ao mesmo tempo, minimizar sua toxicidade para o tecido normal, como uma questão crucial no processo de imunoterapia sinérgica.

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Estratégias pró-fármacos têm sido extensivamente aplicadas para melhorar a absorção celular de pequenas moléculas lipofílicas, aumentando a hidrofilicidade25. Geralmente, os fármacos anfifílicos possuem particularmente maior eficiência de captação celular do que os fármacos hidrofílicos ou lipofílicos26. Quanto maior a fagocitose celular, melhor a eficácia terapêutica24. Assim, o desenvolvimento de moléculas pró-drogas de NSMs terpenóides anfifílicos pode ser um método potencial para maximizar seus efeitos terapêuticos. Além disso, nanodrogas responsivas a estímulos para o microambiente tumoral específico (por exemplo, resposta ácida e redox) são uma grande promessa para controlar a liberação de drogas, o que é vantajoso na supressão da citotoxicidade das drogas quimioterápicas27,28. Enquanto isso, a comontagem supramolecular (por exemplo, uma abordagem de reprecipitação) foi uma estratégia eficaz para preparar nanodrogas livres de transportadores altamente solúveis em água, o que poderia diminuir ligeiramente a eficiência da fagocitose de NSMs anfifílicos até certo ponto, atenuando assim sua pré- citotoxicidade projetada. Nossa hipótese é que nanodrogas totalmente hidrofílicas e responsivas a estímulos foram estabelecidas com base no pró-fármaco de NSMs anfifílicos e podem efetivamente suprimir sua citotoxicidade inespecífica para células normais enquanto estimulam a liberação de NSMs anfifílicos altamente tóxicos em células tumorais facilitando sua dormência em tecidos normais e ativação no local do tumor. É importante selecionar o precursor solúvel em água e responsivo a estímulos apropriado para modificar NSMs terpenóides para preparar moléculas pró-droga anfifílicas. Durante anos, os oligossacarídeos de quitosana (COS), como produtos degradados da quitosana, não apenas apresentam boa solubilidade em água e abundantes grupos eOH ou NH2 que levam a uma boa resposta de pH, mas também possuem atividades antitumorais benéficas, melhorando a função imunológica do hospedeiro através da regulação da atividade. de células imunes, como monócitos, macrófagos e linfócitos30,31. Estes garantem a enorme possibilidade de construção de nanoimunoestimulantes alvo responsivos a estímulos para imunoterapia sinérgica.

Aqui, com base nas considerações acima, em nosso projeto experimental, um NSM triterpênico pentacíclico de ácido betulínico (BA) é usado como um potente agente anticâncer, o COS foi introduzido para sintetizar uma molécula anfifílica de COS-BA para melhorar o efeito quimioterápico. Cloro e6 (Ce6), um fotossensibilizador amplamente utilizado com toxicidade escura muito baixa / nenhuma, foi empregado para construir um pró-fármaco fotossensível COS-BA / Ce6 completamente solúvel em água, livre de transportador, usando uma estratégia de co-montagem direta. Os NPs COS-BA/Ce6 combinaram duas modalidades terapêuticas, quimioterapia e terapia fotodinâmica (PDT), que podem efetivamente aumentar a apresentação de antígenos derivados de tumor às células T, gerando respostas imunológicas robustas com o auxílio de um adjuvante imunológico anti-PD-L1 para causar quimioterapia/PDT/imunoterapia antitumoral altamente eficiente e sinérgica (Esquema 1). Os NPs COS-BA / Ce6 projetados mostraram uma função de dormência inteligente com efeitos insidiosos de quimioterapia, ou seja, NPs co-montados não irradiados mostraram citotoxicidade in vitro notavelmente inibida em comparação com COS-BA anfifílico, seja contra células cancerígenas ou normais. Atribuindo ao comportamento distinto de resposta ao pH, apresenta baixa toxicidade e biossegurança para o tecido normal in vivo, mas é altamente tóxico para o tecido tumoral devido à liberação estimulante de COS-BA hiperativo no microambiente tumoral fracamente ácido . Até onde sabemos, atualmente, os nanofármacos projetados que abrigam essa função de dormência quimioterápica ainda são raramente relatados. Enquanto isso, a nanodroga tem múltiplas características terapêuticas favoráveis, como melhor geração de 1 O2, reduzindo a lacuna de energia (DEST) de Ce6, rápido metabolismo biológico e maior acúmulo de tumor, o que levou a uma combinação antitumoral eficiente e segura de quimioterapia e tratamento PDT. Mais importante ainda, tanto a quimioterapia baseada em NP quanto os sistemas de quimioterapia / PDT poderiam efetivamente ativar a imunidade antitumoral, facilitando a proliferação de células T CD8+ produtoras de TNF-a e IFN-g em tumores primários ou distantes. Nossa proposta de nanofármaco fotoquimioterápico biodegradável, biocompatível, exclusivamente dormente, biosseguro e altamente eficiente alcança respostas imunoterapêuticas sistêmicas significativas, abrindo possibilidades atraentes para aplicação clínica no tratamento de terapia de câncer distante ou metastático.

Esquema 1 PDT e quimioterapia de NPs COS-BA/Ce6 co-montados potencializaram o anti-PD-L1 para induzir uma imunoterapia antitumoral sistêmica. A introdução de COS solúvel em água pode efetivamente aumentar a atividade quimioterápica de BA (representada como uma meia espada), resultando em um pró-fármaco anfifílico COS-BA hiperativo (espada longa). Quando co-montados com o fotossensibilizador Ce6 (bainha), os nanoconjuntos estruturados em concha e sensíveis ao pH tinham uma função de "dormência" inteligente e distinta com toxicidade quimioterápica inibida para tecidos normais. Mas, uma vez que chegou e foi estimulado pelo microambiente tumoral ácido (H+), o pró-fármaco anfifílico altamente ativo COS-BA será liberado, resultando em quimioterapia significativa. Além disso, os co-conjuntos construídos exibiram excelente atividade de PDT com geração aprimorada de oxigênio singleto (1O2) induzida pela redução do intervalo de energia entre os estados excitados singleto e tripleto (DEST) de Ce6. Combinado com um bloqueio de checkpoint anti-PD-L1, a liberação de antígenos associados a tumores após tratamento de quimioterapia/PDT pode efetivamente ativar uma resposta imune antitumoral sistêmica para imunoterapia contra câncer distante.

2. Materiais e métodos

2.1. Síntese de COS-BA

Ácido betulínico (40 mg, 0,1 mmol), EDC (38 mg, 0,2 mmol) e NHS (17 mg, 0,15 mmol ) foram dissolvidos em 3 mL de N,N-dimetilformamida (DMF). Após agitação à temperatura ambiente durante 30 min, 96 mg de solução aquosa de COS (1 mL) foram adicionados suavemente, gota a gota, à mistura e agitada durante 24 h. Em seguida, a mistura reacional foi diluída com CH2Cl2 e extraída repetidamente. A camada de CH2Cl2 foi evaporada e purificada numa coluna de sílica gel. O BA que não reagiu foi removido inicialmente usando éter de petróleo: acetona (5:1, v/v) como eluente e depois alterado para 3:1 para produzir COS-BA branco (rendimento: 42%), onde COS foi identificado como dímero ( n Z 2). 1 H RMN (40{{70}} MHz, CDCl3) d: 8,98 (1H, s, BA-28 O] CeNH), 4,73 (1H, s, H -29a), 4,60 (1H, s, H-29b), 3,18 (1H, dd, JZ 4,8, 10,8 Hz, H-3), 2,95e3,93 (8H, m, COS), 2,64 (3H, s, CH3eCOS), 0,76 (3H, s, H-24), 0,83 (3H, s, H-25), 0,90 (3H, s, H{ {69}}), 0,97 (3H, s, H-26), 0,98 (3H, s, H-27), 1,70 (3H, s, H-30). 13C RMN (100 MHz, CDCl3) d: 179,18 (CO, COS), 156,43 (C- 28), 150,97 (C-20), 109,03 (C-29), 78,74, 77,04 , 69,32, 69,22, 65,25, 58,14, 55,62, 55,21, 53,65, 53,22, 50,52, 45,96, 44,32,44,11, 41,85, 40,59, 38,68, 38,55, 37,32, 37. 04, 36,39, 35,31, 34,21, 31,81, 31,54, 31,17, 30,28 , 29,09, 27,80, 27,22, 25,74, 25,53, 20,91, 19,48, 18,12, 16,02, 15,87, 15,17, 14,65, 14,62. ESIeMS m/z: 814,5871 [M‒6H] (C44H72N2O12).

2.2. Preparação de NPs COS-BA/Ce6

NPs COS-BA/Ce6 co-montados foram preparados pelo método de reprecipitação em uma etapa. Normalmente, 5 mL de Ce6 (33 mmol/L) e 40 mL de soluções de COS-BA (33 mmol/L) DMSO foram primeiro misturados. Posteriormente, a mistura foi injetada rapidamente em 1 mL de água contendo 10 mL de NaOH (50 mmol/L) sob ultrassonicação (KQ-250E, ShuMei, Kunshan, China). Após sonicação por 10 min, os NPs COS-BA/Ce6 foram obtidos por centrifugação a 13,000 rpm (TGL-16G, Xiangyi, Changsha, China) por 25 min. Outras formulações com diferentes proporções de COS-BA para Ce6 foram preparadas pelo mesmo procedimento com uma razão molar constante de NaOH para Ce6 de 3:1.

2.3. Linhas de celular

As linhas celulares humanas MCF-7, HepG2, LO2 e 4T1, L929 de camundongo são fornecidas pelo Instituto de Bioquímica e Biologia Celular, SIBS, CAS (China). MCF-7, HepG2 e LO2 foram cultivados em meio DMEM com 10% de soro fetal bovino (FBS, Gibco) e 1% de antibiótico penicilina-estreptomicina (Life Technology, EUA) a 37°C. 4T1 e L929 foram cultivados em Meio RMPI-1640 com a mesma proporção acima.

2.4. Estudos de captação celular e vias endocíticas

Para investigação da captação celular, células 4T1 ou LO2 foram incubadas com NPs Ce6 ou COS-BA/Ce6 livres (concentração equivalente de Ce6: 1,7 mg/mL, COS-BA: 19,5 mg/mL, BA: 10 0,8 mg/mL) por vários tempos. Após lavagem, fixação e coloração DIPA (#D9542, Sigma), as células foram fotografadas sob um microscópio invertido fluorescente (FIM) (DSY-2000X, UP Optotech, Changchun, China). A intensidade de fluorescência foi determinada por citometria de fluxo utilizando o mini sistema Guava EasyCyte (Merck Millipore, Alemanha). Para quantificação da eficiência de captação, o acúmulo celular de BA e COS-BA foi medido utilizando HPLC (Agilent 1200, EUA). Normalmente, as células 4T1 foram tratadas com COS-BA ou BA livre (BA equivalente: 25 mg/mL) por 0,5 e 3 h. Após lavagem com PBS, os pellets celulares foram colhidos e submetidos à homogeneização ultrassônica (JY92-IIN, Scientz Biotechnology, Ningbo, China) para lise celular. Em seguida, COS-BA ou BA foi extraído por clorofórmio para análise por HPLC após liofilização das amostras. A fase móvel foi água (0,2% de ácido fosfórico) e acetonitrila a uma vazão de 1,0 mL/min, e as proporções de volume correspondentes foram 60:40 e 15:85 (v/v) para análise de COS-BA e BA, respectivamente . O comprimento de onda de detecção foi de 213 nm. Para investigação das vias endocíticas de NPs COS-BA/Ce6, as células 4T1 foram semeadas em placas de 6-poços e incubadas por 24 h antes de serem pré-tratadas com vários inibidores de endocitose por 30 min, incluindo um inibidor de micropinocitose [50 mmol/L , amiloreto de etil isopropila (EIPA) (#N132356, Aladdin)], um inibidor de endocitose mediado por clatrina [20 mmol / L, clorpromazina (#C7010, Solarbio)], um inibidor de endocitose mediado por caveolas [25 mmol / L, nistatina ( #IN0260, Solarbio)], e um inibidor da acidificação do lisossoma [50 mmol/L, fosfato de cloroquina (#C9720, Solarbio)]35. Em seguida, as células foram ainda cultivadas com 2 mL de NPs COS-BA/Ce6 (Ce6: 1,7 mg/mL, COS-BA: 19,5 mg/mL) por 2 h e fotografadas sob FIM (UP Optotech). As células incubadas sem inibidor endocítico a 37°C foram definidas como controle e em incubação em baixa temperatura (4°C) para avaliação da endocitose dependente de energia. Entretanto, a intensidade média de fluorescência das células também foi determinada por citometria de fluxo.

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2.5. Ensaio de citotoxicidade

Células 4T1 foram semeadas em uma placa de 96-poços. Em seguida, as células foram tratadas com várias concentrações de NPs COS-BA durante 24 h. Posteriormente, 10 mL de corante MTT (#M158055, Aladdin) (5 mg/mL) foi adicionado ao poço e incubado por mais 4 h, e então 150 mL de DMSO foram adicionados para dissolver os cristais de formazan . A absorvância de cada poço a 492 nm foi registada por um leitor de microplacas. Para o grupo de irradiação, as células foram tratadas com drogas por 4 h, depois irradiadas por 10 min com luz 675  10 nm e incubadas por mais 20 h. A citotoxicidade de NPs COS-BA/Ce6 (1 mg/mL de Ce6 corresponde a 11,5 mg/mL COS-BA e 6,4 mg/mL BA) contra outras células (MCF-7, HepG2, LO2 e L929) também foram determinados pelo mesmo ensaio MTT apenas com um meio diferente. Enquanto isso, o índice de combinação foi calculado pelo software CompuSyn 2.0 usando o cálculo do teorema de Chou Talalay36.

2.6. Modelos animais

Todos os procedimentos experimentais foram executados de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Harbin Medical University. Células 4T1 foram suspensas em meio RMPI-1640 e injetadas subcutaneamente no dorso direito de cada camundongo BALB/c fêmea (18e22 g, 6e7 semanas de idade).

2.7. Imagem de fluorescência in/ex vivo

Uma solução de glicose a 5% de COS-BA/Ce6 NPs de 200 mL (equivalente a Ce6: 0,35 mg/mL, COS-BA: 4,02 mg/mL) foi injetada através da veia da cauda em camundongos portadores de tumor. Depois disso, a imagem de fluorescência dos locais do tumor em um tempo predeterminado foi realizada usando um sistema de imagem animal in vivo multimodelo AniView 100/600 (Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., China) com excitação a 630 nm. Após 24 horas após a injeção, os principais órgãos (coração, fígado, baço, pulmão e rim) e tumor foram coletados para imagens de fluorescência ex vivo. Além disso, também foram avaliadas as imagens de fluorescência ex vivo de tumores e órgãos principais em diferentes momentos após injeções iv de NPs Ce6 ou COS-BA/Ce6.

2.8. Quimioterapia/PDT in vivo

Camundongos portadores de 4T1-(75e100 mm3) são divididos aleatoriamente em seis grupos (n Z 5): 1) solução de glicose a 5%; 2) Ce6; 3) Ce6 com irradiação; 4) COS-BA (40,2 mg/kg, onde BA: 22,3 mg/kg); 5) NPs COS-BA/Ce6; 6) NPs COS-BA/Ce6 com irradiação. Para cada grupo, os camundongos são injetados com 200 mL de NPs COS-BA/Ce6 (equivalente a Ce6: 3,5 mg/kg do corpo) através da veia da cauda nos dias 0, 2 e 4. Para os grupos de irradiação, às 4 h pós-injecção, após cada administração, todos os ratinhos foram anestesiados com isoflurano e os locais do tumor foram irradiados com luz 675  10 nm (150 mW/cm2) durante 15 min. Os volumes dos tumores e os pesos corporais dos ratos também são registados em dias alternados. Os volumes tumorais são calculados pela fórmula: largura VZ2 comprimento/2. Após 14 dias de tratamento, os tumores foram excisados ​​e pesados ​​para calcular a razão de inibição tumoral (TIR) ​​pela equação comumente utilizada: TIRZ (1 amostra/controle) 100%. Onde amostra e controle foram o peso médio do tumor de cada grupo tratado e grupo de solução aquosa de glicose a 5%, respectivamente.

2.9. Quimioterapia/PDT/imunoterapia in vivo

Para demonstrar o potencial dos NPs COS-BA/Ce6 combinados com imunoterapia, o modelo tumoral bilateral foi desenhado através de injeção subcutânea de células 4T1 nos flancos esquerdo e direito. Quando os tumores se aproximaram de 75e100 mm3, os camundongos foram divididos em cinco grupos. (1) Controle; (2) NPs COS-BA/Ce6 (COS-BA Z 40,2 mg/kg, onde BA Z 22,3 mg/kg); (3) NPs COS-BA/Ce6 + luz; (4) NPs COS-BA/Ce6 + anti-PDL1; (5) NPs COS-BA/Ce6 + anti-PD-L1 + luz. No Dia 0, 200 mL de solução de glicose a 5% (Grupo 1) ou NPs COS-BA/Ce6 (Ce6 Z 3,5 mg/kg) (Grupo 2, 3, 4, 5) foram injetados iv em camundongos. Após 4 horas após a injeção, os tumores direitos dos Grupos 3 e 4 foram irradiados durante 15 minutos. Os ratos foram anestesiados com isoflurano e rolados de lado para evitar a exposição dos tumores esquerdos. Em seguida, o anticorpo anti-PD-L1 (BioXcell, número do produto: BE0101, número do clone: ​​10F.9G2) foi injetado iv em camundongos para os Grupos 4 e 5 nos Dias 2, 4 e 6 (15 mg por camundongo por injeção). O comprimento e a largura de cada tumor foram monitorados em dias alternados. Após 14 dias de tratamento, o soro sanguíneo de camundongos foi coletado para avaliar interferon-gama (IFN-g) (#KMC4021) e fator de necrose tumoral (TNF-a) (#BMS607-3) usando ensaio ELISA (eBioscience ). Os tumores foram recolhidos, dissociados, tratados com tampão de lise de glóbulos vermelhos e lavados com PBS por centrifugação. Em seguida, a suspensão celular foi corada com anti-CD3-FITC (#MA1-10187, clone 145-2C11, eBioscience) e anti-CD8a-PE (#12-0081-85, clone 53-6.7, eBioscience). Posteriormente, a infiltração de linfócitos T citotóxicos (CTL) nos tumores direito e esquerdo após diferentes tratamentos foi avaliada por citometria de fluxo.

3 Resultados e discussão

3.1. Síntese, fabricação e caracterização de NPs COS-BA/Ce6

Neste estudo, projetamos uma nova molécula pequena pró-droga COS-BA baseada em oligossacarídeo de quitosana solúvel em água (COS), que pode elevar a atividade quimioterápica do ácido triterpênico betulínico pentacíclico (BA), melhorando a absorção celular através do aumento da hidrofilicidade. O COS (grau de polimerização, DP: 2e6) empregado aqui foi preparado pelo nosso método descrito anteriormente30. Em seguida, o COS-BA foi sintetizado através de uma reação de condensação e desidratação. Combinado com a análise de componentes principais do COS, a estrutura química do COS-BA foi considerada um BA modificado por dissacarídeo (DP: 2) (Informações de Apoio Fig. S1), que foi confirmado por 1 H NMR, 13C NMR e ESIeMS (Informações de apoio Figs. S2eS4). A análise do 1 H NMR representativo mostrou o sinal de próton distinto de COS em torno de 2,64e3,93 ppm e picos de C]CH2 (4,60, 4,73 ppm) de BA, demonstrando a síntese bem sucedida de COS-BA (Fig. 1A). Para a preparação dos NPs do reagente antitumoral sinérgico COS-BA / Ce6, uma abordagem versátil de re-precipitação foi empregada cooperando com um fotossensibilizador Ce6 altamente eficiente. Ao alterar as razões molares iniciais, ambas as formulações de co-montagem COS-BA / Ce6 poderiam formar nanoestruturas esféricas com tamanhos modulados (Fig. 1B e Informações de Apoio Fig. S5). Através de diferentes proporções de entrada de COS-BA/Ce6, os diâmetros hidrofílicos dos NPs COS-BA/Ce6 estavam próximos de 200e300 nm com um potencial z negativo. Considerando que as NPs preparadas na formulação 8:1 apresentaram menor índice de polidispersidade (PDI, 0,143) com tamanho relativamente menor (249 nm), também foi necessária quantidade suficiente do agente quimioterápico COS-BA para o tratamento combinatório. Portanto, escolhemos as formulações de COS-BA/Ce6 (8:1) para o estudo a seguir. Sob esta otimização, os NPs COS-BA / Ce6 exibiram distribuições de tamanho estreitas (Fig. 1C) e boa solubilidade em água, indicando sua natureza coloidal (Fig. 1D). Para explorar as razões por trás desta co-montagem bem-sucedida, o comportamento primário de automontagem do COS-BA livre foi investigado usando microscopia eletrônica de varredura (SEM) (Fig. 1E), o que sugeriu que o COS-BA poderia formar um nano- esfera de w168 nm, implicando que a modificação química do COS não altera a capacidade de automontagem do próprio BA (Informações de Apoio Fig. S6). É essa propriedade que eventualmente induz o sucesso da construção dos co-conjuntos. Notavelmente, além da nanoestrutura sólida confirmada por microscopia eletrônica de transmissão (TEM), os NPs COS-BA / Ce6 mostraram uma estrutura de casca distinta, livre de NPs COS-BA, e a espessura média da casca foi de aproximadamente 2,35 nm. A outra caracterização físico-química está resumida na Figura 1F. Além disso, os NPs COS-BA/Ce6 apresentaram potencial z negativo de 5,38 mV e tamanho hidrodinâmico de w249 nm, superior ao obtido em MEV (w182 nm). Simultaneamente, as eficiências de carregamento e encapsulamento de Ce6 foram de 8,1 e 96%, respectivamente, conforme determinado por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Além disso, os dados de FT-IR (Fig. 1G) confirmaram ainda mais esta co-montagem porque os NPs COS-BA/Ce6 exibiram os picos característicos C]N, CeN e C]CH de Ce6 aparecendo em 1633, 1078 e 633 cm 1 , respectivamente.

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3.2. Mecanismo co-montado e a formação da estrutura da casca

Posteriormente, para melhor compreender o mecanismo de co-montagem, investigamos primeiro o processo de formação primária de NPs. Descobrimos que a co-montagem de COS-BA com Ce6 pode ser espontânea porque essas duas espécies também poderiam formar nanoestrutura esférica mesmo sem sonicação (Informações de Apoio Fig. S7), o que pode ser devido à mudança negativa de energia livre de Gibbs (DG ) em co-assembléias37. Esta montagem espontânea também sugeriu uma interação intermolecular mais forte entre COS-BA e Ce6. Geralmente, as interações intermoleculares em auto (ou co-) montagens supramoleculares são empilhamento p‒p não covalente, ligações de hidrogênio e forças de van der Waals 38,39. Para esta análise, investigamos então a absorção UV de NPs COS-BA / Ce6 (Fig. 1H e F), que sugeriu bandas Soret (41 0 nm) e Qy (667 nm) com desvio para o vermelho em comparação com Ce6 livre (405 e 665 nm, respectivamente). Enquanto isso, a significativa absorção característica de COS-BA com desvio para o vermelho também pode ser encontrada, indicando um possível empilhamento intermolecular de pp entre COS-BA e Ce640. Além disso, após a incubação com o surfactante dodecilsulfato de sódio (SDS, 0,2% p / v) (Informações de Apoio Fig. S8), os NPs COS-BA / Ce6 mostraram uma banda Qy recentemente deslocada para o azul em 641 nm e recuperaram dramaticamente a fluorescência, demonstrando que as interações hidrofóbicas também contribuíram para a comontagem28. Uma vez que estas interações associativas não covalentes, as co-montagens mostraram notável extinção de fluorescência (98,2%) em água (Fig. 1I). Coletivamente, é razoável acreditar que o empilhamento de p‒p e as interações hidrofóbicas podem ser as principais forças motrizes para a construção de co-montagens. Posteriormente, para visualizar melhor o processo de montagem de forma mais intuitiva e revelar as razões subjacentes pelas quais NPs estruturados em concha podem se formar, realizamos um modelo de simulação de dinâmica molecular (MD) simplificado contendo 16 moléculas COS-BA otimizadas e mais duas Ce6 em uma caixa d'água . Inicialmente, avaliamos a possível interação/ligação de automontagens COS-BA dentro de 5 ns do tempo de simulação (Fig. 2A e Informações de Apoio Fig. S9). Descobrimos que, exceto por numerosas ligações de hidrogênio intramoleculares na fração COS, vários pares de ligações H intermoleculares entre COS-BA também poderiam ser observados (Fig. 2B e Informações de Apoio Fig. S10), o que indicou que a ligação de hidrogênio pode ser uma dos principais impulsionadores da formação dos NPs do COS-BA. Particularmente interessante, nas automontagens de COS-BA, todas as moléculas de COS-BA formam uma estrutura aparentemente simétrica (Fig. 2C). Este fenômeno fascinante nos motivou a explorar a possível relação entre esta propriedade e a formação de NPs COSBA estruturados em concha. Em seguida, tentamos expandir as unidades da caixa. Surpreendentemente, as caixas conectadas consistindo de moléculas COS-BA foram dispostas de maneira regular, resultando em estruturas de rede ocas "ortogonais" (Informações de Apoio Fig. S11). Mais importante ainda, calculamos aleatoriamente a espessura das moléculas da casca e descobrimos que eram consistentes com o TEM (w2,35 nm) (Fig. 2D). Esta tendência de formar estruturas de rede ocas pode ser responsável pela formação de NPs estruturados em concha. Para testar esta ideia, a estrutura MD dos co-montagens COS-BA / Ce6 foi simulada (Fig. 2E e Informações de Apoio Fig. S12). Semelhante às automontagens COS-BA, um grande número de ligações H intramoleculares e intermoleculares também foram encontradas nas co-montagens (Fig. 2F e Informações de Apoio Fig. S13). Além disso, o possível empilhamento pp entre C] C de COS-BA e o anel aromático de Ce6 foi observado nas co-montagens (Fig. 2G), o que é consistente com os dados de investigações anteriores de UV. Depois de estender o número de caixas, estruturas de rede ocas semelhantes ainda podem ser encontradas, apenas com regularidade e ortogonalidade reduzidas (Informações de Apoio Fig. S14). Esta pode ser a possível razão para a morfologia não uniforme dos NPs COS-BA/Ce6 em comparação com os NPs COSBA. Além disso, a distância molecular da camada invólucro também está próxima da espessura do invólucro (w2, 35 nm) dos NPs, como visto usando o TEM (Fig. 2H). Coletivamente, especulamos que a formação de NPs COS-BA / Ce6 estruturados em concha ou NPs COS-BA pode ser em grande parte atribuível a essa tendência das moléculas de se reunirem em estruturas de rede de casca oca.

Figura 1 Fabricação e caracterização de nanoconjuntos mediados por pró-fármacos de ácido betulínico modificado por oligossacarídeos de quitosana (COS-BA) COS-BA/Ce6 NPs. (A) As posições-chave amplificadas de 1 H NMR de COS-BA. (B) Preparação de NPs COS-BA/Ce6 co-montados com várias proporções COS-BA/Ce6. (C) Distribuição de tamanho de NPs COS-BA/Ce6 usando COS-BA e Ce6 (proporção molar, 8:1) como blocos de construção. (D) A solubilidade em água e o efeito Tyndall das co-montagens indicam uma natureza coloidal. (E) Imagens SEM e TEM de automontagens COS-BA gratuitas e NPs COS-BA/Ce6 co-montados. (F) Resumo das propriedades físico-químicas dos NPs COS-BA/Ce6. (G) espectros FT-IR, (H) espectros UV Vis e (I) espectros de emissão de fluorescência de Ce6 livre, COS-BA e NPs COS-BA/Ce6 co-montados em água.

Figura 2 Estruturas de (A) automontagens COS-BA e (E) NPs COS-BA/Ce6 co-montados após simulação de dinâmica molecular (MD) para 5 ns com uma razão molar de unidade estrutural de 8:1 (COS-BA /Ce6, calculado com base na eficiência de carregamento de Ce6). O modelo de linha foi usado para H2O e os modelos de bastão representam moléculas COS-BA ou Ce6, onde os átomos de C de Ce6 estão marcados em roxo. As informações da ligação de hidrogênio entre as moléculas COS-BA em (B) suas automontagens e (F) co-montagens COS-BA/Ce6 NPs. (C) A estrutura aparentemente simétrica do arranjo molecular COS-BA após simulação MD. (G) Possíveis interações moleculares entre COS-BA e Ce6 mostram potencial empilhamento de pp. A espessura indicada das moléculas de casca em uma estrutura de rede oca "ortogonal" após a extensão das caixas MD correspondentes de (D) automontagens COSBA livres e (H) comontagens COS-BA/Ce6 NPs.

3.3. Mecanismo de energia de geração aprimorada de 1 O2

Em seguida, examinamos ainda a geração de oxigênio singlete (1 O2), uma das espécies reativas de oxigênio (ROS) críticas do desempenho da PDT usando DPBF (1,3-difenilisobenzofurano) como sonda. Após irradiação sustentada das soluções mistas de NPs COS-BA / Ce6 com DPBF, a absorção UV de DPBF diminuiu de intensidade, indicando 1 geração de O2 (Fig. 3A). Após comparação com a referência do azul de metileno (MB), o F ( 1 O2) dos NPs COS-BA/Ce6 foi calculado como 0,26, ligeiramente superior ao Ce6 livre (FZ0,19) (Fig. 3B). Geralmente, a energia absorvida pelos fotossensibilizadores passará por três vias de relaxamento envolvendo fluorescência, efeito de aquecimento via relaxamento vibracional e geração de ROS através de cruzamento intersistema (ISC) . Consistente com a emissão de fluorescência significativamente extinta, os NPs COS-BA/Ce6 também não promoveram qualquer efeito de aquecimento na água (Informações de Apoio Fig. S15), o que implicou um processo ISC aprimorado após a co-montagem de Ce6 com COS-BA, levando assim à geração melhorada de 1 O2. Para elucidar ainda mais o mecanismo molecular de tal efeito, tentamos otimizar e calcular o possível modelo de molécula única de COS-BA/Ce6 consistindo em empilhamento potencial de pp obtido a partir de simulação MD pela teoria do funcional de densidade (DFT) (Fig. 3C) . Surpreendentemente, o COS-BA / Ce6 mostrou uma absorção observável de UV com desvio para o vermelho de 581,24 nm do que a do Ce6 livre (579,30 nm), indicando a ocorrência de empilhamento pp (Fig. 3D). Embora a geometria de energia minimizada de COS-BA/Ce6 mostrasse pequenas diferenças estruturais com a configuração MD inserida, o pstacking distinto entre as ligações C] C ou C] O de COS-BA com o anel porfino de Ce6 ainda era observável, validando ainda mais que o acima do empilhamento p‒p é possível. Enquanto isso, foi recentemente demonstrado que o aumento da eficiência da doação de elétrons pelo empilhamento p‒p poderia facilitar o processo ISC , enquanto a taxa ISC (KISC) é proporcional a (1/DEST) 2,43. Ou seja, o menor gap de energia (DEST) do fotossensibilizador melhorará o processo ISC, promovendo a geração eficiente de ROS. Posteriormente, calculamos o estado singleto mais baixo excitado (S1) e o estado tripleto (T1) de Ce6 e COS-BA / Ce6 (Fig. 3E), respectivamente. Os resultados indicaram que o COS-BA/Ce6 apresentou uma diminuição do DEST de 1,1892 eV em comparação com o Ce6 livre (1,2001 eV), confirmando o processo ISC melhorado. A redução do DEST é útil para a produção de 1 O2, o que também foi verificado em outros nanofotossensibilizadores44. Tomados em conjunto, o empilhamento p parece reduzir o DEST de Ce6 após a co-montagem com COS-BA, levando assim a uma melhor geração de 1 O2.

Figura 3 Mecanismo energético de geração melhorada de 1 O2 induzida por NPs COS-BA/Ce6. (A) Espectros UV Vis de fotodecomposição de 1,3-difenilisobenzofurano (DPBF) após irradiação prolongada de NPs COS-BA/Ce6. (B) Nos gráficos de primeira ordem das alterações de absorção de UV DPBF (DOD), o rendimento de 1 O2 foi avaliado usando azul de metileno (MB) (FZ 0.52) em DMSO como composto de referência. (C) Estruturas minimizadas em energia de um possível modelo COS-BA/Ce6 de molécula única visto de lado e de frente, que foi obtido de acordo com a configuração molecular inicial entre Ce6 com COS-BA após simulação MD e após cálculos DFT. (D) Transições previstas de espectros de absorção UV Vis (barras verticais) de Ce6 livre e um modelo COS-BA/Ce6 otimizado. (E) Níveis de energia calculados de seu estado singleto excitado mais baixo (S1) e estado tripleto mais baixo (T1), respectivamente, [Gaussian 09/B3LYP/6-31G (d, p)]. Onde o DEST foi calculado como ES1 ET1.

3.4. Características de dormência da quimioterapia

Posteriormente, para validar o conceito de design no presente estudo de que o desenvolvimento da molécula anfifílica COS-BA poderia efetivamente aumentar o efeito terapêutico da BA, melhorando a captação celular através do aumento da hidrofilicidade e, enquanto isso, construindo ainda mais COS-BA/Ce6 responsivo a estímulos e totalmente hidrofílico As NPs facilitaram sua dormência em tecidos normais e ativação em locais tumorais. Para testar esta hipótese, primeiro investigamos o comportamento de liberação de drogas de NPs COS-BA/Ce6 em várias soluções tampão (Fig. 4A). Os resultados indicaram que as NPs COS-BA/Ce6 apresentaram um comportamento responsivo ao pH com uma liberação cumulativa de Ce6 de 88% em pH 5,6 e 57% em pH 7,4 após 24 h, respectivamente. Esta característica provavelmente surgiu da destruição de numerosas ligações de hidrogênio que existiam nas NPs COS-BA / Ce6 após a introdução do H+45 ácido, levando assim ao aumento da liberação de Ce6 (Fig. 4B). Isto foi ainda confirmado pela desmontagem de NPs COS-BA / Ce6 após incubação direta em ambientes ácidos (Fig. 4C). Esta característica responsiva ao pH pode ser benéfica para uma terapia antitumoral eficaz devido ao microambiente tumoral fracamente ácido34. Enquanto isso, os NPs COS-BA/Ce6 tiveram melhor estabilidade porque nenhum tamanho significativo ou alterações de PDI puderam ser observadas após a incubação em PBS e meio de cultura de células 1640-RMPI por 10 dias (Informações de Apoio Fig. S16), o que seria importante para seu uso potencial em outras aplicações biomédicas. Posteriormente, investigações adicionais foram conduzidas avaliando a citotoxicidade de BA lipofílico livre (ângulo de contato q: 133,3) e COS-BA anfifílico (q: 52) (Fig. 4D) por ensaios padrão de brometo de metil tiazolil-difenil tetrazólio (MTT). Como previsto, quer para células cancerígenas 4T1 quer para hepatócitos LO2 normais, o COS individual não tem essencialmente actividade anticancerígena em doses relativamente baixas. Isto pode ser devido aos efeitos antiproliferação do COS sendo ativados através da indução da via de sinalização do NF-kB apenas em altas concentrações (aproximadamente no nível de miligramas)30. Considerando que, COS-BA realiza citotoxicidade notavelmente melhorada com valores de IC50 extremamente baixos (6,03 mg/mL para 4T1 e 9,92 mg/mL para LO2) em comparação com aqueles de BA (17,63 mg/mL para 4T1 e 20,53 mg/mL para LO2), mesmo nas mesmas concentrações de massa (Fig. 4E e J). Os resultados obtidos implicaram que a modificação do COS solúvel em água aumenta grandemente a eficiência de absorção celular do BA lipofílico, conduzindo assim à forte actividade anticancerígena do COS-BA. Para quantificar a eficiência de absorção, a acumulação de BA ou COS-BA dentro das células 4T1 foi determinada diretamente por HPLC (Supporting Information Fig. S17). Os resultados apoiaram claramente que o COS-BA anfifílico exibe uma absorção significativamente maior do que o BA livre (aproximadamente 36- vezes após 3 h de incubação), demonstrando a atividade quimioterápica aprimorada do COS-BA. A conclusão acima foi ainda apoiada pela citotoxicidade significativamente melhorada do COSBA anfifílico contra células cancerígenas HepG2 e MCF -7 (Informações de Apoio Fig. S18), que são bem consistentes com o conceito de design. Após a co-montagem com Ce6, descobrimos que NPs COS-BA/Ce6 sem irradiação exibem citotoxicidade notavelmente inibida contra células cancerígenas 4T1 em comparação com o COS-BA equivalente, especialmente a 11,5 mg/mL, mas a atividade básica da PDT não foi afetada ( Figura 4F). Para validar este fenômeno de forma mais completa, investigamos ainda a citotoxicidade in vitro de NPs COS-BA/Ce6 contra outras células cancerígenas, incluindo MCF-7 e HepG2. Curiosamente, o COS-BA anfifílico apresentou citotoxicidade muito mais forte contra células MCF -7 (Fig. 4G), mas a atividade quimioterápica diminuiu significativamente após a co-montagem com Ce6, isto é, NPs COS-BA / Ce6 não irradiados. Resultados semelhantes também foram observados em células HepG2 apenas com uma ligeira diminuição (Fig. 4H). Para apoiar ainda mais as conclusões acima, também avaliamos os efeitos quimioterápicos de nano-conjuntos e COS-BA contra células normais de fibroblastos L929 de camundongo e hepatócitos LO2 humanos (Fig. 4I). Os resultados indicaram que as NPs COS-BA/Ce6 montadas reduziram significativamente o medicamento anfifílico original altamente tóxico COS-BA, mostrando excelente biocompatibilidade. Ao analisar a citotoxicidade, os valores de IC50 do COS-BA anfifílico foram significativamente inferiores aos dos NPs COS-BA / Ce6 co-montados, independentemente do cancro ou das células normais (Fig. 4J). Ou seja, a construção de nano comontagens completamente hidrofílicas e responsivas a estímulos pode efetivamente suprimir antecipadamente a alta citotoxicidade do medicamento anfifílico COS-BA. Considerando a característica distintiva de resposta ao pH, parece que os NPs COS-BA/Ce6 estarão inativos em tecidos normais com baixa toxicidade quimioterápica desejada, mas ativos em tecidos tumorais devido à sua liberação estimulante de COS-BA altamente tóxico no tumor fracamente ácido microambiente. Tomados em conjunto, ao contrário da neofuncionalização amplamente relatada de reagentes quimioterápicos que aumentaram a atividade anticancerígena , os nanoconjuntos anfifílicos mediados por COS-BA não apenas exibem uma característica de "dormência" inteligente com efeitos insidiosos de quimioterapia, mas também retêm atividade especializada de PDT, mostrando enorme potencial para terapia antitumoral inteligente.

Figura 4 (A) Perfis de liberação de Ce6 in vitro de NPs COS-BA/Ce6 em PBS (pH 7,4, 6,5 ou 5,6) contendo Tween 80 (0,5%, v/v) em 37 C. (B) O possível mecanismo responsivo ao pH que H+ desencadeia a desmontagem de NPs. (C) A desmontagem de NPs COS-BA/Ce6 após incubação direta em aproximadamente pH 4.0 água. (D) O ângulo de contato dos NPs BA, Ce6, COS-BA e COS-BA/Ce6 livres, respectivamente. (E) Citotoxicidade celular de BA livre, COS e COS-BA anfifílico contra câncer representativo 4T1 e células LO2 normais. Viabilidade celular de células cancerígenas (F) 4T1, (G) MCF-7, (H) HepG2 após serem incubadas com NPs COS-BA, COS-BA/Ce6 livres com/sem irradiação na concentração equivalente de COS-BA indicada por 24 horas. (I) Citotoxicidade celular de COS-BA livre, NPs COS-BA/Ce6 não irradiados contra células LO2 e L929 normais. (J) A análise IC50 do COS-BA contra câncer e células normais. Os dados são expressos como médias SD (n Z 6). *P ˂ 0.05, **P ˂ 0,01 e ***P ˂ 0,001 mostram as diferenças significativas.

Para explorar as possíveis razões por trás desta característica de dormência da quimioterapia, o comportamento de captação celular dependente do tempo dos NPs COS-BA/Ce6 foi avaliado sucessivamente por incubação com células cancerígenas 4T1. Os resultados indicaram que, embora os NPs COS-BA / Ce6 apresentassem notável extinção de fluorescência, eles ainda apresentavam maior eficiência fagocítica em comparação com Ce6 livre devido à fluorescência vermelha citoplasmática mais forte, conforme determinado pela análise quantitativa de citometria de fluxo (Fig. 5A). Esta melhor internalização celular de NPs pode ser atribuída à endocitose21. Tomados em conjunto, especulamos que, embora co-conjuntos altamente solúveis em água COS-BA / Ce6 NPs (ângulo de contato q: 36,7) exibissem endocitose celular melhorada do que Ce6 lipofílico (q: 132,6, próximo a BA), a eficiência de fagocitose reduzida de Os NPs podem aparecer em comparação com a molécula anfifílica de COS-BA, parecendo assim suprimir a citotoxicidade quimioterápica dos NPs COS-BA/Ce6. Ou seja, a eficiência de captação celular de alta para baixa como sequência: COS-BA anfifílico, NPs COS-BA/Ce6 hidrofílicos, BA lipofílico ou Ce6. Mais importante ainda, a desmontagem inadequada das NPs celulares pode ser outra razão importante para o efeito quimioterápico enfraquecido, tudo o que pode estar relacionado com a dormência da quimioterapia inteligente das NPs COS-BA/Ce6. Além disso, como a desmontagem de NPs foi conduzida especificamente no ambiente ácido das células tumorais, para demonstrar a característica responsiva ao pH, tentamos ainda comparar os efeitos de captação de NPs COS-BA/Ce6 em células LO2 normais (Fig. 5B) . No entanto, os NPs COS-BA / Ce6 não exibiram fluorescência vermelha Ce6 significativamente inibida em células LO2. Em contraste, o comportamento de captação pelo LO2 foi semelhante ao das células cancerígenas 4T1, sugerindo que os NPs COS-BA/Ce6 também podem desmontar-se mesmo em células normais, o que pode resultar dos compartimentos intracelulares de pH fracamente ácido (endossomas/lisossomas) existentes no interior tanto câncer quanto células normais46. Como a captação celular de NPs depende do processo de endocitose, a incubação direta do medicamento pode não destacar a capacidade de resposta ao pH das NPs COS-BA/Ce6 no nível celular. No entanto, o microambiente tumoral (TME) é altamente ácido comparado aos tecidos normais47. Independentemente do câncer intracelular ou TME, os NPs COS-BA/Ce6 podem responder ao pH e ser desmontados para desencadear a liberação de COS-BA altamente tóxico. Considerando que, em tecidos normais, os NPs COS-BA/Ce6 só poderiam ser desmontados após entrarem em um ambiente celular normal, reduzindo a probabilidade de liberação de COSBA. Portanto, inferimos que a característica de dormência da quimioterapia dos NPs COS-BA / Ce6 para o microambiente tumoral é válida e confiável, e a ideia do desenho no presente estudo é viável.

3.5. Eficácia anticâncer da quimioterapia / PDT in vitro de NPs COS-BA / Ce6

Além disso, antes da eficácia anticancerígena detalhada da quimioterapia in vitro / PDT dos NPs COS-BA / Ce6 e para descobrir ainda mais o mecanismo de endocitose, estudamos as quatro principais vias de endocitose adicionando inibidores endocíticos correspondentes, incluindo clorpromazina (mediada por clatrina), fosfato de cloroquina ( inibidor de acidificação de lisossomos), nistatina (mediada por caveolae) e um inibidor de macropinocitose EIPA (etilisopropil amiloreto) (Fig. 5C e D). Observamos que a introdução de nistatina e clorpromazina poderia inibir mais eficientemente a eficiência fagocítica do que EIPA e fosfato de cloroquina, mostrando fluorescência celular significativamente diminuída em comparação com 37 C normal. Esses resultados indicaram que NPs COS-BA/Ce6 foram internalizados por múltiplos mecanismos, principalmente através de as vias de endocitose mediada por clatrina e cavéolas. Uma vez que o aumento da geração de O através de interações intermoleculares, os NPs COS-BA / Ce6 exibem um rendimento intercelular de ROS significativamente melhorado do que o de Ce6, como indicado pela fluorescência verde mais forte da sonda DCFH (Fig. 5E), implicando a maior eficiência fotodinâmica. Os ensaios MTT demonstram que os NPs COS-BA / Ce6 sob irradiação realizam um efeito de inibição notavelmente melhorado nas células 4T1 do que o Ce6 equivalente, embora com citotoxicidade relativamente moderada sem irradiação (Fig. 5F). Significativamente, o IC50 de Ce6 (0,53 mg/mL) em NPs COS-BA/Ce6 foi muito menor do que o Ce6 livre (1,39 mg/mL) (Fig. 5G), sugerindo uma eficácia notavelmente melhorada da PDT, que foi ainda perfeitamente demonstrado pela citotoxicidade de NPs COSBA/Ce6 contra células cancerígenas humanas MCF-7 e HepG2 (Supporting Information Fig. S19). Da mesma forma, em comparação com Ce6 livre, os valores relativamente mais baixos de IC25, IC50 e IC75 também foram observados em co-montagens (Fig. 5G). Enquanto isso, em comparação com Ce6 PDT sozinho e quimioterapia única de NPs no escuro, NPs COS-BA/Ce6 sob irradiação alcançaram quimioterapia/PDT combinada mais eficaz contra as três células cancerígenas acima, mostrando um sinergismo (índice de combinação: CI ˂ 1) ( Figura 5I). Além disso, a coloração dupla de fluorescência de células vivas/mortas usando éster calceína-acetoximetílico (calceína-AM) e iodeto de propídio (PI) confirmou ainda que os NPs COS-BA/Ce6 poderiam induzir eficientemente a apoptose e necrose celular, já que as células tratadas estavam quase coradas com sinal de fluorescência PI vermelho quando cultivado por mais 10 horas após a irradiação (Fig. 5H). Enquanto isso, NPs COS-BA/Ce6 não irradiados (dose mais alta de Ce6: 3,2 mg/mL) também apresentaram certa atividade quimioterápica, conforme observado pelos sinais AM e PI simultaneamente. Esta atividade PDT notavelmente melhorada de NPs COS-BA/Ce6 foi ainda validada pela coloração AM/PI após tratamento por mais 20 h (Informações de Apoio Fig. S20). Além disso, ao adicionar azida de sódio (SA) e D-manitol (DM), um supressor especial separadamente de 1 O2 e $OH48, às células 4T1 tratadas com COS-BA/Ce6 NPs-PDT, a viabilidade celular obviamente aumentada implicou que Fotorreações Tipo I ($OH) e Tipo II (1 O2) ocorreram simultaneamente no processo PDT mediado por NPs COSBA / Ce6 (Fig. 5J). Além disso, os NPs COS-BA / Ce6 possuem particularmente melhor compatibilidade sanguínea, como indicado pela hemólise insignificante dos glóbulos vermelhos (Fig. 5K), sugerindo o potencial para aplicações biomédicas através de administração intravenosa.

3.6. Biodistribuição in vivo de NPs COS-BA/Ce6

Posteriormente, antes da investigação de distribuição in vivo, avaliamos em seguida a farmacocinética dos NPs COS-BA / Ce6 monitorando a concentração de Ce6 no sangue após injeção intravenosa com NPs Ce6 ou COS-BA / Ce6 equivalentes. Os perfis de concentração-tempo de Ce6 no sangue (Fig. 6A) e os parâmetros farmacocinéticos comparativos (Tabela de Informações de Apoio S1) apoiam claramente que os NPs COS-BA/Ce6 têm uma circulação prolongada na corrente sanguínea, o que pode permitir uma maior acumulação no tumor sites. Em particular, as NPs COS-BA/Ce6 apresentaram rápida eliminação sanguínea em 2 horas, implicando biodegradabilidade favorável. Assim, investigamos então a biodistribuição in vivo e a capacidade de acumulação tumoral de NPs COS-BA / Ce6 (Fig. 6B e C). Semelhante aos nanocompósitos Ce6 universalmente relatados, os NPs COS-BA / Ce6 podem ser distribuídos rapidamente por todo o corpo. Especialmente durante as primeiras 4 h, os conjuntos exibiram emissão de fluorescência obviamente mais forte nos locais do tumor do que o Ce6 livre, sugerindo a retenção melhorada e a capacidade de acumulação direcionada ao tumor dos NPs COS-BA / Ce6, provavelmente atribuída ao efeito passivo de retenção de permeabilidade aprimorada (EPR). proporcionada pelas nanopartículas14. Após 6 horas após a injeção, a intensidade de fluorescência nos locais do tumor diminuiu gradualmente e rapidamente. Notavelmente, ao contrário dos nanocompósitos comumente relatados com acúmulo tumoral significativamente aumentado em comparação com o fármaco positivo livre , os NPs COS-BA / Ce6 não mostraram acúmulo muito proeminente nos locais do tumor 24 horas após a injeção do que Ce6 livre (Fig. 6C), que foi ainda apoiado pela imagem do tumor excisado (Fig. 6D e E). A excelente biodegradabilidade das NPs pode ser responsável pela introdução de pequenas moléculas orgânicas naturais. Isto também foi observado com outros nanoconjuntos mediados por pequenas moléculas de terpenóides . Além disso, os NPs COS-BA / Ce6 também mostraram uma distribuição tecidual semelhante à do Ce6 livre (Fig. 6E), e a intensidade média de fluorescência ex vivo foi geralmente menor que a apresentada in vivo, implicando ainda uma boa biodegradabilidade. Além disso, considerando a pequena diferença no nível de fluorescência entre 2 e 4 h após a injeção de NPs e Ce6, bem como a operabilidade experimental permitindo intervalos suficientes para irradiação, 4 h após a administração foi escolhido como o ponto de tempo de luz para a terapia PDT subsequente.

Considerando o acúmulo de tumor não muito proeminente às 24 horas do que o Ce6 livre, para validar ainda mais o efeito EPR aumentado que os NPs COS-BA/Ce6 têm, monitoramos imediatamente as imagens de fluorescência ex vivo dos tumores em momentos diferentes após a injeção intravenosa com nanodrogas ( Figura 6F e G). Notavelmente, quer aos 20 min quer às 12 h após a injeção, os NPs COS-BA / Ce6 mostraram de facto uma emissão de fluorescência mais forte nos locais do tumor do que o Ce6 livre, demonstrando excelente e melhorada capacidade de acumulação tumoral. Entretanto, com o passar do tempo, as intensidades de fluorescência retidas no tecido tumoral enfraqueceram gradualmente (Fig. 6G), o que é inteiramente consistente com os resultados da imagem de fluorescência animal in vivo. Claramente, este rápido metabolismo biológico e maior acumulação tumoral evitaram a potencial toxicidade de acumulação a longo prazo, garantindo uma terapia antitumoral altamente eficiente com melhor biossegurança.

Figura 5 Eficácia anticâncer in vitro de NPs COS-BA/Ce6. Internalização celular de (A) células cancerígenas 4T1 e (B) células normais LO2 incubadas em NPs Ce6 ou COS-BA/Ce6 livres por 0 0,5 e 3 h, e análise citométrica de fluxo correspondente da intensidade de fluorescência. (C) Inibição de captação de estudos específicos da via endocítica e (D) intensidade de fluorescência correspondente das células medida por citometria de fluxo após incubação com NPs COSBA/Ce6 com/sem inibidores endocíticos, incluindo clorpromazina, cloroquina, nistatina e amiloreto de etilisopropil (EIPA). Barras de escala Z 20 mm. (E) Geração celular de ROS induzida por NPs Ce6 ou COS-BA/Ce6 livres (Ce6 equivalente: 1,6 mg/mL). Barras de escala Z 20 mm. (F) Viabilidade celular de células 4T1 após vários tratamentos durante 24 h. (G) A análise IC25, IC50, IC75 de NPs Ce6 e COS-BA/Ce6 livres contra células 4T1, MCF-7 e HepG2, respectivamente. (H) Calceína-AM/iodeto de propídio (PI) coloração viva/morta de células 4T1 tratadas com COS-BA/Ce6 NPs (Ce6: 1,6 mg/mL) após incubação por mais 10 h, bem como COS- não irradiado NPs BA/Ce6 (Ce6: 3,2 mg/mL). Barras de escala Z 50 mm. (I) Índice de combinação (CI) de NPs COS-BA/Ce6 em células 4T1, MCF-7 e HepG2, conforme determinado pelo cálculo do teorema de Chou Talalay. (J) Mecanismos de PDT (Tipo I e Tipo II) induzidos por irradiação de NPs COS-BA/Ce6 e avaliados por azida de sódio (SA) e D-manitol (DM) específicos de 1 O2 e $OH, respectivamente. (K) Porcentagem de hemólise de glóbulos vermelhos após incubação com NPs COS-BA/Ce6 por 4 h. Os dados são expressos como médias DP (n Z 3). *P ˂ 0,05, **P ˂ 0,01 e ***P ˂ 0,001 mostram as diferenças significativas.

Figura 6 Circulação sanguínea in vivo e biodistribuição de NPs COS-BA/Ce6. (A) Perfis de concentração-tempo de Ce6 no sangue após injeções iv de Ce6 equivalente ou NPs COS-BA/Ce6 co-montados (n Z 3). (B) Imagens de fluorescência de corpo inteiro de camundongos portadores de tumor 4T1 após injeções iv de medicamentos indicados em vários momentos. (C) Intensidade média de fluorescência obtida dos locais do tumor em (B). (D) Imagens de fluorescência ex vivo de tumores e órgãos principais excisados ​​dos camundongos acima às 24 h, e correspondente (E) resultado quantitativo de intensidade de fluorescência (n Z 3). (F) Imagens de fluorescência ex vivo de tumores e órgãos principais em momentos diferentes após injeções iv de NPs Ce6 ou COS-BA/Ce6 e (G) análise de intensidade de fluorescência correspondente de tumores. Os dados são expressos como médias DP (n Z 3).

3.7. Tratamento antitumoral combinatório de quimioterapia/PDT in vivo 

Motivado pela característica única de dormência, boa biodegradabilidade e atividade da TFD, a terapia antitumoral combinada de quimioterapia/TFD in vivo foi investigada. Camundongos portadores de tumor 4T1 foram divididos aleatoriamente em 6 grupos e injetados por via intravenosa com Ce6 equivalente (3,5 mg/kg de corpo) a cada 2 dias para um total de três doses. 4 h após a injeção, os locais tumorais dos camundongos nos grupos de luz foram irradiados por 15 min (Fig. 7A). Entretanto, os volumes tumorais correspondentes ou pesos corporais foram registados em dias alternados. Após 14 dias de tratamento (Fig. 7B), Ce6 livre com irradiação e COS-BA livre foram ineficazes na supressão tumoral, provavelmente devido ao acúmulo limitado de droga no tecido tumoral. Em contraste, após a irradiação de NPs COS-BA/Ce6, foi observada a inibição tumoral mais significativa, validando a excelente eficiência da combinação quimioterapia/PDT. Os pesos médios dos tumores (Fig. 7D) e as fotografias correspondentes dos tumores dissecados (Fig. 7E) demonstraram a melhor eficácia antitumoral dos NPs COS-BA / Ce6 sob irradiação, uma vez que os ratos tratados apresentaram os menores tamanhos de tumor do que os de outros grupos. A taxa média de inibição tumoral de NPs COS-BA/Ce6 tratados com PDT atingiu 80,3%, superior à de Ce6 PDT livre (42,4%) e COS-BA livre (38,5%). Notavelmente, embora estudos in vitro anteriores tenham mostrado que NPs COS-BA/Ce6 sem luz mostraram uma função latente de atividade quimioterápica, eles ainda apresentam uma eficiência antitumoral aumentada (49,5%) em comparação com COS-BA livre (Fig. 7D). Especulamos que duas razões possíveis contribuem para este resultado: uma é o maior acúmulo tumoral de NPs COS-BA / Ce6 devido ao efeito EPR amplamente relatado. Outro fator é o microambiente tumoral fracamente ácido que estimulou a liberação de COS-BA altamente tóxico. Devido à maior concentração micelar crítica (CMC, 187 mg/mL) de COS-BA (Informações de Apoio Fig. S21), ele poderia existir no estado monômero no ambiente tumoral, favorecendo assim a quimioterapia melhorada de COS- não irradiado. NPs BA/Ce6. Além disso, para verificar ainda mais a eficácia anticâncer superior dos NPs COS-BA / Ce6, foi realizada coloração de tumores com hematoxilina e eosina (H&E) (Fig. 7G).

Figura 7 Estudo de eficácia com modelo de xenoenxerto 4T1 subcutâneo. (A) Ilustração esquemática do tratamento PDT in vivo. (B) Perfis de crescimento tumoral, (C) alterações no peso corporal e (D) pesos tumorais excisados ​​contendo taxas de inibição tumoral de camundongos portadores de 4T1- após vários tratamentos nos grupos indicados (n Z 5 para cada grupo). (E) Imagens de tumores extirpados de camundongos representativos após tratamento. (F) Análise bioquímica sérica após tratamento com NPs COS-BA/Ce6 por 14 dias. (G) Coloração representativa de H&E de seções tumorais excisadas após diferentes tratamentos. Barras de escala Z 50 mm. (H) Coloração TUNEL de seções de tumor livres tratadas com PDT de Ce6 e COS-BA/Ce6 NPs. Barras de escala Z 20 mm **P < 0,01 indica diferenças significativas.

Os resultados indicaram que as seções tumorais tratadas com COS-BA / Ce6 NPs-PDT apresentaram grave deterioração tecidual e deficiência de núcleos, enquanto necrose tecidual moderada foi observada nos outros grupos. Simultaneamente, em comparação com a luz Ce6 livre, os NPs COS-BA / Ce6 sob irradiação aumentaram notavelmente o número de células positivas para TUNEL mostrando uma coloração nuclear castanha mais forte (Fig. 7H), confirmando ainda a excelente terapia combinada de quimioterapia / PDT. Além disso, não foram observadas variações óbvias de peso corporal em todos os grupos (Fig. 7C). Mesmo que os grupos COSBA/Ce6 NPs ou Ce6 light tivessem uma perda modesta de peso corporal durante a administração, os pesos corporais voltaram ao normal após alguns dias. Nenhum dano evidente ou lesão inflamatória pôde ser encontrado nos principais órgãos colhidos no final dos tratamentos (Informações de Apoio Fig. S22), ambos indicando baixa ou nenhuma toxicidade sistêmica e boa biossegurança dos NPs COS-BA/Ce6. Além disso, embora os NPs COS-BA/Ce6 sejam acumulados principalmente no tecido hepático, os marcadores de função hepática correspondentes (ALT, AST e ALP) não mostraram alterações significativas em comparação com camundongos saudáveis ​​normais (Fig. 7F), sugerindo melhor biocompatibilidade. Além disso, os marcadores de função renal (BUN, CRE e UA) e os parâmetros bioquímicos (ALB e TBIL) também pareciam ser semelhantes aos de camundongos normais, implicando ainda em melhor biossegurança. Claramente, este pró-fármaco co-montagens mediadas por COS-BA de pequenas moléculas orgânicas COS-BA / Ce6 NPs possuem múltiplas características terapêuticas favoráveis ​​​​que abrem possibilidades atraentes para aplicações em medicina clínica.

3.8. Imunidade antitumoral de quimioterapia combinada/PDT e bloqueio anti-PD-L1

Recentemente, numerosos estudos inovadores demonstraram que a combinação da imunoterapia contra o cancro com outras modalidades de tratamento poderia efetivamente despertar respostas imunitárias específicas do tumor para a eliminação de tumores primários ou distantes1. Encorajados pela função única de dormência da quimioterapia e pela excelente eficácia antitumoral da quimioterapia/PDT dos NPs COS-BA/Ce6, nos perguntamos se ela também poderia desencadear respostas imunológicas com a ajuda de um adjuvante imunológico anti-PD-L1 para causar terapia antitumoral altamente eficiente . Poderia tratar tumores distantes que não podem ser tratados diretamente com o tratamento PDT, fornecendo assim uma estratégia alternativa para aplicações clínicas anticancerígenas? Para testar esta hipótese, neste estudo, um modelo de “dois tumores” foi estabelecido e procedimentos experimentais detalhados foram mostrados na Fig. Tipicamente, dois tumores 4T1 foram inoculados nos flancos esquerdo e direito de cada camundongo. Considerando que o anti-PD-L1 sozinho não tem efeito imunoterapêutico evidente50, os experimentos foram divididos em 5 grupos incluindo um grupo não tratado, NPs COS-BA/Ce6, NPs COS-BA/Ce6 com anti-PD-L1, COS- NPs BA/Ce6 com luz, NPs COS-BA/Ce6 com luz e anti-PD-L1. Após uma única injeção iv de NPs (Ce6: 3,5 mg/kg), os tumores direitos (tumor primário) nos grupos leves foram irradiados por 15 min para avaliar os efeitos imunológicos da TFD/quimioterapia, enquanto os tumores esquerdos (tumores distantes) em todos os grupos sem qualquer tratamento foram selecionados para quimioterapia individual. Posteriormente, nos dias 2, 4 e 6, os camundongos nos grupos imunes foram injetados iv com anticorpo anti-PD-L1 (15 mg por camundongo por injeção) para um total de três doses. Significativamente, independentemente do tratamento PDT ou não, os NPs COS-BA / Ce6 mais anti-PD-L1 poderiam inibir eficientemente a progressão do tumor primário (Fig. 8B). E as taxas médias correspondentes de inibição tumoral atingiram separadamente 860,7% (irradiação) e 76,5% (sem irradiação), muito mais altas do que o tratamento individual com quimioterapia (5,7%) ou quimioterapia/PDT (27,4%) (Fig. 8C) . As fotografias de tumores dissecados (Fig. 8D) e camundongos portadores de 4T 1- (Informações de Apoio Fig. S23) após 14 dias de tratamento também apoiaram visualmente a conclusão acima. Estes resultados sugeriram que tanto a quimioterapia baseada em NPs como a quimioterapia/TFD poderiam efetivamente ativar a imunidade antitumoral. Enquanto isso, o mais surpreendente é que o bloqueio anti-PD-L1 mais NPs também ofereceu um notável efeito de inibição tumoral para tumores distantes (esquerda) não irradiados (Fig. 8E e F), geralmente mais fortes que os NPs COS-BA/Ce6 sozinhos, que foi também confirmado pelos correspondentes tumores dissecados e imagens de camundongos após o tratamento (Fig. 8D e Fig. S23), demonstrando ainda a eficiente resposta imune antitumoral induzida por NPs COS-BA / Ce6.

Para explorar completamente esta resposta imune antitumoral eficiente, os linfócitos T citotóxicos CD8+ (CTLs), um imunócito crítico para a imunoterapia contra o câncer, foram avaliados posteriormente através da análise das células imunes nos tumores direito ou esquerdo após 14 dias de tratamento. Verificou-se que os NPs COS-BA / Ce6 mais anti-PD-L1 com ou sem tratamento PDT induziram infiltração robusta de CTL CD8 nos tumores primários (Fig. 8H e J). A infiltração de CTL CD8+ foi de até 11,3% após quimioterapia/PDT baseada em NPs COS-BA/Ce6 mais tratamento anti-PD-L1, ligeiramente superior a NPs COS-BA/Ce6 mais anti-PD-L1 (9,63%) e muito maior do que em outros grupos sem anti-PD-L1, incluindo tratamento com quimioterapia baseada em COS-BA/Ce6 NPs (5,12%) ou quimioterapia/PDT isoladamente (4,07%). Da mesma forma, em comparação com grupos não imunes, também foi observada infiltração de CTL significativamente aumentada nos tumores esquerdos (distantes) de camundongos após NPs COS-BA/Ce6 mais antiPD-L1 com ou sem tratamento PDT (Fig. 8I e K), adicionalmente implicando respostas imunes altamente eficazes induzidas por quimioterapia ou terapia combinada de quimioterapia/PDT. Enquanto isso, após a introdução do anti-PD-L1, tanto a quimioterapia quanto a quimioterapia/PDT baseadas em COS-BA/Ce6- levaram à produção robusta de múltiplas citocinas que desempenham papéis essenciais na regulação das funções citotóxicas dos CTLs8, incluindo tumor fator de necrose alfa (TNF-a) (Fig. 8L) e interferon-gama (IFN-g) (Fig. 8M) nas amostras de soro de camundongos após 14 dias de tratamento, apoiando ainda mais que houve respostas imunes antitumorais eficientes. Além disso, não foram observadas alterações aparentes nos pesos corporais nos diferentes grupos de tratamento (Fig. 8N), indicando a biossegurança favorável desta combinação de quimioterapia/PDT/imunoterapia. Tomados em conjunto, descobrimos que embora os NPs anti-PD-L1 mais COSBA/Ce6 com luz mostrassem uma taxa de inibição tumoral ligeiramente maior (860,7%) do que o grupo não irradiado (76,5%) contra os tumores certos devido à influência da PDT (Fig. 8B‒D), não foram observadas diferenças significativas nos efeitos terapêuticos nos tumores esquerdos na presença (77,8%) ou ausência (78,4%) de PDT (Fig. 8E‒G). Especulamos que as seguintes possíveis razões levam a esse fenômeno. Em primeiro lugar, para o mecanismo de quimioterapia ou PDT que aumenta os efeitos imunológicos do bloqueio do checkpoint anti-PD-L1, estudos acumulados demonstraram que estas modalidades de tratamento podem desencadear inflamação aguda na área do tumor, aumentando assim a apresentação de antígenos associados ao tumor ao T células, induzindo assim as células cancerígenas a sofrerem CID8,9. As células tumorais submetidas ao CDI regulariam positivamente os sinais de "coma-me", expondo a calreticulina (CRT) nas superfícies das células tumorais que morrem imunogenicamente e os sinais de "perigo", liberando a caixa 1 do grupo de alta mobilidade (HMGB1), promovendo a ativação de células dendríticas para ativar CTLs, cuja atividade poderia ser aumentada pelo anti-PD-L1, resultando assim em uma imunoterapia anticâncer significativamente melhorada51.

Figura 8 Efeito antitumoral da quimioterapia/PDT baseada em NPs COS-BA/Ce6 mais imunoterapia anti-PD-L1 com bloqueio de checkpoint. (A) Ilustração esquemática de quimioterapia/PDT baseada em CNPs com terapia anti-PD-L1. (BeD) (B) Os perfis de crescimento tumoral, (C) pesos médios dos tumores e (D) imagens de tumores extirpados de camundongos representativos para tumores primários (à direita) após vários tratamentos por 14 dias, conforme indicado. (EeG) (E) As curvas de crescimento do tumor, (F) pesos médios dos tumores e (G) imagens de tumores excisados ​​para tumores distantes (esquerda) não irradiados após diferentes tratamentos, conforme indicado. (H) Populações de células T CD8+ em tumores direitos e (J) porcentagens de infiltração de CTL foram detectadas quantitativamente por citometria de fluxo após 14 dias de tratamento. (I, K) Populações de células T CD8+ em tumores esquerdos no Dia 14 foram detectadas quantitativamente por citometria de fluxo (n Z 3). Secreção de citocinas em soros após 14 dias de tratamento incluindo (L) IFN-g e (M) TNF-a medida por ensaio ELISA (n Z 3). (N) Mudanças no peso corporal dos ratos durante vários tratamentos. *P < 0.05, **P < 0.01 e ***P < 0,001 mostram as diferenças significativas.

Em segundo lugar, neste trabalho, os NPs COS-BA/Ce6 poderiam ser distribuídos nos tumores esquerdo e direito simultaneamente, tanto a quimioterapia esquerda como a quimioterapia/PDT direita têm um enorme potencial para induzir células tumorais submetidas a CDI. Enquanto isso, os NPs COS-BA/Ce6 são administrados em apenas uma dose, a imunoterapia depende principalmente de três doses de anti-PD-L1, seja quimioterapia ou quimioterapia/PDT, são apenas primers. As diferenças terapêuticas na indução de CDI de células tumorais entre quimioterapia individual e tratamentos combinados de quimioterapia/TFD podem não ser muito proeminentes. A porcentagem de CTLs CD8+ nos tumores esquerdo (Fig. 8I e K) e direito (Fig. 8H e J) também apoiou a especulação acima, nenhuma diferença significativa nos CTLs CD8+ foi observada na presença ou ausência de PDT. Portanto, os NPs COS-BA / Ce6 mais anti-PD-L1 com ou sem irradiação alcançaram eficiência anticancerígena semelhante contra os tumores esquerdos. Além disso, como as células 4T1 expressam baixos níveis de PD-L152, foi amplamente comprovado que o anti-PD-L1 sozinho tem qualquer efeito imunoterapêutico notável nos cânceres de mama 4T153,54. Apesar dos efeitos do CDI mediados pelos NPs COS-BA/Ce6 justificarem uma investigação mais aprofundada, os resultados apresentados mostraram que os NPs COS-BA/Ce6 alcançam respostas imunes notavelmente melhoradas com a ajuda do anti-PD-L1. Coletivamente, parece que os NPs COS-BA/Ce6 realmente potencializaram a imunoterapia anti-PD-L1 contra o câncer, e não apenas uma terapia combinada. Embora NPs anti-PD-L1 mais COS-BA/Ce6 com ou sem tratamento PDT não tenham mostrado diferenças significativas nos efeitos terapêuticos, ambos mostraram eficácia antitumoral obviamente aumentada em comparação com uma dose de NPs COS-BA/Ce6. Ou seja, mesmo sem tratamento com luz, uma vez introduzido o adjuvante imunológico antiPD-L1, a imunogenicidade dos resíduos tumorais após a quimioterapia com NPs COS-BA/Ce6 pode ser aumentada, resultando em notáveis ​​respostas imunes antitumorais sistêmicas, levando assim a uma supressão eficaz. de tumores primários ou distantes. Assim, deveria ser possível eliminar tumores primários e metastáticos durante a imunoterapia clínica anticâncer com tratamentos repetidos com NPs. Claramente, estes resultados fornecem coletivamente evidências de respostas imunes antitumorais altamente eficazes e sinérgicas induzidas por NPs COS-BA/Ce6 em combinação com um bloqueio anti-PD-L1, com quimioterapia isoladamente ou em combinação com quimioterapia/PDT.

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4. Conclusões

Em resumo, projetamos, sintetizamos e desenvolvemos propositalmente um nanopró-fármaco fotoquimioterápico transformado biocompatível, biodegradável, pouco tóxico, mas altamente eficiente e clinicamente disponível, COS-BA / Ce6 NPs, combinando três componentes multifuncionais de ácido betulínico natural de pequena molécula automontado (BA), um COS solúvel em água e um fotossensibilizador Ce6 de baixa toxicidade para quimioterapia/PDT combinada. Posteriormente, desencadeia respostas imunes antitumorais altamente eficazes e sinérgicas em combinação com um bloqueio anti-PD-L1, com quimioterapia isolada ou em combinação com quimioterapia/PDT. Especificamente, mostramos que o arranjo molecular de rede oca pode facilitar a formação de nanopartículas estruturadas em concha. Modificações do COS solúvel em água poderiam aumentar grandemente a atividade anticancerígena de pequenas moléculas naturais lipofílicas através da construção de um pró-fármaco anfifílico. Mostramos também que os nanofármacos resultantes apresentaram múltiplas características terapêuticas favoráveis, especialmente uma função inteligente de "dormência" com efeitos quimioterápicos insidiosos. Combinados com a distinta capacidade de resposta ao pH, esses co-montagens apresentam baixa toxicidade e biossegurança com tecidos normais, mas são altamente tóxicos para tecidos tumorais. Juntamente com a geração melhorada de 1 O2, boa biodegradabilidade e biocompatibilidade, tudo isso contribuiu para a quimioterapia/PDT/imunoterapia anticâncer altamente eficiente, sinérgica e segura. Em particular, a quimioterapia individual sem tratamento PDT pode ativar respostas imunes antitumorais sistêmicas, abrindo possibilidades atraentes para imunoterapia quimioterápica anticancerígena clinicamente sinérgica. No geral, este trabalho fornece informações promissoras para o desenvolvimento de nanoimunoestimulantes naturais multifuncionais, altamente bioativos e de baixa toxicidade para imunoterapia clínica.

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