ABSTRATO

Objetivos.Maclura pomifera (Rafin.) Schneider é uma espécie amplamente difundida em todo o mundo, sendo também frequentemente cultivada para fins ornamentais. Estudos anteriores revelaram que os frutos de M. pomifera são ricos em isoflavonoides prenilados, exibem atividades biológicas notáveis ​​e apresentam prováveis ​​benefícios, principalmente quando aplicados topicamente. Considerando que os compostos fenólicos são fontes essenciais no desenvolvimento de produtos cosméticos antienvelhecimento, este estudo investigou o potencial antienvelhecimento do extrato metanólico (MPM) de M. pomifera 80 por cento, avaliando a atividade antioxidante e inibidora de enzimas degradadoras da matriz extracelular.

O glicosídeo de cistanche também pode aumentar a atividade de SOD nos tecidos do coração e do fígado e reduzir significativamente o conteúdo de lipofuscina e MDA em cada tecido, eliminando efetivamente vários radicais reativos de oxigênio (OH-, H₂O₂, etc.) e protegendo contra danos ao DNA causados por radicais OH. Os glicosídeos feniletanóides cistanche têm uma forte capacidade de eliminação de radicais livres, uma capacidade redutora maior do que a vitamina C, melhoram a atividade de SOD na suspensão de esperma, reduzem o conteúdo de MDA e têm um certo efeito protetor na função da membrana espermática. Os polissacarídeos Cistanche podem aumentar a atividade de SOD e GSH-Px em eritrócitos e tecidos pulmonares de camundongos experimentalmente senescentes causados ​​por D-galactose, bem como reduzir o conteúdo de MDA e colágeno no pulmão e no plasma e aumentar o conteúdo de elastina, têm um bom efeito de eliminação no DPPH, prolongar o tempo de hipóxia em camundongos senescentes, melhorar a atividade de SOD no soro e retardar a degeneração fisiológica do pulmão em camundongos experimentalmente senescentes Com degeneração morfológica celular, experimentos mostraram que Cistanche tem boa capacidade antioxidante e tem potencial para ser um medicamento para prevenir e tratar doenças de envelhecimento da pele. Ao mesmo tempo, o echinacoside em Cistanche tem uma capacidade significativa de eliminar os radicais livres DPPH e tem a capacidade de eliminar espécies reativas de oxigênio e prevenir a degradação do colágeno induzida por radicais livres, e também tem um bom efeito de reparo nos danos causados ​​pelos radicais livres da timina.

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Materiais e métodos:Para este estudo, foi avaliado o potencial inibitório de 80 por cento de MPM contra diferentes enzimas associadas ao processo de envelhecimento. Dado o papel inequívoco do estresse oxidativo no envelhecimento, testes antioxidantes in vitro também foram empregados. Além disso, osajin foi determinado como o principal isoflavonoide bioativo da amostra por análise de cromatografia de camada fina de alto desempenho.

Resultados:Os resultados dos ensaios antioxidantes mecanisticamente diferentes exibiram o significativo potencial antioxidante do extrato. O potencial de inibição do MPM contra as enzimas hialuronidase, colagenase e elastase, que estão diretamente ligadas à aceleração do processo de envelhecimento, foi investigado e os resultados revelaram que o MPM inibiu explicitamente as enzimas acima. MPM tinha conteúdo fenólico e flavonoide único; 113,92 ± 2,26 mg equivalente de ácido gálico/g e 66,41 ± 0,74 mg QE/g, respectivamente. Quando os ensaios de capacidade antioxidante total foram considerados, é possível sugerir que o MPM é um agente antienvelhecimento promissor.

Conclusão:Como resultado, este estudo revela que os extratos de frutos de M. pomifera apresentam significativo potencial antienvelhecimento e podem ser utilizados para este fim.

Palavras-chave:Maclura pomifera, antienvelhecimento, antioxidantes, HPTLC, osajin

INTRODUÇÃO

Da mesma forma, todos os órgãos, incluindo a pele humana, sofrem várias alterações fisiológicas com o avanço da idade.1 Existem duas classes de envelhecimento: o envelhecimento intrínseco é controlado pela genética e o envelhecimento extrínseco é o resultado natural de modificações fisiológicas devido aos efeitos nocivos de fatores ambientais como ultravioleta (UV ) radiação, toxinas químicas e tabagismo.1,2 Degradação da estrutura vascular e glandular, perda de tecido fibroso e diminuição da regeneração celular são fatores fundamentais do envelhecimento,3 que levam ao aumento da degeneração tecidual, rugas e diminuição da matriz extracelular (ECM ).4

Como o maior órgão, a pele tem várias funções, como proteção, regulação da temperatura corporal e detecção dos sentidos.5 A pele é composta pela epiderme, derme e tecido subcutâneo e é a primeira barreira entre o corpo humano e o exterior ambiente.6,7 A MEC é a maior unidade da derme e suporta o crescimento e a elasticidade por apresentar um andaime estrutural.8 Colágeno, elastina e fibronectina, que são formados por fibroblastos dérmicos, constituem a MEC e são fundidos com proteoglicanos.5 O colágeno é uma proteína básica que compreende aproximadamente 25-35 por cento de todo o conteúdo de proteína no corpo e é encontrada no espaço extracelular de vários tipos de tecidos conjuntivos animais.3 Uma das principais causas do envelhecimento da pele e da formação de rugas é a alteração do colágeno estrutura.1 A elastina é uma proteína que confere uma elasticidade fisiológica única à pele e está presente em vários tecidos conjuntivos.6 A hidratação da pele e mantê-la lisa, úmida e lubrificada são fatores importantes que previnem o envelhecimento da pele, sendo um dos principais glicosaminoglicano (GAG), ácido hialurônico, desempenha um papel vital nessas atividades.8 Esses constituintes essenciais são degradados pelas enzimas hialuronidase, colagenase e elastase, levando, assim, a uma aceleração do envelhecimento da pele. Além disso, a exposição a microorganismos, poluição, radiação ionizante, produtos químicos e toxinas leva à formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) e suas consequências prejudiciais aceleram o envelhecimento da pele.9 EROs podem iniciar caminhos moleculares complexos e, como resultado, colagenase, elastase , e a atividade da hialuronidase pode ser aumentada, levando à degradação detectável da ECM e modificações na textura da pele.10 Pelas razões mencionadas, novos agentes naturais, que diminuem a formação de ROS e inibem as proteases degradantes da ECM, podem retardar o processo de envelhecimento da pele.11

Maclura pomifera (Rafin.) Schneider pertence a Moraceae ou família das amoreiras e também é conhecida como laranjeira osage, cultivada em quase todo o mundo.12 M. pomifera possui diversas atividades biológicas como antibacteriana, antifúngica, antiviral, citotóxica, antitumoral, estrogênica, e antimalárico13 devido às suas isoflavonas preniladas, ou seja, osajin e pomiferina, que são considerados os principais metabólitos das frutas.14 Na produção de cosméticos antienvelhecimento, os compostos fenólicos são fontes naturais importantes. Assim, há um crescente interesse em estudar plantas ricas em compostos fenólicos como M. pomifera para tais atividades. Estudos anteriores descobriram que as isoflavonas de Maclura aumentam os níveis de expressão de colágeno, elastina e fibrilina comparáveis ​​ou superiores a concentrações equivalentes de retinol. Portanto, pode-se supor que as isoflavonas Maclura são potentes estimulantes de proteínas da ECM.15 Considerando esses dados, este estudo tem como objetivo investigar o potencial antienvelhecimento do extrato metanólico (MPM) de M. pomifera 80 por cento, explorando seu potencial para bioatividade antioxidante e inibição Enzimas degradadoras de ECM. Além disso, a análise quantitativa do principal componente bioativo do extrato, osajin, foi medida por cromatografia em camada delgada de alta eficiência (HPTLC), e ensaios de teor de fenólicos totais e de flavonoides totais foram conduzidos para uma compreensão mais precisa do perfil fenólico. Os resultados mostram que M. pomifera pode ser uma fonte valiosa de produtos antienvelhecimento.

MATERIAIS E MÉTODOS

Produtos químicos

A Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA) forneceu todas as enzimas, produtos químicos e referências empregados nos testes. A qualidade de todos os produtos químicos era de grau analítico.

Material vegetal

Os frutos de M. pomifera foram coletados em Uşak, Türkiye, em maio de 2020. O Dr. Hilal Bardakcı realizou o procedimento de identificação botânica das amostras de plantas. Uma amostra da planta foi depositada na Acıbadem University, Herbário da Faculdade de Farmácia (ACUPH 00002).

Preparação de extratos

As frutas foram separadas em pequenos pedaços e passadas no liquidificador. Os frutos (6,45 kg) foram macerados com 3125 mL de metanol 80 por cento (MeOH) por meio de um agitador por três dias à temperatura ambiente em local escuro. O macerado foi filtrado e este procedimento foi repetido duas vezes. Os filtrados obtidos foram reunidos e, em seguida, o metanol foi evaporado em rotaevaporador. O extrato metanólico bruto foi liofilizado (o rendimento foi de 204,37 g, 3,16 por cento) e armazenado a -20 graus (MPM).

Procedimento de quantificação dos principais compostos bioativos por HPTLC

Todos os produtos químicos e reagentes utilizados eram de grau analítico. Clorofórmio (CHCl3) e acetato de etilo (EtOAc) foram adquiridos à Sigma-Aldrich. Um padrão de osajin disponível comercialmente foi adquirido da Sigma-Aldrich (SMB {{1{14}}}}0092). As análises HPTLC foram realizadas em placas de gel de sílica HPTLC 60 F254 de vidro de 20 cm × 10 cm (Merck, Darmstadt, Alemanha). O teor de Osajin em MPM foi determinado por um sistema analítico CAMAG HPTLC. A fase móvel utilizada no presente estudo foi previamente descrita por Bozkurt et al.16 durante o isolamento de princípios ativos de M. pomifera. 10 mg/mL de extrato de MeOH foi usado como solução de teste de análise. Uma solução estoque padrão (0,5 mg/mL) de osajin foi preparada usando 2 mL de acetona. Uma solução de trabalho com uma concentração de 50 µg/mL do composto padrão foi preparada por diluição com acetona da solução estoque. Cada amostra foi filtrada através de um filtro de seringa de 0,45 µm. 10 μL do extrato juntamente com pelo menos cinco concentrações diferentes da solução padrão (3.3-4.7 μL) foram aplicados na forma de bandas de 8 mm de comprimento em placas HPTLC de vidro de sílica gel 60 F254 com CAMAG Automatic Amostrador TLC IV. Os desenvolvimentos foram realizados na Câmara de Revelação Automática da CAMAG-2 (ADC- 2) e a fase móvel foi CHCl3:EtOAc [8:2 (v/v)]. A câmara foi saturada por 10 min e a placa foi pré-condicionada por 5 min antes do desenvolvimento. A umidade foi controlada por ADC-2 usando MgCl2 (33% UR) por 10 min. A avaliação densitométrica foi realizada usando um CAMAG TLC Scanner IV no modo de fluorescência. A dimensão da fenda foi mantida em 5 × 0,2 mm, micro, e a velocidade de escaneamento foi ajustada em 20 mm/s. Os conteúdos dos padrões foram obtidos comparando a área sob as curvas características de operação do receptor (AUCs) com a curva de calibração dos padrões a 280 nm. A presença de padrões no extrato foi assegurada pela comparação de ambos os fatores de retenção (Rf) e espectros UV de sobreposição de cada extrato e padrão. A quantidade de osajin foi determinada pela comparação da intensidade da luz difusamente refletida do extrato e frações com o composto padrão.

O teor de Osajin no extrato vegetal bruto foi medido usando densitometria HPTLC. O valor de Rf do padrão osajin foi 0,556. A ocorrência de osajin nas amostras de teste foi verificada por comparação de seus valores de Rf e sobreposição de seus espectros de UV (Figura 1). A quantificação foi obtida comparando as AUCs das amostras com a curva de calibração obtida usando o composto padrão osajin. A função de calibração foi y=2.268*10-8x. O coeficiente de correlação (R) e o coeficiente de variação da função de calibração foram 0,998 por cento e 1,06 por cento, respectivamente. A análise HPTLC mostrou que o MPM contém 0,22 por cento (p/p) de osajin. Os resultados do estudo HPTLC são apresentados na Tabela 1.

Ensaio de perfil fenólico

Ensaio de conteúdo fenólico total

O ensaio foi realizado para avaliar o conteúdo fenólico total das amostras pelo método de Folin-Ciocalteu, conforme usado anteriormente por Kurt-Celep et al.17 20 μL de soluções de amostras recém-diluídas foram misturados com 75 μL de Na2 CO3 (20 por cento ) e 100 μL de FCR (reagente Folin-Ciocalteu) diluído com H2O (1:9). Após incubação por 30 min a 45 graus, a absorbância das misturas foi lida espectrofotometricamente a 765 nm. Os resultados foram expressos em mg de equivalentes de ácido gálico (GAE) por g de extrato.

Ensaio de conteúdo total de flavonoides

A medição do conteúdo total de flavonoides das frações foi feita como um método previamente relatado por Bardakci et al.18 Concisamente, 1 M CH3 COONa recém-preparado e 10 por cento de AlCl3 foram misturados com as amostras. Em seguida, 30 min de incubação das misturas foram realizadas em temperatura ambiente e no escuro. Após o processo de incubação, a absorbância foi calculada a 415 nm. Os resultados foram expressos em mg de equivalentes de quercetina (QE) em 1 g de amostra.

Determinação da atividade antioxidante in vitro

2, teste de atividade de eliminação de radical2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH)

Para determinar a atividade de eliminação do radical DPPH, uma combinação de soluções de amostras recém-diluídas (várias concentrações preparadas a partir de solução estoque de 1 mg/mL) e solução metanólica de DPPH (100 mM) foram feitas. Após o intervalo de incubação em temperatura ambiente por 45 min, a absorbância foi lida em 517 nm. O hidroxitolueno butilado (BHT) foi usado como composto de referência para adquirir uma curva de calibração. Os valores de IC50 dos resultados foram declarados como µg/mL.19

Teste de poder antioxidante redutor férrico (FRAP)

Para obter o reagente FRAP, 25 mL de tampão acetato 300 mM (pH 3,6), 2,5 mL TPTZ [2,4,6-tris (2-piridil)-s-triazina] , e 2,5 mL de FeCl3.6H2O (20 mM) foram misturados. Depois disso, 10 mL da amostra foram adicionados a 260 mL de reagente FRAP e diluídos para 300 mL com água destilada em uma placa de 96 poços. Após incubação por 30 min a 37 graus, a medição da absorbância foi realizada a 593 nm. O BHT foi usado como composto de referência. Solução de cloreto ferroso (0,252 mM) foi usada para obter uma curva padrão e os resultados foram dados como mM FeSO4 em 1 g de extrato seco.20

Teste de capacidade antioxidante redutora de cúprico (CUPRAC)

O teste CUPRAC foi estimado de acordo com o método descrito anteriormente por Barak et al.21 Volumes iguais de CuSO4 10 mM, neocupraína e tampão de acetato de amônio (85 mL) foram misturados em uma placa de 96-poços. Depois disso, 51 mL de água destilada e 43 mL de soluções de amostra foram adicionados à mistura, respectivamente. Após incubação por 20 minutos, a absorbância foi lida a 450 nm. Os resultados foram expressos em mg de ácido ascórbico equivalente em 1 g de extrato seco.

Determinação do teste de capacidade antioxidante total (TOAC)

O teste de capacidade antioxidante total foi calculado de acordo com o método do fosfomolibdênio explicado anteriormente por Barak et al.22 Primeiro, para obter a solução TOAC; Fosfato de sódio monobásico 28 mM, molibdato de amónio 4 mM e H2SO4 600 mM foram misturados. Em seguida, 300 µL de solução TOAC foram misturados com 30 µL de soluções de amostra em uma placa 96 saudável. Após o período de incubação a 95 graus por 90 min, a absorbância foi lida a 695 nm. O ácido ascórbico foi usado para obter uma curva padrão e os resultados foram calculados como mg equivalentes de Trolox em 1 g de extrato seco.

Atividade inibitória em enzimas relacionadas ao envelhecimento da pele

Atividade anti-colagenase

Para medir a atividade anti-colagenase do MPM, uma solução tampão tricina 50 mM (pH: 7,5) foi preparada (400 mM NaCl e 10 mM CaCl2). Clostridium histolyticum (ChC - EC. 3.4.23.3) foi utilizado como fonte de colagenase, que foi dissolvida na solução tampão tricina 50 mM para atingir uma concentração inicial de 0,8 U/mL. 2 mM de N-[3-(2-furil) acriloil]-Leu-Gly-Pro-Ala (FALGPA) dissolvido em tampão tricina foi usado como substrato. Os extratos foram incubados com a enzima colagenase em uma solução tampão por 15 min antes de adicionar o substrato para iniciar a reação. A mistura de reação final compreendia um volume total de 150 µL; tampão tricina, 0,8 mM FALGPA, 0,1 unidades de ChC e 25 μL MPM. Água foi usada para os resultados em branco. Após a adição do substrato, a medição da absorbância foi feita imediatamente. Os controles positivos realizaram galato de epigalocatequina (EGCG).23

Atividade anti-elastase

A avaliação de MPM para atividade anti-elastase foi realizada usando 0.2 mM solução tampão Tris-HCl (pH: 8.0). Uma solução estoque de elastase (PE, EC 3.4.21.36) obtida de pâncreas suíno foi preparada com água destilada na concentração de 3,33 mg/mL. N-Succinil-Ala-Ala-p-nitroanilida (AAAPVN) a ser usado como substrato foi dissolvido em uma solução tampão (1,6 mM). O extrato de MPM foi incubado com 1 µg/mL de PE por 15 min a 37 graus antes da adição do substrato. Ao final de 15 min de pré-incubação, 0.8 mM de substrato AAAPVN foi adicionado à mistura enzimática contendo 1 mg/mL de extrato vegetal e a incubação foi realizada novamente por 15 min a 37 graus . Ao usar 0,25 mg/mL EGCG como controle positivo, esta amostra de teste contém o mesmo volume de EGCG em vez de MPM, e a configuração do teste foi repetida. Após os períodos de incubação, as medições foram feitas em 4 pontos de tempo diferentes por 5 a 30 minutos pelo Thermo Scientific Multiskan SkyHigh Microplate Spectrophotometer em 365 nm de excitação e 410 nm de emissão.24, 25

Atividade anti-hialuronidase

A atividade anti-hialuronidase foi realizada modificando o método descrito por Kolayli et al.26 e Lee et al.3 Primeiramente, a hialuronidase adquirida comercialmente (EC 3.2.1.35, Sigma-Aldrich) foi dissolvida em 0. 0Tampão fosfato 2 M (pH: 3,5) contendo NaCl e soroalbumina bovina. Em seguida, o ácido hialurônico, substrato apropriado da enzima, foi preparado em tampão acetato (0.1 M, pH: 3,5) e pronto para uso. A mistura de ensaio consistindo em 20 µL de MPM a uma concentração de 1 mg/mL, 10 µL de hialuronidase e 60 µL de tampão acetato 0,1 M foi pré-incubada por 20 min a 37 graus. Após o tempo de incubação, 10 µL de ácido hialurônico foram adicionados à mistura e incubados novamente a 37 graus por 20 min. No final do tempo total de incubação, as medições foram feitas em diferentes pontos de tempo pelo Thermo Scientific Multiskan SkyHigh Microplate Spectrophotometer a 600 nm. O grupo branco não continha enzimas na montagem experimental, enquanto o grupo controle não continha o extrato. A porcentagem de atividade anti-hialuronidase foi calculada usando a seguinte equação:

Atividades antienvelhecimento ( porcentagem )= [(Abs de controle - Abs de amostra)/ Abs de controle] × 100

Análise estatística

Os experimentos de atividade anti-elastase, anti-colagenase e anti-hialuronidase incluídos neste estudo foram repetidos três vezes independentemente. A diferença estatística foi analisada por meio do teste t do software GraphPad Prism 8 (p menor ou igual a 0,05).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Determinação do potencial antienvelhecimento

Elastina, colágeno e ácido hialurônico são conteúdos conhecidos da ECM, que têm papéis fundamentais na aparência jovem da pele. A elastina é uma proteína vital para manter as propriedades elásticas da pele, consequentemente, a diminuição da elastina na ECM leva à aceleração do processo de envelhecimento.27 A literatura anterior indica a ligação direta entre o enrugamento e o envelhecimento da pele com quantidades reduzidas de elastina.28 O ácido hialurônico é uma molécula de GAG ​​hidrofóbica, que é despolimerizada via hialuronidase. O ácido hialurônico é crucial para manter a suavidade e a umidade da pele estáveis; portanto, foi demonstrado que a degradação excessiva leva ao ressecamento e ao enrugamento da pele.29 Através do processo de envelhecimento com o tempo, níveis reduzidos de colágeno causam afinamento da derme, o que é considerado uma indicação distinta sob exame microscópico.3{{23 }} Foi precisamente indicado que retardar a degradação do colágeno via inibidores da colagenase, consequentemente, interrompe o enrugamento e o envelhecimento da estrutura da pele.5 Considerando essa informação, substâncias que inibem a elastase, colagenase e hialuronidase têm um potencial notável para produtos antienvelhecimento. Estudos anteriores demonstraram que vários isoflavonoides exibem bioatividade inibitória significativa contra as enzimas mencionadas. Addotey et al.31 mostraram que quatro isoflavonoides diferentes inibiram a hialuronidase em até 61,2%. Kim et al.32 demonstraram que um isoflavonoide isolado de Glycyrrhiza uralensis Fisch., a licoricidina, tem atividade inibitória significativa da elastase. O valor de IC50 de alcaçuz foi calculado como 61,2 ± 4,2 µM, enquanto o ácido oleanólico foi calculado como 131,4 ± 11,4 como um composto de referência. Os resultados indicaram que os isoflavonoides podem inibir as enzimas elastase. Consistente com o estudo supracitado, Kim et al.33 estudaram nove diferentes isoflavonoides prenilados, estruturas extremamente relacionadas com osajin, isolados de raízes de Flemingia philippinensis Merr. & Rolfe. Os pesquisadores relataram que cinco das isoflavonas preniladas tinham potente atividade de inibição contra a elastase de neutrófilos, valores de IC50 diversificados entre 1,9-12,0 µM, enquanto o valor de IC50 do ácido oleanólico era de 28,4 µM. Em outro estudo, Ergene Öz et al. 34 investigaram in vitro a atividade inibitória de cinco isoflavonoides isolados de raízes de Ononis spinoza L. contra hialuronidase, colagenase e elastase. A atividade inibitória da hialuronidase das isoflavonas foi relatada entre 22,08-45,58 por cento, enquanto, na mesma concentração, o ácido tânico mostrou 88,32 por cento de inibição. Os resultados da inibição da colagenase foram calculados entre 20,41- 28,49 por cento e a inibição da elastase foi medida como 20,{37}},88 por cento. O EGCG foi usado como referência para ambos os ensaios e as atividades de inibição na mesma concentração foram medidas como 41,18 por cento e 84,64 por cento, respectivamente. Outro estudo investigou tratamentos tópicos de pomiferina diretamente isolada de M. pomifera. 15 A pomiferina é um isoflavonoide prenilado, que pode ser encontrado nos frutos de M. pomifera e sua estrutura molecular se assemelha muito à do osajin. Os investigadores relataram que a pomiferina exibiu potente atividade de estimulação da proteína ECM, aumentando o colágeno e a elastina, que é superior ou equivalente ao composto de referência, retinol. Todos os estudos mencionados revelaram que as isoflavonas são inibidores moderados a potentes dessas enzimas e têm potencial significativo como materiais antienvelhecimento naturais.

Neste estudo, as atividades in vitro de hialuronidase, colagenase e elastase inibitória do MPM foram investigadas para a determinação do potencial antienvelhecimento. Um ensaio comparativo foi conduzido para o ensaio de inibição da colagenase em dois pontos de tempo, por exemplo, 20 e 40 min, tanto para MPM quanto para o composto de referência, EGCG. Os resultados demonstraram que a atividade de inibição da colagenase aumentou com o tempo. 1 mg/mL MPM mostrou 84,55 ± 1,99 por cento de inibição, enquanto 25{{40}} µg/mL EGCG mostrou 84,66 ± 1,83 por cento após 20 min de incubação. A bioatividade inibitória foi amplificada ao longo do tempo, após 40 min MPM e EGCG inibiram a colagenase 94,68 ± 2,42 por cento e 94,98 ± 2,81 por cento, respectivamente. De acordo com a literatura, o MPM exibiu significativa atividade de inibição contra a elastase. Os resultados foram medidos para quatro pontos de tempo (5, 10, 20 e 30 min) e demonstraram incremento ao longo do tempo (Figura 2). EGCG (250 µg/mL) foi usado como referência e a atividade de inibição aumentou em cada ponto de tempo (44,07 ± 0.00 percent , 52,19 ± 0.00 percent , 64,69 ± 0.{{41 }} por cento e 86,21 ± 0,00 por cento, respectivamente). Enquanto isso, o MPM na concentração de 1 mg/mL exibiu maior atividade de intensificação e inibição, que aumentou de 34,70 ± 0,57 por cento para 97,40 ± 1,04 por cento de 5 min para 30 min. Da mesma forma, 1 mg/mL de MPM inibiu significativamente a enzima hialuronidase após 40 min de incubação. 83,91 ± 2,36 por cento de inibição foi medida após 40 min, após 80 min de incubação, a taxa de inibição foi amplificada para 97,19 ± 0,45 por cento. Quando todos os ensaios de inibição enzimática foram considerados, os resultados demonstraram visivelmente que o MPM pode ser um valioso agente antienvelhecimento natural e pode ser usado no conteúdo de vários produtos antienvelhecimento; assim, M. pomifera pode ganhar importância econômica extra.

Determinação do potencial antioxidante

Numerosos fatores exógenos e endógenos levam ao envelhecimento da pele através de vários mecanismos. A maioria desses fatores é direta ou indiretamente afetada pela formação de ROS na ECM da pele.35 Como a pele cobre a parte externa do nosso corpo, ela encontra quantidades significativas de irradiação UV na vida diária. Assim, a maioria dos problemas de pele, como queimaduras solares, hiperpigmentação e carcinogênese da pele, se origina ou está relacionada aos efeitos diretos da radiação UV. Da mesma forma, o fotoenvelhecimento é uma consequência adicional de suas propriedades perigosas.36 Além disso, a luz UV gera formação de ROS e, conseqüentemente, estresse oxidativo no tecido da pele, que é um dos mecanismos mais importantes que levam ao fotoenvelhecimento.37 Foi levantada a hipótese de que, devido ao excesso de A formação de ROS causa envelhecimento prematuro da pele, agentes com uma capacidade antioxidante significativa podem ser uma ferramenta valiosa contra os perigosos efeitos da radiação UV. Consequentemente, estudos clínicos mostram que o uso tópico de antioxidantes tem um efeito protetor na pele.38

Após a interligação entre o uso tópico de antioxidantes e o adiamento do envelhecimento da pele, bem estabelecida na literatura anterior, o exame in vitro do potencial antioxidante do MPM fornece informações valiosas sobre seu potencial antienvelhecimento quando aplicado topicamente. A literatura anterior demonstrou que extratos com um alto número de isoflavonoides podem ser antioxidantes valiosos. Em um estudo anterior, um extrato rico em isoflavonoides do extrato de F. macrophylla reduziu os danos à pele induzidos por UVB ao eliminar as ROS.39 Santos e Silva4{{10}} indicaram que os isoflavonoides prenilados têm importante potencial antioxidante devido à sua porção flavonóide e um efeito aditivo da cadeia lateral prenil. O potencial antioxidante de extratos e isoflavonoides de M. pomifera foi avaliado em estudo anterior. Os resultados demonstraram que o extrato hidroalcoólico e osajin puro mostraram atividade significativa nos ensaios DPPH, FRAP e TOAC, embora as frações de pomiferina e acetato de etil tenham mostrado maior atividade. conduzido para a determinação abrangente do potencial antioxidante in vitro de MPM (Tabela 2). O MPM exibiu atividade significativa de eliminação do radical DPPH, onde o valor de IC50 foi medido em 1998.86 ± {{20}}0,02. Os ensaios de FRAP e TOAC também resultaram em notável atividade redutora de metais, 0,191 ± 0,01 mM FeSO4/DE e 114,43 ± 0,02 AAE/g DE, respectivamente. Esses achados foram consistentes com o estudo anterior publicado por Orhan et al.41 O ensaio CUPRAC foi realizado em extratos de frutos de M. pomifera pela primeira vez até onde sabemos. Correspondentemente, MPM mostrou notável atividade redutora de cobre no ensaio CUPRAC, onde os resultados foram medidos como 73,928 ± 0,01 AAE/g DE. Quando os ensaios de capacidade antioxidante total foram considerados, é possível sugerir que o MPM é um agente antienvelhecimento promissor.

Perfil fenólico e análise HPTLC

Os isoflavonoides são substâncias fenólicas conhecidas como constituintes vegetais responsáveis ​​por várias atividades biológicas notáveis, como antioxidante, anticancerígena e contra problemas ginecológicos.42 Estudos anteriores demonstraram que os isoflavonoides prenilados são os principais compostos fenólicos nos frutos de M. pomifera.43 Numerosos estudos identificaram osajin e pomiferina como os principais ingredientes dos frutos de M. pomifera, que são os principais responsáveis ​​por suas atividades biológicas.12 Osajin e pomiferina são isoflavonoides prenilados altamente semelhantes que diferem apenas em um grupo hidroxila.44 Relatórios anteriores demonstraram resultados conflitantes para os conteúdos de osajin e pomiferina de frutos de M. pomifera. Kartal et al.45 desenvolveram um método de LC-MS para a determinação de osajin e pomiferina em M. pomifera, que foram coletados na província de Türkiye, em Ancara. Os resultados demonstraram que o conteúdo de pomiferina foi ligeiramente superior ao conteúdo de osajin em diferentes partes das amostras de frutas. Em outro estudo, amostras de frutas de M. pomifera foram coletadas em diferentes regiões do meio-oeste e sul dos Estados Unidos e os conteúdos de osajin e pomiferina foram medidos por meio de um novo método de análise de HPLC. Os resultados mostraram que as diferenças geográficas levam a alterações significativas nas quantidades de isoflavonoides nas amostras.46 Tsao et al.47 determinaram o conteúdo de osajin e pomiferina das frutas coletadas no Canadá e descobriram que o conteúdo de pomiferina era ligeiramente maior do que o conteúdo de osajin. Em contraste, Hwang et al.48 resumiram vários estudos que encontraram quantidades de osajin maiores do que as quantidades de pomiferina em vários extratos. Pode-se afirmar que os conteúdos de osajin e pomiferina dos frutos de M. pomifera são excepcionalmente variáveis ​​com diferenças geográficas e técnicas de extração devido à sua estrutura química decididamente análoga. Para este estudo, a quantidade de MPM foi medida por meio de análise HPTLC, pela primeira vez ao nosso conhecimento. Os resultados da análise mostraram que osajin é o ingrediente predominante do MPM que foi coletado na província de Usak, 0.22 por cento da amostra consistia em osajin (Tabela 1). Além disso, para obter uma avaliação mais aprofundada do perfil fenólico do MPM, foram realizados ensaios de teor de fenólicos totais e flavonoides totais. Os resultados mostraram que o MPM tinha conteúdo notável de fenólicos e flavonóides como segue; 113,92 ± 2,26 mg GAE/g e 66,41 ± 0,74 mg QE/g, respectivamente. Os resultados da avaliação do perfil fenólico mostraram que o MPM pode ser um candidato proeminente como um novo agente antienvelhecimento natural.

CONCLUSÃO

Embora os estudos que investigam a aplicação tópica de frutas de M. pomifera sejam relativamente novos, a atenção dessa maneira está aumentando com relatórios encorajadores. Portanto, este estudo teve como objetivo descrever uma avaliação abrangente do possível potencial antienvelhecimento do extrato da fruta M. pomifera. A análise HPTLC foi utilizada para frutos de M. pomifera para a determinação do teor de isoflavonoides pela primeira vez ao nosso conhecimento, juntamente com estudos in vitro para determinação do perfil fenólico total. Os resultados mostraram que osajin é o principal ingrediente das amostras. Além disso, o potencial antioxidante in vitro do extrato foi avaliado com quatro ensaios diferentes e os resultados demonstraram um potencial antioxidante significativo do MPM. Além disso, mediu-se a atividade inibitória contra as enzimas relacionadas ao processo de envelhecimento e observou-se que o MPM tinha notável atividade de inibição enzimática. Em conclusão, este estudo fornece informações que podem levar à produção de novos produtos para a pele.

Ética

Aprovação do Comitê de Ética:A aprovação do comitê de ética não é necessária para o estudo.

Consentimento Informado:Não é necessário.

Revisão por pares:Externamente revisado por pares.

Contribuições de Autoria

Conceito: THB, TBŞ., HB, Projeto: THB, İ.KC, EC, Coleta ou processamento de dados: THB, İ.KC, HB, Análise ou interpretação: THB, İ.KC, Pesquisa bibliográfica: THB, TBŞ., Redação: THB, CE

Conflito de interesses:Nenhum conflito de interesse foi declarado pelos autores.

Divulgação Financeira:Este estudo foi financiado pela Comissão de Projetos Científicos da Universidade Acıbadem Mehmet Ali Aydınlar (no: 2020/02/07).

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