Parte 1: Estabelecimento do modelo experimental concorrente de osteoporose combinado com doença de Alzheimer em ratos e os efeitos duplos de echinacoside e acteside de Cistanche Tubulosa
Mar 24, 2022
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Yi Chen, Ying-Qi Li, Jia-Yi Fang, Ping Li, Fei Li
ABSTRATO
Relevância etnofarmacológica: Cistanche tubulosaé uma preciosa medicina tradicional chinesa que tem sido amplamente utilizada no tratamento da osteoporose edoença de Alzheimer. Echinacosidee acteosídeos são os principais constituintes ativos da Cistanche tubulosa que possuem atividades farmacológicas com valor de pesquisa. Tem sido relatado que echinacoside eacteósidopoderia melhorar a capacidade de aprendizagem e memória, promover a proliferação e diferenciação de osteoblastos. Objetivo do estudo: Echinacoside e acteoside deCistanche tubulosamostraram atividades significativas de anti-osteoporose e anti-doença de Alzheimer, enquanto esses efeitos não foram estudados concomitantemente em um modelo de rato. O objetivo deste estudo foi estabelecer e verificar o modelo de osteoporose combinado comdoença de Alzheimerem ratos e investigar os efeitos duplos deechinacosidee acteosídeo neste modelo concorrente.
Materiais e métodos:Três grupos modelo de ovariectomia (OVX), cirurgia simulada com D-galactose e AlCl3 (D), ovariectomia com D-galactose e AlCl3 (OVX mais D) foram definidos ao mesmo tempo. As ratas dos grupos de tratamento medicamentoso foram ovariectomizadas. Ao realizar a injeção intraperitoneal de D-galactose e administração intragástrica de AlCl3 nos ratos dos grupos de tratamento com drogas, os ratos foram administrados por via oralechinacoside(90 mg/kg/d),acteósido(90 mg/kg/d), e as drogas de controle positivo de valerato de estradiol (0,6 mg/kg/d), donepezil HCl (0,8 mg/kg/d), respectivamente. Após o tratamento medicamentoso de 8 semanas, o teste Morris Water Maze (MWM) por 6 dias foi realizado pela primeira vez. Os ratos foram então sacrificados para colher o sangue, útero, fêmures, tíbias e tecidos cerebrais. O soro foi usado para testes bioquímicos. Os úteros foram usados para histomorfometria. Os fêmures direitos foram usados para Micro-CTe histomorfometria, respectivamente. As tíbias direitas foram utilizadas para o teste biomecânico. O hipocampo coletado na geladeira foi utilizado para testes bioquímicos. O cérebro 41 coletado por perfusão foi utilizado para histomorfometria.
Resultados:Comparado com o grupo Sham, o grupo OVX mais D pode reduzir significativamente a capacidade de aprendizado e memória, causando danos oxidativos, prejudicando os neurônios no hipocampo e afetando a hidrólise e a síntese de acetilcolina. Enquanto isso, as atividades de BALP e TRAP no grupo OVX mais D aumentaram significativamente (P<0.001) as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" in="" addition,="" compared="" with="" the="" sham="" group,="" the="" mean="" bone="" mineral="" density="" obviously="" decreased=""><0.05), the="" trabecular="" bone="" mass="" and="" microarchitecture="" were="" also="" destroyed="" significantly="" in="" the="" ovx+d="" group.="" furthermore,="" the="" maximum="" load="" and="" maximum="" stress="" significantly="" reduced=""><0.01) and="" the="" energy="" 50="" absorption="" also="" decreased="" greatly="" as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" after="" being="" administrated="" with="">echinacosideeacteósido, as características patológicas típicas da osteoporose edoença de Alzheimerforam melhorados.
Conclusões:O modelo de osteoporose combinado comdoença de Alzheimerem ratos foi viável e estabelecido com sucesso.Echinacosidee acteosídeo também mostraram alguns efeitos significativos neste modelo concorrente, e podem ser potenciais 56 candidatos deCistanche tubulosacom efeitos duplos para um estudo mais aprofundado.
Palavras-chave:osteoporose; Doença de Alzheimer; efeitos duplos; echinacoside; acteósido; Cistanche tubulosa
Cistanche perdeu império ervas melhora a doença de Alzheimer
1. Introdução
A osteoporose é uma doença óssea degenerativa caracterizada por uma perda progressiva de massa óssea e destruição da microarquitetura, o que pode aumentar o risco de fratura por fragilidade (Rachner et al., 2011).doença de Alzheimer(DA) é uma doença neurodegenerativa comum em idosos que se caracteriza por declínio mental contínuo, comprometimento cognitivo e perda da capacidade de vida independente na clínica (Reitz 76 et al., 2011). A formação de placa senil induzida pela deposição de -amilóide, emaranhados neurofibrilares causados pela hiperfosforilação de tau e degeneração neuronal no cérebro são as características patológicas típicas da DA (Serrano-Pozo et al., 2011). Superficialmente, OP e DA são doenças completamente independentes com diferentes patologia e características clínicas. No entanto, OP e AD são frequentemente observados como co-ocorrendo na prática clínica (Zhang et al., 2001; Lui et al., 2003; Luckhaus et al., 2009). A prevalência de ambas as doenças aumentou com a idade, especialmente em mulheres na pós-menopausa (Li et al., 2017; Stern, 2012). Cada vez mais evidências indicam que as pessoas diagnosticadas com DA têm um risco aumentado de OP (Zhou et al., 2014).
É necessário estudar e esclarecer as relações entre osteoporose edoença de Alzheimerin vitro e in vivo. Antes de os estudos serem realizados in vivo, é importante selecionar os modelos animais aplicáveis de osteoporose ou doença de Alzheimer. O modelo de osteoporose pode ser estabelecido por vários tipos de métodos, como administração intragástrica de ácido retinóico, cirurgia de ovariectomia e injeção intramuscular de glicocorticóides (Wei et al., 2007; Komori, 2015). Particularmente, o modelo de osteoporose pós-menopausa induzida por ovariectomia em ratas foi clássico etem sido amplamente utilizado na maioria dos estudos (Miao et al., 2012; Liu et al., 2017).A doença de Alzheimer esporádica é o principal tipo de doença de Alzheimer. O animalmodelos de esporádicosdoença de Alzheimerpode ser induzida por vários métodos, comoinjeção de D-galactose ou -amilóide, administração intragástrica de AlCl3,e assim por diante(Bagheri et al., 2011; Gao et al., 2015; Justin Thenmozhi et al., 2017). Além disso, omodelo de conjunção da doença de Alzheimer induzida porinjeção de D-galactose combinada com ovariectomia também tem sido muito estudada (Liuet al., 2010; Zhao et al., 2012). A fim de revelar a relevância da osteoporose edoença de Alzheimer, é necessário estabelecer o modelo de osteoporose combinadocom a doença de Alzheimer para estudar os mecanismos comuns de medicamentososteoporose edoença de Alzheimerasse.
Cistanche tubulosa(Schenk) Wight é uma planta parasita, que se distribui principalmente nos desertos do noroeste da China. Os caules secos e suculentos deCistanche tubulosa(CT) são usados como um famoso medicamento tônico chamado Cistanches Herba com seu nome chinês de Roucongrong na Farmacopeia Chinesa (2015). Foi homenageado como "ginseng dos desertos" e é amplamente utilizado para o tratamento de dores na cintura e no joelho, esterilidade feminina e constipação na medicina tradicional chinesa (Jiang e Tu, 2009). Os principais constituintes ativos da CT são glicosídeos feniletanoides (PhGs), equinacosídeos (ECH) eacteósido(ACT) são os compostos representativos em PhGs (Morikawa et al., 2014). Particularmente, ECH e ACT são tipicamente selecionados como marcadores para controle de qualidade em TC devido ao seu alto teor e várias atividades farmacológicas, como os efeitos de neuroproteção, proteção óssea,
antioxidantes, antienvelhecimento e melhorando a capacidade de aprendizado e memória (Wang et al.,2012; Li et al., 2016). No entanto, os efeitos da ECH e ACT na osteoporosecombinado comdoença de Alzheimerainda não haviam sido estudados em conjunto em um modelo de rato.Assim, o objetivo deste estudo foi estabelecer um modelo de rato de osteoporose combinadacom a doença de Alzheimer e explorar os efeitosechinacosidee acteosídeo nestemodelo concorrente, de modo a fornecer evidências experimentais para um estudo mais aprofundado damecanismo molecular de echinacoside ou acteoside na pesquisa a seguir.
cistache pharma especialporDE ANÚNCIOS
2. Materiais e métodos
2.1. Animais
Oitenta 8-ratos Wistar fêmeas de semanas de idade (Número do Certificado: SCXK 2018-0006), pesando 180~200 g, foram adquiridos do Sino-British SIPPR/BK Lab. Animal Ltd (Xangai, China) e criado no Centro Experimental de Animais Farmacêuticos na China Pharmaceutical University.
2.2. Produtos químicos e reagentes
Hidrato de cloral, penicilina G sódica, D-galactose, cloreto de alumínio hexahidratado, valerato de estradiol, donepezil HCl foram adquiridos à Aladdin Industrial Corporation (Xangai, China).Echinacoside(HPLC 94 por cento) foi obtido de Chengdu Wecistanche Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, China).Acteosídeo(HPLC 98 por cento) foi adquirido de Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Baoji, China). Os kits de fosfatase alcalina específica do osso (BALP), fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP), superóxido dismutase (SOD), malonaldeído (MDA), acetilcolinesterase (AChE) e colina acetiltransferase (ChAT) foram adquirido de Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. (Xangai, China). O fixador de tecido universal foi obtido daChengdu Wecistanche Biotecnologia Co., Ltd. (Chengdu, China).
echinacoside
2.3. Modelos animais e tratamentos
Todos os experimentos com animais foram autorizados e supervisionados pelo Comitê de Ética Animal da China Pharmaceutical University. Os ratos foram mantidos com um ciclo claro/escuro de 12 h em uma sala com temperatura controlada (22±2 graus) e alimentados com forragem peletizada padrão e água da torneira.
Após a adaptação de uma semana, o modelo de osteoporose foi alcançado com a realização da cirurgia de ovariectomia (French et al., 2008). Após o término da operação, a penicilina G sódica foi aspergida sobre a sutura da ferida por uma vez para evitar infecção. Os ratos foram então alimentados normalmente durante três semanas. De acordo com a referência (Hua et al., 2007; Alawdi et al., 2017), o modelo dedoença de Alzheimerpode ser induzida por injeção intraperitoneal de longa duração de D-galactose combinada com ovariectomia ou administração intragástrica de longa duração de AlCl3. Para estudar a viabilidade do modelo de osteoporose combinada com doença de Alzheimer, três grupos modelo de ovariectomia (grupo OVX), cirurgia simulada com injeção intraperitoneal de 150 mg/kg/d D-galactose e administração intragástrica de 30 mg/kg/d AlCl3 (grupo D), ovariectomia com injeção intraperitoneal de 150 mg/kg/d D-galactose e administração intragástrica de 30 mg/kg/d AlCl3 (grupo OVX mais D) foram definidas neste estudo.
Portanto, os ratos foram divididos aleatoriamente em oito grupos (n{{0}} para cada grupo) após 3 semanas e tratados com medicamentos por via oral por 8 semanas: Grupo Sham; grupo OVX; grupo D; grupo OVX mais D; grupo de tratamento com valerato de estradiol (grupo EV, OVX mais D mais 0,6 mg/kg/d valerato de estradiol); grupo de tratamento com donepezil HCl (grupo DPZ, OVX mais D mais 0,8 mg/kg/d donepezil HCl);echinacosidegrupo de tratamento (grupo ECH, OVX mais D mais 90 mg/kg/d de echinacoside);acteósidogrupo de tratamento (grupo ACT, OVX mais D mais 90 mg/kg/d de acteosídeo). De acordo com o Princípio de Conversão de Dose Equivalente Humano-Rato e a dose da referência relacionada (Li et al., 2013; Gao et al., 2014), foram adotadas as dosagens dos grupos de tratamento medicamentoso neste estudo.
O peso corporal de cada rato foi medido a cada semana. Após todo o tratamento com drogas com duração de 8 semanas, foi realizado o teste Morris Water Maze (MWM) por 6 dias. Após isso, 6 ratos de cada grupo foram sacrificados para a colheita dos materiais. Os ratos foram anestesiados com injeção intraperitoneal de 3,0 mL/kg de hidrato de cloral a 10 por cento, e o sangue foi coletado da aorta abdominal. O sangue foi colocado à temperatura ambiente para coagular e centrifugado a 3500 r/min por 10 min. O soro foi colhido em um tubo de centrífuga de 1,5 mL (NEST Biotechnology) e armazenado a -80 grau até ser usado para testes bioquímicos. Os úteros, fêmures, tíbias e tecidos cerebrais foram então coletados. Os úteros foram usados para histomorfometria. Os fêmures direitos foram usados para Micro-CT e histomorfometria, respectivamente. As tíbias direitas foram utilizadas para o teste biomecânico. O hipocampo coletado na geladeira foi utilizado para testes bioquímicos. Depois disso, os outros três ratos de cada grupo foram perfundidos do coração com solução salina e fixador de tecido universal para colher o cérebro para histomorfometria.
2.4. Teste do labirinto aquático de Morris (MWM)
Os ratos foram submetidos a aprendizagem de referência espacial e teste de memória no teste MWM após 8 semanas de intervenção. O teste MWM foi realizado seguindo os métodos relatados anteriormente (Morris, 1984; Gao et al., 2016). Resumidamente, 5 dias consecutivos com quatro tentativas por dia, os ratos foram treinados para usar uma variedade de pistas visuais localizadas na parede da piscina para encontrar uma plataforma submersa escondida (diâmetro 11 cm, altura 29 cm) em uma piscina circular (diâmetro 130 cm, altura 50 cm) preenchido com água não tóxica com tinta de carbono. A piscina foi dividida imagináriamente em quatro quadrantes, e quatro posições iniciais foram localizadas nas interseções dos quadrantes. A plataforma estava localizada no centro de um dos quadrantes e a posição foi constante durante as tentativas. Em cada ensaio, os ratos foram colocados aleatoriamente em locais selecionados, voltados para a parede da piscina. Cada tentativa foi encerrada quando o rato atingiu a plataforma ou após 60 s, e o tempo decorrido foi registrado como latência de escape. Ratos que não conseguiram alcançar a plataforma foram guiados para ela. Após cada tentativa de plataforma oculta, o rato permaneceu na plataforma por 10 s. O tempo médio de latência de quatro tentativas por dia foi calculado como os resultados do treinamento. No dia 6, todos os ratos foram submetidos a um teste de sonda no qual nadaram por 60 s na piscina sem plataforma. Os tempos de travessia no local da plataforma e o tempo de deslocamento no quadrante alvo foram registrados como resultados finais. Os ratos foram monitorados por uma câmera montada no teto diretamente acima da piscina, e todos os ensaios foram registrados e analisados usando o programa MORRIS MAZE, fornecido pela Beijing zhongshidichuang science and technology development Co., Ltd. (Pequim, China)
2.5. Teste bioquímico por ELISA
De acordo com as instruções do fabricante dos kits ELISA, a atividade da fosfatase alcalina específica do osso (BALP), a atividade da fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP), a atividade da superóxido dismutase (SOD) e o conteúdo de malondialdeído (MDA) no soro foram testados pela BioTek Synergy 2 leitor de microplacas multimodo (BioTek, EUA). Os tecidos do hipocampo de cada grupo foram lavados com PBS (0.01 M, pH 7,4) para remover o sangue ou impurezas remanescentes na superfície do tecido. Os tecidos do hipocampo de um lado foram pesados e depois cortados em pedaços tão pequenos quanto possível. Os tecidos do hipocampo foram homogeneizados de acordo com a proporção de 1:9 (peso do tecido: volume de PBS). O homogenato foi centrifugado a 4 graus, 3000 r/min durante 15 min. O sobrenadante foi coletado e diluído para medir a concentração de proteína pelo método BCA. A atividade de acetilcolinesterase (AChE), atividade de colina acetiltransferase (ChAT), atividade de superóxido dismutase (SOD) e conteúdo de malondialdeído (MDA) no tecido do hipocampo foram então testados por métodos ELISA.
2.6. Histomorfometria do hipocampo
Os tecidos cerebrais (n=3/grupo) foram fixados em fixador universal de tecidos. As amostras de tecido cerebral foram então lavadas, desidratadas com etanol gradiente, embebidas em cera de parafina e cortadas em cortes coronais de 5 μm. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE). Em seguida, os cortes coronais dos tecidos cerebrais foram fotografados por um microscópio de fluorescência invertido (Nikon, Japão). As alterações morfológicas de CA1, CA2, CA3 e DG no hipocampo foram especialmente observadas.
2.7. Histomorfometria e morfometria uterina
Os úteros selecionados (n{0}}/grupo) foram fixados em fixador tecidual universal. As amostras de tecido do útero foram então lavadas, desidratadas com etanol gradiente, embebidas em parafina e cortadas em cortes transversais de 5 μm. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE). Os cortes transversais dos úteros foram observados e fotografados. Cinco campos de visão foram selecionados aleatoriamente, o diâmetro da seção transversal uterina e a espessura do epitélio da mucosa uterina foram então medidos usando o software Image-Pro Plus 6.0. O número de glândulas uterinas na lâmina própria também foi contado.
2.8. Micro-CT
Os fêmures direitos selecionados (n=3/grupo) foram escaneados em uma posição com a distância do objeto até a fonte de 121 mm e a distância da câmera até a fonte de 171 mm usando um SkyScan 1176 micro X- tomografia computadorizada de raios (Micro-CT) scanner (Bruker, Alemanha). A placa de crescimento distal foi selecionada como superfície de referência. Com uma distância de 1 mm abaixo da superfície de referência, uma região de 1,8 mm de espessura foi selecionada como volume de interesse (VOI, 100 camadas). As imagens em tons de cinza resultantes tinham um tamanho de pixel de 17,76 μm da reconstrução óssea (65 kV, 385 μA). Um método de contorno semiautomático foi empregado para selecionar trabéculas de osso cortical. Métodos de medição 3D diretos foram usados para avaliar a porcentagem do volume ósseo (BV/TV), densidade da superfície óssea (BS/TV), separação trabecular (Tb. Sp), número trabecular (Tb. N), espessura trabecular (Tb. Th) , índice de modelo de estrutura (SMI), fator de padrão trabecular (Tb. Pd) e densidade mineral óssea média (BMD média) para o mesmo VOI usando oCTPrograma analisador (Bruker, Alemanha). A visualização 3D do VOI usando um algoritmo de renderização adaptável foi feita com o software CTvol (Bruker, Alemanha).
extrato de planta cistanche
2.9. Histomorfometria óssea
Os fêmures direitos selecionados (n=3/grupo) foram fixados em fixador tecidual universal e, em seguida, descalcificados em solução de EDTA a 10%-2Na por 3 semanas. As amostras descalcificadas foram lavadas, desidratadas com etanol gradiente, embebidas em parafina e cortadas em cortes longitudinais de 5 μm. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE). Os cortes longitudinais dos fêmures foram fotografados. Foram observadas as estruturas do tecido ósseo de cada grupo, principalmente as estruturas ósseas trabeculares.
2.10. Teste biomecânico
As tíbias direitas (n=4/grupo) selecionadas aleatoriamente foram avaliadas para o teste de flexão de três pontos usando uma máquina de teste universal (SHIMADZU, Japão). Os diâmetros dessas amostras foram medidos por paquímetro vernier na faixa de 2.16-2,38 mm (d). A amostra foi então colocada em duas travessas de suporte com uma distância de 25 mm (L) entre os dois trilhos e a curvatura fisiológica do corpo de prova foi para cima. A haste de carregamento da carga foi localizada no centro do corpo de prova e caiu a uma taxa constante de 1,5 mm/min até que o corpo de prova fosse quebrado. Os dados de força (F) e deslocamento foram registrados automaticamente em um computador que fez interface com a máquina de teste e a curva carga-deformação foi plotada simultaneamente. Os valores de carga máxima (N) e absorção de energia (mJ) foram registrados pelo software de teste de materiais TRAPEZIUM X ao mesmo tempo. Os valores de tensão máxima (MPa) foram calculados de acordo com a seguinte fórmula: Tensão (σ)=momento fletor (M) / fator de seção (Z)=(8×L×F) / ( π×d3)
2.11. Análise estatística
Os resultados dos grupos modelo foram comparados com o grupo Sham, e os dos grupos tratados com drogas foram comparados com o grupo OVX mais D. Os dados foram analisados usando ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparação múltipla de Bonferroni usando o software Graph Pad Prism 5.0. Os dados foram expressos como média ± DP, e valores de P inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.
miricetinaecistache
