Lipidomics revela alterações lipídicas renais induzidas por cisplatina durante lesão renal aguda e sua atenuação pela cilastatina

edmund.chen@wecistanche.com

Abstrato:  A nefrotoxicidade é uma complicação importante da quimioterapia à base de cisplatina, levando alesão renalem ca. 30 por cento dos pacientes, sem intervenção preventiva ou tratamento disponível para uso clínico. A cilastatina provou exercer um efeito nefroprotetor para terapias com cisplatina em modelos in vitro e in vivo, tendo recentemente entrado em ensaios clínicos. Uma compreensão mais profunda no nível molecular da cisplatina induzidadano renale o efeito de potenciais agentes protetores pode ser a chave para desenvolver terapias nefroprotetoras bem-sucedidas e estabelecer novos biomarcadores dedano renalenefroproteção. Uma abordagem lipidômica direcionada, usando LC-MS/MS, foi empregada para a quantificação de 108 espécies de lipídios (incluindo fosfolipídios, esfingolipídios e colesterol livre e esterificado) emrimextratos de córtex e medula de ratos tratados com cisplatina e/ou cilastatina. Até 56 e 63 espécies lipídicas foram encontradas alteradas no córtex e na medula, respectivamente, após o tratamento com cisplatina. O co-tratamento com cilastatina atenuou muitas dessas alterações lipídicas, total ou parcialmente em relação aos níveis de controle. A análise multivariada revelou que as espécies lipídicas podem ser usadas para discriminardano renalenefroproteção, sendo os ésteres de colesterol as espécies mais discriminantes, juntamente com os sulfatídeos e os fosfolipídios. Potenciais biomarcadores de diagnóstico induzido por cisplatina dano renale cilastatinanefroproteçãotambém foram encontrados.

Palavras-chave:lipidômica; cisplatina; lesão renal aguda; cilastatina; nefroproteção; biomarcadores; ésteres de colesterol; esfingolípidos; fosfolipídios; quimioterapia

Introdução A nefrotoxicidade é um efeito colateral grave da quimioterapia com cisplatina [1], comlesão renal(AKI) sendo desenvolvido em ca. 30 por cento dos pacientes tratados [2]. Este também é o principal fator limitante da dose e uma importante desvantagem das terapias à base de cisplatina, um dos tratamentos mais relevantes para tumores sólidos [2]. A cisplatina se acumula e causa lesãorenalcélulas epiteliais do túbulo proximal (RPTECs), e o dano localiza-se particularmente no segmento S3 do túbulo proximal, descendente dorenalcórtex em direção à junção corticomedular e medula externa [3]. No entanto, danos diretos à alça de Henle medular também foram sugeridos [4,5]. Uma série de eventos celulares ocorre em relação arenallesão da célula tubular, após captação de cisplatina, incluindo estresse oxidativo, estresse nitrosativo, lesão vascular, inflamação, dano mitocondrial ou inibição de Na plus, K plus - ATPase na membrana celular e estresse do retículo endoplasmático, seguido por morte celular do túbulo proximal principalmente por apoptose (ambos envolvendo vias intrínsecas e extrínsecas) ou necrose, levando à perda defunção renal[2,6,7]. Isso se manifesta na diminuição da taxa de fifiltração glomerular (TFG) e dos níveis séricos de magnésio e potássio, com aumento do nitrogênio ureico no sangue (BUN) e da creatinina sérica [2].

Várias abordagens têm sido investigadas paranefroproteçãodurante as terapias com cisplatina tanto in vitro quanto in vivo, com base em vários alvos moleculares [7-9]. No entanto, a possível perturbação do efeito citotóxico da cisplatina nas células tumorais e um efeito protetor muitas vezes incompleto limitaram o desenvolvimento de renoprotetores [9]. Como resultado, não há intervenção para uso clínico que previna ou trate com sucesso a LRA induzida por cisplatina [7]. Uma compreensão mais profunda das vias moleculares relacionadas à IRA induzida por cisplatina e potenciais alvos paranefroproteçãoparece crucial nesse sentido.

A cilastatina provou proteger eficazmenterimdos danos causados ​​por vários agentes, incluindo cisplatina [10,11], gentamicina [12], vancomicina [13], ciclosporina A e tacrolimus [14], em modelos in vitro e in vivo. A cilastatina exerce seu efeito protetor inibindo seletivamenterenaldesidropeptidase I (DHP-I) localizada nas balsas lipídicas na borda em escova dos RPTECs [11]. Como resultado, os processos que envolvem a exteriorização da membrana, como a apoptose extrínseca mediada por Fas, são prejudicados pela cilastatina, e a progressão dadano renalapós um insulto tóxico ser detido [11]. Além do comprometimento da apoptose extrínseca pela cilastatina, o estresse oxidativo, a inflamação e o acúmulo de compostos nefrotóxicos foram todos diminuídos [10–13,15,16]. Desta forma,função renalpermanece preservado sob co-tratamento com cisplatina e cilastatina [11]. Recentemente, a cilastatina concluiu com sucesso os ensaios clínicos de fase I para seu uso como nefroprotetor e está prestes a entrar nos ensaios de fase II. Um estudo recente promissor também revelou que a cilastatina (administrada como imipenem mais cilastatina) pode alcançar um efeito renoprotetor em pacientes com carcinomatose peritoneal durante o tratamento com cisplatina intraperitoneal hipertérmica [17].

Nos últimos anos, tecnologias ômicas, especialmente proteômica [18,19] e metabolômica [20-23], provaram ser úteis para a descoberta de novos biomarcadores diagnósticos precoces de LRA, além de BUN ou creatinina no soro [18,20]. Além disso, a análise metabolômica pode fornecer informações valiosas para a compreensão dos mecanismos de nefrotoxicidade da cisplatina [5,24] e o efeito terapêutico de potenciais nefroprotetores [25-27].

Em particular, a lipidômica também pode fornecer informações relevantes sobredoenca renal[28], considerando que os lipídios apresentam importantes funções estruturais, de sinalização celular e do metabolismo, podendo ser alterados em células, tecidos e biofluidos sobrenalcondições patológicas [29,30]. Nesse sentido, níveis aumentados de triglicerídeos e ácidos graxos não esterificados foram encontrados norimdurante o tratamento com cisplatina [31], além de lipídios neutros tal [32]. Níveis elevados de esfingolipídeos - ceramidas (Cer) e hexosilceramidas (HexCer) - também foram observados norenalcórtex durante a LRA induzida por cisplatina [33]. Por outro lado, espécies de fosfolipídios, incluindo fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE) e lisofosfatidilcolina (LPC), também foram encontradas alteradas emtecido renalou células durante o tratamento com cisplatina [26]. Os níveis de diversas espécies de LPC também foram encontrados alterados no soro de rato após a administração de cisplatina [23]. Além disso, uma abordagem semiquantitativa não direcionada de imagem de espectrometria de massa permitiu comparar a distribuição de lipídios em ratosrimseções e sugeriram que a cisplatina levou a alterações em diversos fosfolipídios (PC, PE, fosfatidilgliceróis (PG), fosfatidilinositóis (PI), fosfatidilserinas (PS), ácidos fosfatídicos (PA)), sulfatídeos (Sulf) ou cardiolipinas. (mostrando comportamento diferente no córtex e na medula), enquanto o co-tratamento com cilastatina tendeu a atenuar algumas dessas alterações [4].

Neste trabalho, demos um passo adiante e examinamos mais de perto os lipídios estruturais importantes norim, como fosfolipídios (PC, LPC e PE), esfingolipídeos (Sulf, esfingomielinas (SM), diidroesfingomielinas (dhSM), Cer, diidroceramidas (dhCer), HexCer, diidrohexosilceramidas (dhHexCer)) e colesterol livre (FC) e seus esterificados formas (ésteres de colesterol (CE)), abrangendo novas classes e espécies de lipídios e usando uma abordagem quantitativa direcionada mais confiável baseada em cromatografia líquida acoplada à análise de espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS). Um total de 108 espécies lipídicas foram quantificadas tanto emrenalextratos de córtex e medula de ratos tratados, a fim de melhor compreender o efeito nefrotóxico da cisplatina e o efeito nefroprotetor da cilastatina. Novas informações sobre o impacto da cisplatina associada à IRA narenalespécies lipídicas foram obtidas e insights adicionais foram obtidos sobre o efeito protetor da cilastatina, o que levou a uma atenuação de algumas das alterações lipídicas específicas causadas pela cisplatina tanto norenalcórtex ou medula. Diversos biomarcadores potenciais de cisplatina induzidadano renalenefroproteçãocom cilastatina também foram encontrados.

Resultados

Efeito protetor da cilastatina contra danos renais induzidos por cisplatina

Avaliação defunção renalem ratos tratados com cisplatina e/ou cilastatina foi realizado pela primeira vez empregando vários indicadores bioquímicos no soro e na urina. Conforme mostrado na Tabela 1, creatinina sérica, BUN, proteínas urinárias, volume urinário e excreção fracionada de sódio e potássio aumentaram significativamente devido ao tratamento com cisplatina em comparação com o grupo controle, enquanto o co-tratamento com cilastatina e cisplatina levou à sua diminuição em comparação com níveis de controle. Por outro lado, a TFG foi diminuída em ratos tratados com cisplatina em relação às amostras de controle, enquanto a coadministração de cilastatina diminuiu esse efeito. Esses resultados confirmamdano renalinduzida pela cisplatina e proteção pela cilastatina. A cilastatina isolada não mostrou qualquer efeito sobrefunção renalparâmetros.

A análise histopatológica também foi realizada em cortes corados por hematoxilina/eosina para estudar alterações morfológicas relacionadas adano renal. A Figura 1 mostra sinais de dano induzidos por cisplatina na região proximalrenaltúbulos, incluindo inchaço dos túbulos, descolamento de detritos celulares ou perda da membrana da borda em escova (Figura 1C, G, I). O acúmulo de cilindros de proteína também foi observado nos túbulos do córtex e da medula (Figura 1C, G, respectivamente). Isso contrasta com a morfologia normal observada nos grupos controle ou cilastatina no córtex (Figura 1A,B, respectivamente) e medula (Figura 1E,F, respectivamente). O co-tratamento de cilastatina com cisplatina resultou na redução clara de todas essas alterações induzidas por cisplatina no córtex e na medula (Figura 1D,H,J).

Alteração da Cisplatina das Classes Globais de Lipídios Renais no Córtex e na Medula. Efeito protetor da Cilastatina

Níveis totais de diferentes classes de lipídios, incluindo esteróis (CE, FC), fosfolipídios (LPC, PC, PE) e esfingolipídeos (Cer, dhCer, HexCer, dhHexCer, Sulf, SM, dhSM) foram determinados norenalcórtex e medula, a fim de avaliar o efeito global da cisplatina sobre os lipídios durante a LRA. Os resultados completos da análise de lipídios são encontrados na Tabela S1. Como pode ser visto na Figura 2A,B, tendências bastante semelhantes foram observadas no córtex e na medula para todos os grupos. CE e Cer aumentaram significativamente, enquanto SM, dhSM e PE diminuíram, tanto no córtex quanto na medula durante o tratamento com cisplatina, em relação aos grupos controle. Entre estes, Cer e CE sofrem as alterações induzidas por cisplatina mais proeminentes observadas. Além disso, dhCer e HexCer foram significativamente aumentados na medula, enquanto no córtex, dhHexCer foi aumentado e LPC e Sulf diminuíram durante o tratamento com cisplatina.

Figura 1. Análise histopatológica de hematoxilina/eosinarenalseções mostra proteção cilastatina contra danos induzidos por cisplatina. As imagens são mostradas em aumento de 20x para (A) córtex controle; (B) córtex de cilastatina; (C) córtex de cisplatina; (D) córtex de cisplatina mais cilastatina; (E) medula de controle; (F) medula de cilastatina; (G) medula de cisplatina; e (H) medula de cisplatina mais cilastatina. A barra de escala de A a H representa 100 µm. Imagens detalhadas derenaltúbulos em ampliação de 60x são exibidos para (I) cisplatina e (J) cisplatina mais cilastatina. A barra de escala para I e J representa 25 µm.Renalindicadores de danos são representados: →: acúmulo de moldes de proteína norenaltúbulos. & região: inchaço dos túbulos. *: perda da membrana da borda em escova. #: desprendimento de detritos celulares.

A coadministração de cilastatina e cisplatina tendeu a atenuar algumas dessas alterações lipídicas induzidas por cisplatina, resultando em nenhuma diferença em relação aos grupos de controle no caso de níveis de Cer e dhHexCer no córtex, ou dhCer, HexCer, SM, dhSM e PE níveis na medula. Além disso, no caso do aumento de CE induzido por cisplatina no córtex, a cilastatina coadministrada com cisplatina levou a níveis significativamente diminuídos em comparação com o grupo cisplatina, embora a recuperação tenha sido parcial em relação aos grupos coiatrol. O restante das classes de lipídios alteradas pela cisplatina permaneceu não recuperada durante o co-tratamento com cilastatisi. Por outro lado, a cilastatina em si não teve efeito sobre os lipídeos do córtex e da medula, exceto para LPC e dhCer no córtex, que pareciam estar diminuídos e aumentados, respectivamente, em comparação com o grupo controle. Os níveis totais de FC, PC e dhHexCer não mostraram alteração significativa no córtex e na medula após o tratamento com cisplatina.

A Figura 2C,D exibe os mapas de calor de correlação para classes de lipídios no córtex e na medula, respectivamente, oferecendo tendências semelhantes.

Aliteração de Espécies de Lipídios Renais Individuais por Tratamento com Cisplatina. Efeito atenuante de cilastatina

Ésteres de ColestesolAnálise de cinco espécies individuais de CE (CE 18:1, CE 18:2, CE 18:0, CE 20:4 e CE 22:6) realizadas norenalcórtex e medula revelou que a cisplatina aumentou significativamente cada um deles em comparação com os níveis de controle (Figura 3). Por outro lado, a coadministração de cilastatina e cisplatina levou a uma diminuição geral nos níveis de espécies individuais de CE em relação ao tratamento com cisplatina, o que foi estatisticamente significativo para todas as espécies de CE no córtex e CE 18:2 na medula, como pode ser observado visto na Figura 3. Esta recuperação nas espécies de CE do córtex devido à co-assentamento de cilastatina foi parcial em comparação com os níveis do grupo de controle, enquanto nenhuma recuperação estatisticamente significativa na maioria das espécies de CE de Medella (exceto CE 18:2) foi observada para a coadministração de cilastatina comparado com a cisplatina. Os resultados completos da análise estatística sobre as espécies lipídicas do córtex e da medula são mostrados nas Tabelas S2 e S3, respectivamente.

Esfingolipídeos: Cer, dhCer, HexCer, dhHexCer, SM, dhSM e SulfUm total de 43 espécies de esfingolipídeos foram quantificados norenalcórtex e medula para avaliar o impacto do tratamento com cisplatina e cilastatina em seus níveis, conforme mostrado na Figura 4. Em relação às espécies Cer (Figura 4A), dhCer (Figura 4B), HexCer (Figura 4C) e dhHexCer (Figura 4D), como pode ser visto, o tratamento com cisplatina resultou em um aumento significativo em 19 espécies de três classes norenalcórtex e medula. Mais uma vez, o co-tratamento com cisplatina e cilastatina mostra uma tendência para atenuar o efeito da cisplatina, com uma diminuição geral nos níveis de lípidos alterados por cisplatina no córtex e na medula. De fato, para as espécies dhCer (Figura 4B) e dhHexCer (Figura 4D), não foi observada diferença entre os grupos tratados com cisplatina mais cilastatina e grupos de controle para aquelas espécies alteradas com cisplatina, indicando uma recuperação completa. No caso de Cer (Figura 4A) e HexCer (Figura 4C), essa recuperação também ocorreu para algumas espécies alteradas, como HexCer 34:1 (córtex e medula) e HexCer 38:1 e HexCer 42:1 (medula ); Cer 36:1, Cer 38:1, Cer 40:1, Cer 42:1 e Cer 42:2 no córtex; e Cer 34:1 e Cer 42:2 na medula, sendo total ou parcialmente recuperados. Por outro lado, o tratamento com cisplatina mais cilastatina ainda mostrou diferenças significativas em relação aos grupos controle para Cer 36:1, Cer 38:1, Cer 40:1, Cer 42:1 e HexCer 36:1 na medula, sem recuperação, apontando a um efeito de recuperação muito melhor exercido pela cilastatina no córtex do que na medula para Cer e HexCer.

No caso das espécies SM (Figura 4E) e dhSMt (Figura 4F), a cisplatina levou a uma diminuição no córtex e na medula para as espécies de cadeia mais curta e mais longa, o que foi estatisticamente significativo para SM 34:1, dhSM 34:{{ 5}}, SM 42:2, SM 42:1 e dhSM 42:1. Em contraste, o efeito observado para o tratamento com cisplatina nas espécies de cadeia intermediária SM e dhSM no córtex e na medula foi um aumento, o que foi estatisticamente significativo para dhSM 36:0 (tanto no córtex quanto na medula) e dhSM 4{{ 15}}:0, SM 36:1, SM 38:1 e SM 40:1 na medula. A coadministração de cisplatina e cilastatina tendeu a normalizar os níveis de espécies SM e dhSM em muitos casos, com SM 34:1, SM 36:1, SM 38:1, SM 40:1, SM 42:2, SM 42:1, dhSM 36:0, dhSM 40:0 e dhSM 42:1 não mostrando diferença em relação aos grupos controle na medula. Finalmente, algumas espécies de Sulf também foram alteradas pelo tratamento com cisplatina norenalcórtex e medula, como mostrado na Figura 4G. Enquanto Sulf 40:1 foi significativamente aumentado tanto no córtex quanto na medula após o tratamento com cisplatina, outras espécies como Sulf-OH 40:1 ou Sulf-OH 42:2 de cadeia longa, Sulf-OH 42:2 estavam diminuídos no córtex, com Sulf 42:0 e Sulf-OH 42:1 também diminuídos no córtex e na medula. Cilastatina coadministrada com cisplatina levou novamente a um leve efeito de recuperação, especialmente para Sulf 40:1 (córtex e medula) e Sulf 40:2 e Sulf-OH 42:1 (medula), não apresentando diferença em relação aos grupos controle.

Fosfolipídios: PC, PE e LPCA quantificação de 60 espécies de fosfolipídios (28 PC, 20 PE e 12 LPC) foi realizada norenalcórtex e medula para a avaliação de potenciais alterações induzidas pela cisplatina e efeito renoprotetor da cilastatina. Os resultados para as espécies de PC são mostrados na Figura 5A,B, respectivamente. Como pode ser visto, a cisplatina alterou significativamente até 19 espécies de PC no córtex ou na medula. A maioria dessas espécies de PC foi diminuída pela cisplatina, com exceção de PC 40:2, PC 40:4 e PC 34:2, que foram aumentadas no córtex. A fração de espécies de PC altamente insaturadas foi significativamente diminuída tanto na medula quanto no córtex, enquanto a fração de espécies contendo duas ligações duplas foi significativamente aumentada, como pode ser visto na Figura 5C,D. O tratamento com cisplatina e cilast atina mostrou efeitos semelhantes aos observados anteriormente, com algum efeito atenuante observado, em alguns casos levando a uma recuperação completa dos níveis de PC, sem diferenças significativas com o grupo controle, ou a uma recuperação parcial. Esta recuperação foi observada principalmente em Os resultados para a determinação de espécies de PE no córtex e na medula são mostrados na Figura 6A,B, respectivamente. Um total de 16 espécies de PE foram significativamente alteradas pela cisplatina no córtex ou na medula, com o maior número de espécies alteradas encontradas na medula. Na maioria dos casos, as espécies de PE foram diminuídas pelo tratamento com cisplatina, exceto PE 38:2, PE 40:6 e PE 40:4, que foram aumentadas no córtex, na medula ou tanto no córtex quanto na medula. respectivamente. Assim, considerando o comprimento total das cadeias de ácidos graxos nas espécies de PE na medula, a quantidade total de PE com 34, 36 e 38 C foi significativamente diminuída com cisplatina, enquanto as espécies de 40 C foram aumentadas, conforme ilustrado na Figura 6C . O co-tratamento de cilastatina com cisplatina atenuou a maioria das alterações induzidas por cisplatina em espécies individuais de PE encontradas na medula, oferecendo níveis sem diferenças significativas em comparação com grupos de controle em 11 das 15 espécies alteradas de cisplatina na medula, com mais 2 espécies de PE parcialmente recuperado. No entanto, no córtex, apenas 2 das 11 espécies alteradas com cisplatina foram recuperadas com cilastatina para níveis de controle, com 2 espécies de PE adicionais sendo parcialmente recuperadas. Semelhante às observações para espécies de PC, a fração de espécies de PE altamente insaturadas foi significativamente diminuída na medula, enquanto a fração de espécies contendo ligações duplas 1-3 foi significativamente aumentada, conforme mostrado na Figura 6D.

Em relação à análise de espécies de LPC, a maioria das alterações induzidas por cisplatina observadas foram encontradas norenalcórtex, onde LPC 16:1, LPC 16:0, LPC 18:1, LPC 18:0, LPC 20:3, LPC 22:6 e LPC 22:5 foram significativamente diminuídos com em relação às amostras de controle, como pode ser visto na Figura 7A. Por outro lado, LPC 17:1 e LPC 18:2 foram encontrados aumentados na medula durante o tratamento com cisplatina (Figura 7B). O co-tratamento com cisplatina e cilastatina não teve efeito de recuperação nas espécies de LPC do córtex. Por outro lado, LPC 17:1 e LPC 18:2 foram recuperados na medula, sem diferenças significativas em relação às amostras controle.

Lipídios Renais como Variáveis ​​de Classificação paraDanos nos rinse Proteção 

A análise multivariada foi realizada usando todas as variáveis ​​lipídicas medidas no córtex e na medula para avaliar se essas espécies poderiam servir para classificação de grupos e discernimento induzido por cisplatinadano renalenefroproteçãopela cilastatina. Análise de componentes principais (PCA) e projeções ortogonais para análise de discriminação de estruturas latentes (OPLS-DA) foram realizadas usando separadamente os lipídios do córtex ou da medula, conforme exibido na Figura 8. Análise de PCA do córtex (Figura 8A) e medula (Figura 8B) Os lipídios ofereceram aos modelos a capacidade de mostrar uma separação clara do grupo cisplatina em relação aos grupos controle e cilastatina, os dois últimos agrupando-se de perto. Por outro lado, o grupo tratado com cisplatina mais cilastatina tendia a se separar do grupo cisplatina e se localizava entre os grupos controle e cisplatina, sugerindo diferenças entre os grupos. Todos os modelos de PCA apresentaram R2 superior a 0,7 e valores de Q2 superiores a 0,5.

A análise OPLS-DA multigrupo também mostrou agrupamentos claramente separados dos diferentes grupos usando variáveis ​​lipídicas do córtex (Figura 8C) ou da medula (Figura 8D). Os modelos OPLS-DA apresentaram valores de Q2 aceitáveis ​​e valores de R2 superiores a 0.7 e se mostraram válidos durante o teste de permutação para 100 iterações, conforme mostrado na Figura 8E,F. Características com importância variável na projeção (VIP) pontuações superiores a 1 podem ser encontradas na Figura 8G,H, indicando os lipídios do córtex ou da medula, respectivamente, que têm maior impacto na separação dos grupos. Estes incluíam diversas espécies lipídicas das classes CE, esfingolipídeos e fosfolipídios. Para determinar diferenças lipídicas específicas entre grupos individuais relacionadas ao tratamento com cisplatina enefroproteção, análise adicional de OPLS-DA foi realizada separadamente com lipídios do córtex e da medula, como pode ser visto nas Figuras 9 e 10, respectivamente. Modelos OPLS-DA foram construídos para cisplatina em comparação com o grupo controle, cisplatina mais cilastatina em comparação com cisplatina, bem como cisplatina mais cilastatina em comparação com o grupo de controle. Os modelos OPLS-DA mais discriminantes foram aqueles entre o controle e os grupos tratados com cisplatina ou cisplatina mais cilastatina, considerando seus maiores valores de R2 e Q2, com validação adequada com base nos resultados do teste de permutação com 100 ciclos (Figura 9A,B,D, E e Figura 10A,B,D,E).

Por outro lado, modelos OPLS-DA para grupos cisplatina mais cilastatina e cisplatina, ambos usando lipídios do córtex (Figura 9C) ou medula (Figura 10C), também permitiram a discriminação de grupos, com valores razoáveis ​​de R2 e Q2 e resultados de validação apropriados de 100-teste de permutação de ciclos (Figuras 9F e 10F), sendo os lipídios da medula os que apresentam melhor previsibilidade. S-plots para os diferentes modelos OPLS-DA estão incluídos na Figura 9G,H,I e Figura 10G,H,I, para características lipídicas do córtex ou da medula. Espécies com um |p(corr)| superiores a 0,5 e as pontuações VIP superiores a 1 foram marcadas nos S-plots como as características mais relevantes para a discriminação dos grupos. Dados completos, incluindo valores de p(corr) e VIP dos modelos OPLS-DA, juntamente com as estatísticas univariadas para cada espécie lipídica, podem ser encontrados nas Tabelas Suplementares S2 (lipídios do córtex) e S3 (lipídios da medula). Parece claro querenalOs lipídios do córtex e da medula podem servir como critérios discriminantes para a indução de cisplatina.dano renale para cilastatinanefroproteçãodurante o tratamento com cisplatina.

Lipídios renais como potenciais biomarcadores de dano renal induzido por cisplatina A fim de selecionar potenciais biomarcadores lipídicos de dano renal

causada pela cisplatina, foi empregada uma combinação de múltiplos critérios de valores de p estatisticamente significativos da análise univariada de cisplatina versus grupos controle, bem como valores de p(corr) e VIP encontrados no modelo OPLS-DA correspondente. Lipídios selecionados com valores de p < 0.05;="" fdr=""><0.1; |p(corr)|=""> 0,5 e VIP > 1 podem ser encontrados na Tabela 2 (lipídios do córtex) e na Tabela 3 (lipídios da medula), onde a mudança de dobra (FC) e áreas sob a curva (AUC) para curvas de características operacionais do receptor (ROC) também estão incluídas.

Como pode ser visto, até 40 lipídios da medula e 27 lipídios do córtex, compreendendo CE, esfingolipídeos e espécies de fosfolipídios, são selecionados nas Tabelas 2 e 3, respectivamente. Os valores de AUC das curvas ROC obtidos para cada lipídio foram superiores a 0,85 e, na maioria dos casos, próximos de 1, indicando boa capacidade de discriminação da espécie entre os grupos cisplatina e controle. Notavelmente, as espécies de CE com aumento de cisplatina (CE 18:1, CE 18:2, CE 18:0, CE 20:4 e CE 22:6) parecem ser as mais discriminantes características tanto na medula quanto no córtex, mostrando os valores mais altos de FC, VIP, p(corr) e AUC. dhHexCer 34:0 é outro lipídio aumentado no córtex com alta FC e pontuações relevantes. Por outro lado, sulfatos como Sulf 42:0, Sulf-OH 40:1 ou Sulf-OH 42:1 também são bastante relevantes no córtex, enquanto PE 36:5, PE 38:6, PE 38:5 PC 36:5 ou PC 36:6 ​​também são muito importantes na medula, todos diminuindo durante o tratamento com cisplatina.

Lipídios Renais como Biomarcadores Potenciais da Nefroproteção da Cilastatina

Para selecionar potenciais biomarcadores lipídicos de proteção da cilastatina contra a nefrotoxicidade da cisplatina, a mesma abordagem de múltiplos critérios da Seção 2.5, foi aplicada usando análise univariada de grupos de cisplatina mais cilastatina versus cisplatina e valores de p(corr) e VIP encontrados no OPLS- correspondente Modelo DA. Lipídios selecionados com valores de p < 0.05;="" fdr=""><0.1; |p(corr)|=""> 0,5 e VIP > 1 podem ser encontrados na Tabela 4 (lipídios do córtex) e na Tabela 5 (lipídios da medula), onde também foram calculados FC e AUC para as curvas ROC.

Como pode ser visto na Tabela 4, todas as espécies CE (CE 18:1, CE 18:2, CE 18:0, CE 20:4 e CE 22:6) no córtex pode ser considerado como o mais poderoso indicador da proteção exercida pela cilastatina, reduzindo significativamente, ao mesmo tempo, as alterações induzidas pela cisplatina. PE 36:5 e dhHexCer 34:0 no córtex também são importantes biomarcadores potenciais de proteção da cilastatina, especialmente esta última, que sofre uma recuperação total devido à cilastatina para níveis de controle. Em relação aos lipídios da medula, conforme apresentado na Tabela 5, foi encontrada maior quantidade de potenciais biomarcadores de proteção da cilastatina do que no córtex. Notavelmente, Sulf 40:2 parece ser a espécie mais discriminante na medula, considerando suas pontuações mais altas de FC e VIP. Diversas espécies de PC e PE também foram encontradas, incluindo PE 36:5, PE 38:5, PE 38:6, PE 36:4, PE 34:3 e PC 36:6, para citar algumas, além de Cer 42:2, dhHexCer 36:0 e HexCer 34:1, como biomarcadores significativos de proteção da cilastatina na medula. Em todos os casos, esses lipídios foram associados a uma recuperação parcial ou total induzida por cilastatina dos níveis de controle em comparação com seus níveis alterados pela cisplatina. Para todas as espécies, os valores de AUC para curvas ROC obtidos foram superiores a 0,85, comprovando sua boa capacidade de discriminação

DiscussãoNeste trabalho, quantificamos um total de 108 espécies de lipídios compreendendo importantes lipídios estruturais, como fosfolipídios, esfingolipídios e colesterol, juntamente com suas formas esterificadas.rimcórtex e medula de ratos tratados com cisplatina e/ou cilastatina. Isso foi realizado para melhor compreender o efeito nefrotóxico da cisplatina e o efeito protetor da cilastatina. Até 63 espécies lipídicas foram significativamente alteradas na medula pelo tratamento com cisplatina, enquanto 56 espécies lipídicas foram afetadas no córtex, refletindodano renalem ambas as regiões. Embora, tradicionalmente, a maioria dos estudos de LRA induzida por cisplatina se concentre em células do túbulo proximal erenaldanos no córtex, onde o acúmulo de drogas é principalmente focado, estudos recentes apontam para o fato de que a lesão na medula pode até ser tão grave quanto no córtex, com base em ensaios de apoptose TUNEL [5]. Isso pode estar relacionado ao acúmulo de cisplatina no segmento S3 dos túbulos proximais [3,5], descendo em direção à medula externa, além do potencial dano direto e secundário da alça de Henle [4]. Além disso, a medula foi apontada como a mais sensívelrenalárea para observar alterações metabólitos globais relacionadas à cisplatina em comparação com o córtex [5]. Nossos resultados anteriores também apontaram para um dano direto das células da medula (além do dano secundário) pela cisplatina, refletido em diversas alterações de fosfolipídios e cardiolipinas [4]. Esses novos resultados expandem essas observações com espécies e classes lipídicas adicionais alteradas pela cisplatina e reforçam a relevância do dano medular na LRA induzida por cisplatina.

Embora FC emrimnão foi significativamente alterada pelo tratamento com cisplatina, tanto a CE total quanto todas as espécies de CE individuais medidas foram notavelmente aumentadas no córtex (aumento de oito vezes para CE total) e medula (aumento de quatro vezes para CE total) em associação com a cisplatina induzidadano renal.O colesterol é um componente chave das membranas plasmáticas, interlocando-se entre os fosfolipídios e influenciando a fluidez, a carga superficial e as interações dos grupos polares [35,36]. Sua presença também é fundamental em jangadas lipídicas, estabelecendo interações hidrofóbicas com SM, sendo essencial para a segregação de moléculas e para controlar sua interação com outros componentes da membrana [37]. As células mantêm um equilíbrio de colesterol entre a síntese de novo no retículo endoplasmático (ER) e a captação mediada por LDL. A maior parte do colesterol está localizada na membrana plasmática, mas também pode retornar ao RE, onde o FC pode ser convertido (através da esterifificação mediada por ACAT) em CE, que é considerado uma forma de armazenamento citosólico do colesterol [36]. CE também pode ser hidrolisado de volta a FC, constituindo o ciclo do éster de colesterol [36]. O fato de a FC não ter sido alterada durante o tratamento com cisplatina, mas a CE estar aumentada tanto no córtex quanto na medula, sugere uma alteraçãorenalmetabolismo do colesterol associado à IRA induzida por cisplatina. Estudos anteriores mostraram observações bastante semelhantes em células do túbulo proximal humano HK-2 e no córtex renal de camundongos, durantelesão renal, com FC inalterada e níveis aumentados de CE [36]. Nesse caso, a lesão da membrana plasmática, desencadeando o aumento do tráfego de FC da membrana para o RE, parecia ser a explicação mais plausível, resultando em uma geração crescente de CE. A este respeito, o dano às balsas lipídicas ricas em colesterol, em vez da membrana plasmática, parece ser mais eficaz no aumento do tráfego de colesterol para o ER [36]. Um papel citoprotetor da CE também foi implicado em tais estudos anteriores. Um aumento nos níveis de CE também foi relatado no ratorenalcórtex cerebral durante a nefropatia diabética em estágio inicial [29]. Os resultados também estão de acordo com um aumento global de lipídios neutros emrenaltúbulos proximais relatados durante o tratamento com cisplatina [32]. Nossos resultados apontam pela primeira vez para um aumento global no total de CE, além de espécies individuais de CE, tanto norenalcórtex e medula, durante LRA induzida por cisplatina. A própria cilastatina, por outro lado, pareceu aumentar ligeiramente CE 18:0 e CE 22:6 apenas no córtex, embora os níveis totais de FC ou CE não tenham sido alterados. Este pequeno efeito pode ser devido ao fato de que seu alvo, DHP-I, está localizado nas balsas lipídicas no túbulo proximal (principalmente no córtex), e algum pequeno distúrbio da membrana pode estar implicado durante sua interação. A coadministração de cisplatina e cilastatina, por outro lado, levou a uma redução em todas as espécies de CE aumentadas por cisplatina no córtex, enquanto na medula, quase nenhum efeito de recuperação foi observado, com apenas uma recuperação parcial de CE18:2 . Isso aponta para a ação específica da cilastatina nas células do túbulo proximal, exercendo uma proteção significativa da expansão da morte celular relacionada ao dano direto da cisplatina na membrana plasmática e nas balsas lipídicas no córtex, enquanto o dano celular relacionado ao desequilíbrio do colesterol em toda a medula parece permanecer em grande parte desprotegido.

Os esfingolipídeos são lipídios ativos encontrados principalmente nas membranas celulares e são bastante ricos em jangadas lipídicas [37]. As ceramidas são os metabólitos centrais do metabolismo dos esfingolipídios, envolvendo diversas moléculas e enzimas com papéis importantes nos processos celulares, incluindo crescimento celular, apoptose, diferenciação, resistência a drogas e senescência [38,39]. Além disso, os esfingolipídios participam das vias relacionadas à morte das células cancerígenas da cisplatina e à IRA [33]. As ceramidas podem ser geradas por várias vias, incluindo síntese de novo, hidrólise de esfingomielina ou reciclagem de esfingolipídeos complexos [38]. A síntese de novo é a principal via e ocorre no RE, a partir de palmitoil-CoA e serina, através de uma série de vias enzimáticas para produzir esfinganina, que leva a diidroceramidas por meio da diidroceramida sintase (CerS). Finalmente, a dessaturação de dhCer gera Cer [40]. O SM também pode ser hidrolisado por esfingomielinases, produzindo Cer. Cer pode ser transformado em esfingolipídeos mais complexos no aparelho de Golgi: fosforilado para gerar Cer-1-P, uma molécula sinalizadora; convertido em SM pela ação da SM sintase; ou glicosilados para produzir hesoxilceramidas (glucosil- ou galactosil-ceramidas), precursores de sulfamidas [38]. Cer também pode ser degradado em esfingosina, um precursor de esfingosina-1-fosfato (S1P), com papéis importantes na sobrevivência e proliferação celular, inflamação e resistência a drogas [39]. Finalmente, a degradação de S1P em etanolamina e hexadecenal é a via de saída desta rota [38].

Durante a quantificação das espécies de esfingolipídeos, um aumento global nos níveis totais de Cer, dhCer, HexCer e dhHexCer foi observado durante o tratamento com cisplatina, o que foi especialmente relevante para Cer. Diferenças em relação ao controlerimforam mais óbvios quando subespécies individuais foram quantificadas, com 19 das 22 espécies sendo aumentadas no córtex (11 espécies) e/ou medula (18 espécies) com tratamento com cisplatina. Isso está de acordo com observações anteriores que apontam para um aumento de Cer e HexCer no camundongorenalcórtex associado ao tratamento com cisplatina [33], mas aqui, descobrimos que a medula também é afetada por esse efeito.

Essas observações podem refletir um aumento da produção metabólica de Cer/dhCer e HexCer/dhHexCer. Por um lado, isso pode ocorrer através do aumento da atividade do CerS, à luz de observações anteriores norenalcórtex, onde a atividade de CerS de cadeia longa foi medida durante o tratamento com cisplatina e a inibição de CerS levou a uma redução no acúmulo observado de Cer/HexCer [33]. Além disso, uma redução induzida por cisplatina nos níveis de SM/dhSM encontrados no córtex e na medula sugere um aumento adicional na produção de Cer/dhCer por hidrólise de SM/dhSM através da via da esfingomielinase (SMase) [38], com impacto especial na Cer/dhCer de cadeia longa, sendo todos prejudiciais em modelos de LRA [40]. Isso também estaria de acordo com o fato de que espécies de Cer de cadeia longa parecem ser relevantes durante AKI [40] e com observações anteriores de uma atividade aumentada de SMase norenalcórtex durante o tratamento com cisplatina [33]. Cer está envolvido na apoptose induzida por cisplatina via sinalização em vias intrínsecas e extrínsecas [39]. Na via mitocondrial intrínseca, a cisplatina causa permeabilização da membrana externa mitocondrial. O aumento de Cer, juntamente com seus metabólitos a jusante, pode contribuir para essa permeabilização, e a formação de canais por Cer facilita a apoptose na membrana mitocondrial, permitindo a entrada de Bax na membrana externa mitocondrial, bem como a saída de citocromo C [39]. Além disso, a apoptose extrínseca mediada por Fas emprega o receptor Fas localizado nas jangadas lipídicas, com seu agrupamento sendo mediado pela ativação de SMase causada por cisplatina e elevação de Cer [39]. Portanto, Cer determina apoptose na LRA induzida por cisplatina, enquanto seu nivelamento através de sua transformação em HexCer parece ser protetor [33] e está associado à resistência à cisplatina [39]. Cer gerado em grandes quantidades também pode afetar as propriedades físicas das membranas e pode deslocar o colesterol e conduzir sua esterifificação [35]. Por outro lado, o SM está presente principalmente nas membranas plasmáticas e tem uma associação direta com as moléculas de colesterol, especialmente importante em jangadas lipídicas [41]. A falta de regeneração de SM pode ser negativa para a função adequada da membrana [41].

Sulfe são abundantes norim,especialmente na membrana apical dos túbulos distais [42]. Embora não sejam essenciais para o normalfunção renal, descobriu-se que uma deficiência de Sulf é compensada pelo aumento da geração de glicolipídios sulfatados e colesterol [42]. O sulfato é um ligante chave da L-selectina norim,com um papel vital na infiltração de monócitos noriminterstício [42]. Por outro lado, a mielina e a proteína linfocitária (MAL) associadas à balsa lipídica formam complexos com sulfatos e glicoesfingolipídeos emrenalmembranas, contribuindo para a estabilização e classificação de microdomínios enriquecidos com glicoesfingolipídeos [42]. Nossos resultados sobre as alterações de Sulf no córtex e na medula confirmam estudos anteriores em que diversas espécies de sulfatídeos também foram alteradas pela cisplatina no rim [34].

Todas as espécies de Cer, dhCer, HexCer e dhHexCer alteradas no córtex pela cisplatina foram parcial ou totalmente recuperadas pela coadministração de cilastatina, enquanto na medula grande quantidade de espécies de Cer não foi recuperada, com recuperação quase completa de dhCer , HexCer e dhHexCer. Considerando o envolvimento de espécies de Cer na apoptose extrínseca mediada por Fas e seu bloqueio pela ligação da cilastatina ao DHP-I em jangadas lipídicas no túbulo proximal, isso poderia explicar o efeito protetor e a recuperação de Cer ocorrendo principalmente nas células do córtex. Já para SM, dhSM e Sulf, a recuperação da cilastatina parece ser mais relevante na medula do que no córtex, sugerindo que o dano secundário é prejudicado pela ação da cilastatina nos túbulos proximais que atingem a medula externa, onde a maioriadano renalé concentrado [4].

Os fosfolipídios são as espécies mais abundantes nas membranas celulares, onde predominam PC e, em menor grau, PE, com maior presença de PC no lado luminal e PE sendo mais abundante no folheto citosólico [35,43]. Os lisofosfolipídios são, por outro lado, espécies sinalizadoras que podem ser geradas a partir da hidrólise de glicerofosfolipídios, incluindo LPC [35]. A maioria das 60 espécies de PC, PE e LPC quantificadas foram alteradas pelo tratamento com cisplatina, tanto no córtex quanto na medula, com PC e LPC apresentando maior quantidade de alterações no córtex, enquanto as alterações associadas a PE foram mais numerosas e proeminente na medula. Alterações derenalAs espécies PC, PE ou LPC como resultado do tratamento com cisplatina estão de acordo com observações relatadas anteriormente emrimdurante a LRA [4,5,26,34,44]. Nossos resultados indicam que a maioria das espécies alteradas de PE, PC e LPC foram diminuídas pela cisplatina tanto no córtex quanto na medula. Em relação ao efeito nefroprotetor da cilastatina, surpreendentemente, um grau maior de efeito de recuperação parcial ou total foi observado na medula para os lipídios alterados pela cisplatina do que no córtex. Outro fato interessante é que todas as espécies de PC, PE e LPC aumentadas de cisplatina no córtex e na medula foram recuperadas pela cilastatina, enquanto a maioria das espécies diminuídas de cisplatina no córtex ainda foram alteradas durante o co-tratamento com cilastatina. Isso pode indicar um maior grau de dano direto causado pelo acúmulo de cisplatina no córtex, permanecendo desprotegido pela cilastatina e levando à morte celular e associada a PC, PE (os principais componentes da membrana celular) e liberação de LPC em corpos apoptóticos e, portanto, a redução em seus níveis. Em contraste, danos secundários associados à apoptose extrínseca e consequente acúmulo de proteínas nos túbulos proximais podem ser protegidos pela cilastatina. Isso implicaria que as espécies PC, PE e LPC diminuíram na medula e estão mais relacionadas ao dano celular secundário causado pela cisplatina. Por outro lado, o aumento das espécies de PC, PE e LPC pode estar associado à regeneração da membrana celular ou a processos de sinalização, o que, de acordo com esses resultados, pode estar mais relacionado à apoptose extrínseca secundária a danos causados ​​por cisplatina protegidos por cilastatina.

Além disso, também foi observada uma diminuição induzida pela cisplatina na porcentagem de espécies de PC e PE com cadeias gordurosas altamente insaturadas, o que pode estar relacionado a processos de peroxidação lipídica, e seria reduzido pela cilastatina [4,10,11].

Globalmente, dentro das espécies lipídicas aqui quantificadas, o efeito de recuperação da cilastatina foi observado em 26 de 56 lipídios alterados por cisplatina no córtex e em 50 de 63 lipídios alterados por cisplatina na medula. Talvez isso reflita um alto grau de alterações lipídicas associadas a danos mitocondriais diretos desprotegidos exercidos pela cisplatina principalmente no córtex em comparação com a medula, com mais alterações lipídicas associadas à proteção contra danos secundários detectadas em toda a medula. Além disso, a análise multivariada permitiu a identificação de potenciais novos biomarcadores lipídicos tanto para LRA induzida por cisplatina quanto para cilastatinanefroproteção, incluindo as espécies CE, Sulf, PE, PC, Cer ou HexCer, conforme descrito nas Seções 2.5 e 2.6. A partir de nossos achados, CE 18:2 e PE 36:5 são possíveis biomarcadores candidatos capazes de discernir ao mesmo tempo o dano da cisplatina e a cilastatinanefroproteçãotanto no córtex como na medula. No entanto, como a recuperação dessas duas espécies com cilastatina é parcial, espécies mais apropriadas como biomarcadores seriam dhHexCer 34:0 no córtex e Sulf 42:0 na medula, sendo capazes de distinguir ambasdano renale proteção, com a cilastatina recuperando totalmente seus níveis alterados de cisplatina aos do grupo controle. Isso pode ser extrapolado para qualquer lesão renal mediada por ligante Fas/Fas, mas deve ser confirmado em estudos futuros. Vários novos biomarcadores de LRA foram propostos nos últimos anos, principalmente proteínas (por exemplo, KIM-1 [45] ou NGAL [46]). O fato de termos encontrado potenciais novos biomarcadores de IRA induzida por cisplatina e proteção associada à cilastatina, de natureza lipídica emrimtecido, amplia o conhecimento existente e oferece opções complementares para um melhor diagnóstico, prognóstico e acompanhamento. De fato, uma combinação de detecção de biomarcadores pode até potencialmente ser usada como indicação de uma LRA específica causada por um determinado nefrotóxico (como cisplatina) ou outra causa, e até mesmo distinguir o estado/progressão da doença. Outro passo adiante seria determinar se nossos resultados sobre alteraçõesrenalos padrões lipídicos também se refletem nos lipídios circulantes no sangue ou na urina. Isso tornaria a detecção de biomarcadores para LRA induzida por cisplatina e cilastatinanefroproteçãomais viável em pacientes.

As alterações nos níveis lipídicos induzidas pela cisplatina nos níveis lipídicos são numerosas e diversas, compreendendo importantes lípidos estruturais ao nível completo.renalestrutura: o córtex e a medula. A atenuação de muitas dessas alterações pela cilastatina mostra seu grande potencial para melhorarfunção renale reduzindo as alterações estruturais relacionadas com os lípidos, em correlação com uma normalizaçãorenalmorfologia. Novamente, a cilastatina provou ser útil para discernir danos celulares diretos desprotegidos causados ​​por cisplatina e alterações secundárias relacionadas a danos primários, que podem ser prejudicados nos túbulos proximais pelo bloqueio de cilastatina da via apoptótica mediada por Fas

Materiais e métodos

ReagentesCilastatina (gentilmente cedida pela Merck Sharp e Dohme SA, Madri, Espanha) e cisplatina (Pharmacia Nostrum (Madri, Espanha) foram empregadas. Uma solução de NaCl de {{0}},9 por cento (Braun Medical SA, Barcelona, Espanha) foi usado para preparação de soluções de drogas para administração. N-dodecanoil-D-eritro-esfingosilfosforilcolina [SM 30:1 (d18:1/12:0)], D-glucosil- ß-1,10-N-dodecanoil-D-eritro-esfingosina [HexCer 30:1 (d18:1/12:0)], N-dodecanoil D -eritro esfinganilfosforilcolina [dhSM 3{{50}}:0 (d18:0/12:0)], 1,2-dimiristoleoil-sn glicero-3- fosfocolina [PC 28:2 (14:1/14:1)], 1-heptadecanoil-2-hidroxi-sn-glicero-3- fosfocolina [LPC (17:0)], e 1, 2- dipalmitoleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina [PE 32:2 (16:1/16:1)] foram adquiridos da Avanti Polar Lipids (Alabastro, Alabama, EUA). N-tetracosanoil- deuterado D-eritro-esfingosina [Cer 42:1-d7 (d18:1/24:0)], N-estearoil D-eritro-di-hidroesfingosina [dhCer (36:0-d3)] , e C16-30-sulfogalactosilceramida [Sulf 34:1(d18:1/16:0)] foram adquiridos da Matreya LLC (State College, PA, EUA). Colesterol-d7 (FC-d7) e palmitato de colesterol-d7 [CE (16:0-d7)] foram da Sigma-Aldrich.

Solventes e reagentes de grau HPLC ou LC-MS foram empregados exclusivamente, incluindo metanol (MeOH), acetonitrila (ACN) e isopropanol (iPrOH) (VWR International Eurolab, Barcelona, ​​Espanha), bem como clorofórmio, diclorometano e amônio para mate (NH4COOH) (Sigma-Aldrich, Merck Life Science SL, Madrid, Espanha). A água ultrapura foi obtida a partir de um sistema de purificação Milli-Q (Millipore, Merck Life Science SL, Madrid, Espanha).

Modelo AnimalRatos Wistar machos adultos (WKY, Criffa, Barcelona, ​​Espanha) foram criados no Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón (IiSGM, Madrid, Espanha). Estes foram mantidos sob condições controladas de temperatura, luz e umidade, com livre acesso a comida e água. Os tratamentos foram administrados por via intraperitoneal como descrito anteriormente [4,11] a quatro grupos de ratos (n=6 animais por grupo): Grupo 1: Controle (CNT)—0,9 por cento de NaCl foi injetado no ratos da mesma forma que os tratamentos para os grupos 3 e 4; Grupo 2: Cilastatina (CIL) injetada (150 mg kg 1 de peso corporal (pc) por dia); Grupo 3: Injetado com cisplatina (CISPL) (uma dose única de 5 mg kg 1 pc no dia 0); e Grupo 4: Cisplatina mais cilastatina (CISCIL) - injetada 5 mg kg 1 pc no dia 0 e injetada com cilastatina (150 mg kg 1 pc por dia). Os animais foram sacrificados cinco dias após o início do tratamento. Antes disso, a urina de 24 h foi coletada em gaiolas metabólicas de cada rato. O soro sanguíneo também foi isolado por centrifugação. Os rins foram removidos após perfusão com solução salina 0,9 por cento a 4 ◦C, seguida de decapsulação. O córtex e a medula do lado esquerdorime a metade transversalmente seccionada da direitarimforam excisados, congelados em N2 líquido e finalmente armazenados a t 80 ◦C. A outra metade da direitarimfoi fixado em paraformaldeído a 4 por cento e embebido em parafifina para estudos histológicos.

Estudos histológicosA coloração de hematoxilina/eosina (Sigma-Aldrich, Steinhem, Alemanha) foi realizada em rato sagital de 5 µmrimSeções. Um microscópio invertido IX70 (Olympus, Hamburgo, Alemanha) foi usado para tirar microfotografias com aumento de 20x e 60x, para exame histológico.

Indicadores de função renalUm AutoAnalyzer Cobas 711 (Roche, Basel, Suíça) foi empregado para determinação de BUN, creatinina, sódio e potássio em amostras de soro. A taxa de depuração de creatinina foi usada para o cálculo da TFG. A proteína total foi determinada na urina usando o método do ácido sulfosalicílico [47].

Homogeneização de tecidos  Rimtecidos de córtex e medula (aproximadamente 50 mg cada) foram adicionados a tubos de plástico com tampa de rosca de 1,5 mL contendo 800 µL de solução tampão de lise: 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 125 mM NaCl, 5 mM NaF, 1,4 mM Na4O7P2, 1 mM Na3VO4, e inibidor de protease (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, EUA), e esferas de zircônio de 1,5 mm. Os tecidos foram desagregados em um homogeneizador BeadBug-6 (Benchmark D1036-E, Bechmark Scientifific, Sayreville, NY, EUA) a 4500 rpm, em três ciclos de 90 s. O homogenato foi ainda sonicado por 40 s a 10 por cento de amplitude e centrifugado a 600 × g por 1 min a 4 ◦C. Uma alíquota do sobrenadante resultante foi diluída 1:10 para determinação de proteína total pelo ensaio de proteína de ácido bicinconínico (BCA) (Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL, EUA). O restante do extrato protéico foi armazenado a t 80 ◦C até a análise lipidômica.

Análise Lipidômica por LC-MS/MSOs lipídios foram extraídos dos tecidos (equivalente a 250 µg de proteína total) seguindo o método de Folch [48]. Dez microlitros de uma mistura de padrão interno (IS) foram adicionados antes da extração lipídica para obter a quantificação molar relativa das espécies lipídicas, conforme descrito anteriormente [49]. A mistura IS consistia no seguinte: CE (16:0-d7), FC-d7, Cer (42:{{10}} d7), HexCer (30 :1), LPC (17:0), PC (28:2), PE (32:2), SM (30:1), dhSM (30:0), dhCer (35:0) e Sulf (34 :1), nas concentrações indicadas na Tabela S4. Os extratos lipídicos foram secos sob uma corrente de nitrogênio e reconstituídos em 250 µL de acetonitrila/isopropanol (1:1, vol:vol), sonicados por 10 min e depois transferidos para um frasco de injeção.

Cinco microlitros do extrato lipídico foram injetados em um sistema LC Eksigent UltraLC{{0}} (AB-Sciex LLP, Framingham, MA, EUA). As espécies foram separadas em uma coluna Kinetex C18 (100 × 2,1 mm, 1,7 µm; Phenomenex, Macclesfifield, Reino Unido) operando a 55 ◦C. A eluição foi aplicada usando uma mistura binária de solvente A (60 por cento de acetonitrila em água, 10 mM de NH4COOH) e solvente B (90 por cento de álcool isopropílico em acetonitrila, 10 mM de NH4COOH) e um gradiente linear de 60 por cento de A a 100 por cento de B em 12 min e 100 por cento B a 60 por cento A em 8 min, a uma taxa de fluxo de 0,4 mL min.1. Um instrumento QTrap 4000 (AB-Sciex LLP, Framingham, MA, EUA) foi usado para detecção de lipídios, com o software Analyst 1.6.2. O nitrogênio foi empregado tanto como gás de secagem (T: 500 ◦C, pressão: 30 psi) quanto como gás de nebulização (50 psi). A detecção foi definida no modo positivo de eletrospray (ESI) para todas as classes de lipídios, com exceção do Sulf, que foi analisado no modo negativo de ESI. CE e FC foram analisados ​​usando a fonte de ionização química à pressão atmosférica (APCI) no modo de íon positivo. Uma abordagem direcionada foi usada para a detecção de lipídios definindo transições de monitoramento de reação múltipla (MRM) para cada espécie de lipídio em seus tempos de retenção (Tabela S5). Os cromatogramas de pico LC-MS/MS foram processados ​​usando o software Skyline versão 4.1 (MacCoss Lab, Seattle, WA, EUA) [50]. As espécies lipídicas foram quantificadas por comparação direta da área de cada espécie com a área do IS para sua classe lipídica, conforme descrito anteriormente [49]. Os resultados foram expressos em nmol/mg de proteína. Os níveis de classe de lipídios totais foram determinados como a soma das espécies de classes de lipídios individuais quantificadas. As espécies lipídicas foram designadas de acordo com a notação recomendada [51].

Análise estatísticaOs valores foram expressos como média ± desvio padrão. O SPSS 11.5 (SPSS, Chicago, IL, EUA) foi utilizado para estatística descritiva e avaliação das diferenças estatísticas nas variáveis ​​entre os grupos por meio de análise de variância. Para comparação de variáveis ​​lipídicas em dois grupos não pareados, foram realizados testes paramétricos (t de Student não pareado bicaudal) ou não paramétricos (Mann-Whitney) após teste de normalidade (Shapiro-Wilk). O método de Benjamini-Hochberg foi usado para correção da taxa de descoberta falsa (FDR) de valores de p ao comparar várias espécies de lipídios individuais. Um valor de p bilateral < 0.05="" e="" fdr="">< 0,1="" foram="" considerados="" para="" a="" identificação="" de="" diferenças="" estatisticamente="" significativas="" para="" evitar="" a="" perda="" de="" potenciais="" candidatos="" a="" biomarcadores.="" a="" mudança="" de="" dobra="" do="" grupo="" x="" versus="" grupo="" y="" foi="" calculada="" como="" a="" razão="" dos="" valores="" médios="" para="" as="" variáveis="" ​​dos="" respectivos="" grupos="">

A análise de dados multivariados (MVDA) foi realizada usando SIMCA versão 14.1 (MKS Umetrics, Uppsala, Suécia) e MetaboAnalyst 5.0 (https://www.metaboanalyst.ca (acessado em 30 2 de setembro) {{20}}21)) [52], incluindo PCA não supervisionado e OPLSDA supervisionado. Os valores ausentes foram substituídos usando o método dos k-vizinhos mais próximos. As variáveis ​​foram transformadas em logaritmo e dimensionadas em pareto antes do MVDA. Os modelos foram avaliados de acordo com seus valores de R2 e Q2. OPLS-DA foi validado pelo teste de permutação (100 ciclos). Pontuações VIP e S-plots de modelos OPLS-DA foram usados ​​para identificar variáveis ​​relevantes na discriminação de grupos CISPL versus CNT, CISCIL versus CNT e CISCIL versus CISPL. Conformidade simultânea com VIP > 1, carregamentos dimensionados como coeficiente de correlação |p(corr)| > 0,5 e valor de p bilateral < 0,05="" e="" fdr="">< 0,1="" para="" comparação="" de="" dois="" grupos="" foram="" os="" critérios="" empregados="" para="" a="" seleção="" potencial="" de="" biomarcadores.="" os="" valores="" de="" auc="" foram="" obtidos="" a="" partir="" dos="" gráficos="" da="" curva="">

PatentesAs seguintes patentes estão parcialmente relacionadas ao trabalho apresentado neste manuscrito: "Uso de cilastatina para reduzir a nefrotoxicidade de vários compostos" (números de patente EP2.143.429 B1; US ​​9.216.185 B2; US 9.522.128 B2; e US 9.757.349 B2). Estes são atribuídos à Fundación para la Investigación Biomédica Hospital Gregorio Marañón (FIBHGM) e licenciados pela FIBHGM para a Telara Pharma SL A Telara Pharma SL atualmente celebrou um contrato de licenciamento com a Arch Biopartners.