Identificação de genes hub associados ao desenvolvimento de lesão renal aguda

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Xiao Lin Jianchun Li Ruizhi Tan Xia Zhong Jieke Yang Li Wang

Laboratório de Profilaxia e Tratamento de Fibrose de Órgãos pela Combinação de Medicina Tradicional Chinesa e Ocidental, Centro de Pesquisa de Medicina Tradicional Chinesa e Ocidental Integrada, Hospital de Medicina Tradicional Afiliado, Southwest Medical University, Luzhou, China

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Palavras-chave

Análise ponderada da rede de co-expressão gênica·Agudorimlesão·Rplp1.Lgals1

Abstrato

Antecedentes: Agudorimprejuízo(LRA) é uma síndrome clínica grave, causando um profundo ônus médico e socioeconômico em todo o mundo. Este estudo teve como objetivo explorar alvos moleculares subjacentes relacionados à progressão da AKl. Métodos: Um banco de dados público originado do banco de dados NCBI GEO (número de série: GSE121190) e um método bem estabelecido e imparcial de análise de rede de coexpressão gênica ponderada (WGCNA) para identificar genes hub e caminhos potenciais foram usados. Além disso, os genes unbiasedhub foram validados em 2 modelos clássicos de AKl em um modelo de roedor: IRA quimicamente estabelecida por cisplatina e IRA induzida por isquemia-reperfusão. Resultados: Um total de 17 módulos foram finalmente obtidos pelo método imparcial do WGCNA, onde os genes do módulo turquesa apresentaram forte correlação com o desenvolvimento de AKl. Além disso, os resultados da ontologia gênica revelaram que os genes do módulo turquesa estavam envolvidos naprejuízoe fibrose renal. Assim, os genes hub foram ainda validados por métodos experimentais e obtiveram principalmente Rplp1 e Lgals1 como genes candidatos-chave relacionados à progressão da LRA pela vantagem da PCR quantitativa, Western blotting e fluorescência tecidual in situ. É importante ressaltar que a expressão de Rplp1 e Lgals1 no nível de proteína mostrou uma correlação positiva com a função renal, incluindo Cr sérico e BUN. Conclusões: Pela vantagem do método de bioinformática imparcial e consequente verificação experimental, este estudo estabelece as bases para a patogênese e desenvolvimento de agentes terapêuticos da LRA.

Introdução

Agudorimprejuízo(LRA) é uma síndrome clínica comum, incluindo uma variedade de processos fisiopatológicos [1, 2]. Na verdade, a recuperação da função renal na LRA é muitas vezes incompleta e evolui gradualmente para DRC, que eventualmente evolui para DRT [3]. A IRA é um contribuinte fundamental para a DRC e conseqüente DRT [4]. Na progressão das transições de LRA para DRC, anormalidades estruturais se manifestam como expansão da matriz depositando-se tanto no mesângio quanto no tubulointerstício. Alvejando

na fibrose renal após LRA tem sido considerada uma abordagem terapêutica para minimizar as transições [5-7].

A Cr plasmática elevada é considerada um critério clássico para o diagnóstico de LRA nas últimas décadas. Mas pode não ser um biomarcador adequado, pois muitas vezes sugere o equilíbrio de produção e excreção de Cr [8]. Embora a eliminação dos resultados de curto e longo prazo da LRA seja urgente, terapias terapêuticas e biomarcadores de detecção precoce ainda são limitados. Além disso, atualmente não existem biomarcadores clinicamente válidos para o diagnóstico de fibrose renal após LRA. Portanto, é benéfico desenvolver mais terapias terapêuticas e descobrir os potenciais biomarcadores para o tratamento da fibrose e retardar a progressão [1, 8].

Devido a metodologias falhas de biologia molecular, ainda existem certas limitações na exploração abrangente de todo o sistema biológico em doenças [9]. Como um método biológico sistemático para descrever os padrões de associação genética entre diferentes amostras, a análise de rede de coexpressão gênica ponderada (WGC-NA) é usada principalmente para rastrear e identificar módulos altamente colaborativos. De acordo com a internalidade do módulo e a relação entre módulos e fenótipos, ele tem sido amplamente utilizado no estudo de análise ômica para minerar potenciais biomarcadores ou alvos terapêuticos [10-12]. Comparado com dados que se concentram apenas na expressão diferencial, o WGCNA tem as seguintes vantagens: pode aproveitar ao máximo as informações, associar alternâncias interessantes de fenótipos e evitar os defeitos da análise de expressão diferencial definindo limites artificialmente. Além disso, o WGCNA pode não apenas analisar o nível de mRNA das amostras, mas também ser usado para pesquisa de microRNA e proteômica, o que é de grande ajuda para encontrar potenciais marcadores biológicos e alvos terapêuticos [13, 14].

No presente estudo, realizamos um método bioinformático bem estabelecido – WGCNA – para analisar o perfil de expressão (número de série NCBI GEO: GSE121190) e objetivamos identificar as possíveis vias e genes associados à progressão da LRA. É importante ressaltar que usamos métodos experimentais para verificar ainda mais os genes hub, de modo a fornecer novos insights para a ocorrência, desenvolvimento e tratamento da IRA.

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Materiais e métodos

Pré-processamento de dados

O conjunto de dados foi obtido do banco de dados GEO. Neste estudo, 12 amostras do conjunto de dados GSE121190 foram usadas para análise WGCNA. Doze amostras incluíram o grupo controle e o grupo de LRA induzida por ácido fólico 3-/7-/14-dia (3 amostras por grupo). O pacote R "limma" é usado para correção de fundo e processamento de normalização com os dados originais. Se várias sondas corresponderem a 1 gene, o valor médio é calculado como o valor da expressão do gene [9, 15].

Construção de Rede de Co-Expressão e Análise Funcional

Em seguida, o soft threshold é calculado pelo algoritmo WGCNA. O valor independente de escala e a conectividade média dos módulos sob diferentes soft thresholds foram testados pelo método do gradiente para determinar o soft threshold apropriado [13, 16, 17]. Ao selecionar os valores de soft threshold apropriados, a rede de coexpressão foi construída para garantir a autenticidade dos resultados, e o número mínimo de genes em cada módulo não foi<30. then,="" use="" the="" r="" package="" "clusterprofiler"="" toolkit="" to="" perform="" go="" analysis="">

Verificação do Gene Hub

Em seguida, analisamos os genes hub de acordo com o valor limite em cada módulo e os visualizamos usando o software Cytoscape. Os genes hub foram tratados como o seguinte critério: (a) valor absoluto da significância do gene (GS), FA 3/7/14 dias Maior ou igual a 0.2, e (b) os genes no módulo principal foram analisados ​​pelo banco de dados STRING para gerar a rede de interação proteína-proteína (PPI), e os 5 principais genes de maior conectividade foram tratados como genes hub para posterior verificação [20].

Modelos Animais Induzidos por Cisplatina e Hipóxia-Isquemia

Camundongos C57BL/6 machos (nível SPF, 6∼8-semanas de idade, 20∼25 g) foram adquiridos da Chengdu Dashuo Experimental Animal Co., Ltd. (SCXK [Sichuan] 2015-030) e alojados e criados sob condições padrão de cuidados no Experimental Animal Center da Southwest Medical University (SYXK [Sichuan] 2018-065). Os ratos

Fig. 1. Construção do módulo de expressão colaborativa. Um dendrograma de agrupamento de 12 amostras. B Análise de topologia de rede para vários soft thresholding (potência). C Módulo de co-expressão construído pelo algoritmo híbrido dinâmico. Cada nó folha representa um gene e as diferentes cores representam diferentes módulos no diagrama de árvore.

foram classificados em 3 grupos (n=6 por grupo): controle, Cis-AKI e IRI-AKI; camundongos do grupo Cis-AKI foram injetados com cisplatina (Sigma-Aldrich, EUA) (15 mg/kg) por injeção intraperitoneal [21]. Os camundongos do grupo IRI foram anestesiados com 1% de pentobarbital sódico e colocados em um pequeno cobertor elétrico termostático para manter a temperatura corporal em 36 graus. Após anestesia, foram feitas incisões nos flancos bilaterais e pinçadas as artérias arteriovenosas

com clipes arteriais por 35 min. A solução salina foi adicionada gota a gota para manter arinsúmido a cada 5 min. Após a remoção do clipe arterial, as incisões foram suturadas e os camundongos foram colocados em ambiente de 37 graus [22, 23]. Ao final do período experimental, os camundongos foram mortos nos dias 3 e 7, respectivamente. Amostras de sangue de camundongos foram

obtido antes da luxação cervical. Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética da Southwest Medical University (número de aprovação: 201812-55).

Análise Histológica e Detecção da Função Renal

orimfoi feito em secções de parafina de acordo com métodos convencionais. Resumidamente, orimos tecidos foram fixados com formaldeído a 10%, desidratados e incluídos em parafina [24]. Os cortes foram desidratados e corados com hematoxilina e eosina (Beyotime, China). Por fim, as seções foram fotografadas com um microscópio de lâmina virtual (VS120-S6-W, Olympus, Japão). Ao mesmo tempo, Cr e BUN séricos foram medidos de acordo com as instruções do kit (Nanjing JianCheng, China).

Isolamento de RNA e PCR Quantitativo

O RNA total foi extraído com um kit de extração de RNA (Tiangen, Pequim) e o DNA complementar foi obtido com o kit de transcrição reversa (Promega, Xangai, China) de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, a PCR quantitativa foi realizada no LightCycler® 480 II Real-Time PCR System (Roche, Alemanha). Os primers foram sintetizados pela Sangon Biotech (Shanghai, China) e as sequências estão disponíveis na Tabela 1.

Western Blot

As proteínas totais foram isoladas e dissolvidas em tampão RIPA. Em seguida, as concentrações de proteína foram detectadas usando um BCA Protein Assay Kit (Beyotime Biotechnology, China). As amostras de proteína foram processadas em gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio a 12% e transferidas para membranas de PVDF (Millipore, Danvers, MA, EUA). As membranas foram bloqueadas com 5% de albumina de soro bovino em temperatura ambiente por 1 h e incubadas a 4 graus durante a noite com os anticorpos primários indicados: anti-Lgals1 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA, 1:1,{10 }}) e anticorpos anti-Rplp1 (Invitrogen, Waltham, MA, EUA, 1:500). Em seguida, as membranas de PVDF foram lavadas com Tris-buffered Saline Tween e incubadas em

temperatura ambiente por 1 h com um anticorpo secundário (Invitrogen, Waltham, MA, EUA; 1:10,000). As bandas foram visualizadas usando o ECL Chemiluminescence Kit (Thermo, Waltham, MA, EUA) e analisadas usando o software ImageJ.

Imunofluorescência in situ

Para imunofluorescência tecidual,rimos tecidos foram fixados com solução de formaldeído a 10 por cento e desidratados, respectivamente, com 10, 20 e 30 por cento de sacarose, seguido de inclusão em OCT. As amostras foram então feitas em seções de 4-μm e lavadas 3 vezes com PBS por 5 min. Os tecidos foram bloqueados com 5 por cento de BSA por 1 h à temperatura ambiente e depois incubados a 4 graus durante a noite com os anticorpos primários indicados: anti-Lgals1 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA; 1:200) e anticorpos anti-Rplp1 (Invitrogen, Waltham, MA, EUA; 1:100). No dia seguinte, os tecidos foram lavados com PBS por 5 min 3 vezes, seguido de incubação com anticorpos secundários conjugados Alexa Fluor® 488-(Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA; 1:200) e em temperatura ambiente por 1h. As imagens foram capturadas por um microscópio virtual de lâminas (VS120-S6-W, Olympus, Japão).

Análise estatística

As análises estatísticas de PCR em tempo real e Western blot foram realizadas pelo GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, EUA). A ANOVA unidirecional foi usada se existirem mais de 2 grupos de comparação. p < 0,05="" foi="" considerado="" como="" diferença="">

Fig. 3. A análise funcional do módulo turquesa. Uma análise de enriquecimento de função gênica resulta do módulo turquesa. B PPI dos genes hub no módulo turquesa, e os resultados foram visualizados pelo Cytoscape. PPI, interação proteína-proteína; MEC, matriz extracelular.

Resultados

Pré-processamento de dados

As 12 amostras de dados de array no conjunto de dados baixado GSE121190 foram pré-processadas usando o pacote limma da linguagem R. Para obter genes associados à IRA, é necessário comparar as alterações da expressão gênica entre amostras normais e amostras de IRA e excluir 25% dos genes antes da variação. Como resultado, obteve-se um total de 5.418 genes para a última análise WGCNA.

Construção do Módulo de Expressão Colaborativa

Em primeiro lugar, as amostras foram primeiro agrupadas para remover outliers pela ferramenta hclust da linguagem R. Os resultados são apresentados na Figura 1A. Em seguida, medimos a independência e a conectividade média dos módulos em diferentes limites. Conforme mostrado na Figura 1B, pode-se julgar pela figura que quando o valor do limiar é igual a 8, o que não apenas torna o grau médio de conexão da rede não muito baixo, mas também garante que a rede construída esteja próxima da escala livre rede.

Na próxima etapa, convertemos a matriz de adjacência em uma matriz de sobreposição topológica para reduzir ruídos e falsas correlações. Uma árvore de agrupamento do sistema foi estabelecida por meio de uma matriz de sobreposição topológica, conforme mostrado na Figura 1C. E o número de genes em cada módulo foi definido como nada menos que 30 pelo algoritmo de cisalhamento híbrido dinâmico. Por fim, 17 módulos foram obtidos da árvore de agrupamento do sistema, e o número de genes contidos em cada módulo de coexpressão é mostrado na Tabela 2.

Módulos-chave e triagem de genes de hub

Depois, analisamos os 3 principais módulos (módulos marrom, azul e turquesa) e procuramos descobrir os genes hub. Os padrões de expressão dos genes nos 3 módulos foram analisados. Conforme apresentado na Figura 2, o resultado revelou que os módulos azul e marrom estão negativamente correlacionados com a progressão da IRA, enquanto o módulo turquesa está positivamente correlacionado com a progressão da IRA. Em seguida, realizamos a análise funcional em cada módulo e descobrimos que os genes contidos nos módulos marrom, azul e turquesa estão estritamente relacionados aosrim, desenvolvimento do sistema geniturinário, alguns processos metabólicos essenciais e deposição de matriz extracelular (MEC), que estão estritamente relacionados à fibrose renal; em particular, acredita-se que o módulo turquesa desempenhe um papel essencial no desenvolvimento da fibrose renal após IRA (detalhes apresentados na Fig. 3A e consulte o suplemento on-line. Fig. 1A, 2A; consulte www.karger.com/doi/ 10.1159/000511661 para todo o material de suprimento online). Em seguida, procuramos encontrar genes hub em cada módulo e, após filtragem preliminar, os 5 principais genes – Lgals1, Rplp1, Col3a1, Col6a2 e Mgp – no módulo turquesa foram tratados como genes hub (como mostrado na Fig. 3B). Também realizamos uma análise semelhante nos módulos azul e marrom, mas não conseguimos encontrar genes hub considerando seus padrões de expressão e GS (conforme apresentado no suppl on-line. Fig. 1B, 2B).

Avaliação da Patologia Histológica e Renal

Função

Em seguida, construímos modelos animais Cis-AKI e IRI-AKI. Conforme mostrado no suppl online. Figura 3a, os resultados da coloração HE sugeriram que existia necrose tubular em modelos Cis-AKI/IRI-AKI, e oprejuízofoi acentuado ao longo do tempo. Enquanto isso, também pudemos observar que, em comparação com o grupo controle, houve um rápido aumento da Cr e do BUN séricos de forma tempo-dependente. Coletivamente, todos esses resultados indicaram o sucesso na construção de modelos animais de LRA.

Verificação do Gene Hub

Para confirmar ainda mais a confiabilidade do método WGCNA e rastrear genes hub intimamente relacionados à progressão da fibrose renal, com base acima, pretendemos validar a expressão dos 5 principais genes hub em modelos animais Cis-AKI e IRI-AKI por vantagem de PCR em tempo real, Western blotting e imunofluorescência in situ. Os níveis de expressão de mRNA de Lgals1, Rplp1, Col3a1, Col6a2 e Mgp norimdos camundongos foram detectados por PCR em tempo real. Há muitos relatos de pesquisas que indicam que Col3a1, Col6a2 e Mgp estão relacionados ao processo de fibrose renal [23, 25, 26]. No entanto, para Lgals1 e Rplp1, nenhum estudo foi feito sobre fibrose renal após LRA, então Western blot e imunofluorescência in situ foram usados ​​para verificar melhor a expressão de Lgals1 e Rplp1. Conforme mostrado na Figura 4B, em comparação com o grupo normal, os níveis de expressão de Lgals1 e Rplp1 em camundongos Cis-AKI e IRI-AKI também foram significativamente aumentados. Além disso, avaliamos a localização de Lgals1 e Rplp1 por imunofluorescência in situ. Conforme mostrado na Figura 5, Rplp1 está localizado principalmente nos glomérulos e tubular renal, e Lgals1 se distribui no intersticial e tubular renal. É importante ressaltar que também validamos a correlação entre Rplp1/Lgals1 e BUN/Cr, e os resultados indicaram que Rplp1/Lgals1 no nível de proteína foi positivamente correlacionado com BUN/Cr (todos R > 0.5,p <0.05) (fig.="">

Discussão

Evidências crescentes sugerem que a LRA acabará por evoluir para DRC/ESRD, com maior incidência [4, 27]. Até agora, existem terapias limitadas na transição de LRA para DRC [28-30]. Assim, uma melhor compreensão do mecanismo fisiopatológico e identificação de potenciais biomarcadores são muito úteis para prevenir essa transição e melhorar seu prognóstico. Neste estudo, realizamos WGCNA para analisar dados de microarray relacionados à transição de LRA para DRC. Um total de 17 módulos foram obtidos, e os 3 principais módulos gênicos foram empregados para análise posterior. Os resultados deste estudo sugeriram que os 3 módulos de genes estão intimamente relacionados com

Fig. 4. Validação dos genes hub no módulo turquesa. A Quantificação da expressão de mRNA de Lgals1, Col3a1, Rplp1, Mgp e Col6a2 por Q-PCR. B Western blot foi empregado para investigar a expressão da proteína indicada. C Quantificação da expressão da proteína por densitometria de varredura. ***p < 0.001="" em="" comparação="" com="" o="" grupo="" controle.="" d,="" e="" a="" correlação="" entre="" rplp1/lgals1="" e="" bun/cr="" (todos="" r=""> 0,5, p <>

Fig. 5. Validação da localização dos genes hub no módulo turquesa. A, B A localização e expressão de Lgals1 e Rplp1 por imunofluorescência in situ, respectivamente.

o desenvolvimento de fibrose renal após LRA na classificação GO, por exemplo, desenvolvimento do sistema renal, desenvolvimento vascular renal [31, 32], alguns processos metabólicos [33, 34], membrana interna mitocondrial, membrana interna de organela e MEC [35-37] ]. O desequilíbrio da MEC é uma das principais causas de fibrose renal. Após a IRA, a fibrose é afetada por múltiplos fatores, como células inflamatórias acumuladas, miofibroblastos ativados e assim por diante [30, 33]. Portanto, o presente estudo se concentrou no módulo turquesa, pois o módulo está intimamente relacionado ao ECM.

Em seguida, filtramos os genes no módulo turquesa calculando o GS, seguido pela geração da rede PPI. A partir da rede PPI no módulo turquesa, pode-se concluir que 6 genes S100a6, Col3a1, Col6a2, Mgp, Rplp1 e Lgals1 apresentaram a maior conectividade com outros genes vizinhos e localizados no centro da rede PPI. S100a6 é codificado por ser um membro da família de proteínas S100. Tem sido relatado na literatura que S100a6 pode regular a proliferação celular e participar de processos patológicos imunomediados de transição epitélio-mesenquimal renal e fibrose [38, 39]. Col3a1 e Col6a2 são cadeias de colágeno tipo III alfa-1 e colágeno tipo VI alfa-2, respectivamente. Codificam o colágeno, ligam-se às proteínas da maquinaria extracelular e são extremamente importantes nos componentes da matriz celular. Quando a fibrose ocorre em órgãos como fígado e rim, a expressão desses colágenos é elevada, o que é um indicador essencial para julgar a evolução da doença e observar o efeito terapêutico [23, 25]. O Mgp, uma matriz da proteína Gla, é um membro da família osteocalcina/Mgp que se expressa após a DRC e está associado ao prognóstico renal [26, 40]. Em consonância com estudos anteriores, nossa pesquisa também revelou que S100a6, Col3a1, Col6a2 e Mgp são potenciais marcadores de diagnóstico precoce de fibrose renal após LRA.

Rplp1, um gene que codifica uma proteína ribossomal que faz parte da subunidade 60S, desempenha um papel importante na etapa de alongamento da síntese proteica. Rplp1 é altamente expresso em várias células cancerosas humanas e sua falta afetará a síntese de proteínas, levando à apoptose [41, 42]. Lgals1, também conhecido como Galectina-1, é um membro da família de proteínas de ligação -galacto-side-binding e desempenha um papel na regulação da apoptose, proliferação celular e diferenciação celular. Lgals1 é um ponto de pesquisa no campo de tumores, e muitos estudos recentes relataram que também desempenha um papel vital no processo de fibrose de órgãos. Foi indicado que Lgals1 é altamente expresso em rins de diabetes tipo I e tipo II e é um novo marcador de fibrose renal [43-45]. No entanto, vale ressaltar que Rplp1 e Lgals1 não foram relatados em fibrose renal após LRA. No presente estudo, provamos preliminarmente que Rplp1 e Lgals1 podem ser usados ​​como potenciais biomarcadores na fibrose renal após LRA por meio de bioinformática e de forma experimental. Nossas múltiplas análises experimentais indicaram que a exibição de Lgals1 e Rplp1 aumentou dramaticamente nos rins de IRI-AKI e Cis-AKI, e a expressão dos 2 genes é aumentada após 3 dias e diminuída após 7 dias, o que é consistente com os resultados analisados ​​por o método de bioinformática WGCNA.

Deve-se notar que existem várias limitações do estudo: primeiro, o número de amostras usadas para análise é relativamente insuficiente, o que pode omitir ou diminuir a precisão da análise. Em segundo lugar, os genes hub foram investigados apenas no modelo de roedor AKI, em vez de espécimes humanos, o que também pode dificultar a tradução das descobertas do camundongo para o humano. Existem muitos estudos sobre LGALS1 em câncer humano, e sua expressão é elevada em câncer de rim. A segmentação LGALS1 pode inibir o desenvolvimento de seus tumores. Embora RPLP1 tenha sido encontrado em endometriose, tumores ginecológicos e outras doenças, não foi estudado em rins humanos. Investigações adicionais de genes hub em espécimes humanos, como excreção urinária, podem elucidar melhor seu papel biológico clinicamente. Em conclusão, o presente estudo lançou as bases para um estudo mais aprofundado do papel de Rplp1 e Lgals1 na LRA.

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Conclusões

Em resumo, este estudo identificou os principais genes relacionados à IRA por meio da análise WGCNA e encontrou experimentalmente 2 genes hub com potencial para novas pesquisas, Rplp1 e Lgals1. No entanto, o mecanismo específico na patogênese da LRA permanece com mais pesquisas. Os genes candidatos críticos selecionados fornecem novas direções de pesquisa para a prevenção, diagnóstico, tratamento e prognóstico da fibrose renal.

Declaração de Ética

Todos os animais foram tratados de acordo com as Diretrizes do National Institutes of Health para o uso e cuidado de animais de pesquisa.

Declaração de conflito de interesse

Os autores declararam que não há conflitos de interesse.

Fontes de financiamento

Este trabalho foi apoiado por Luzhou – Southwest Medical Joint Platform Project (2017LZXNYD-P01 e 2018LZXNYD-PT03), o Projeto de Construção do Sichuan Provincial Key Laboratory of Medicine (2018#53), o Sichuan Science and Technology Project (2020YJ0442); a Bolsa Especial Conjunta Luzhou Municipal – Southwest Medical University para a Introdução de Talentos de Alto Nível (Equipe Lan Hui-Yao); e o Programa Conjunto da Southwest Medical University e do Affiliated Traditional Medicine Hospital (2018XYLH-029).

Contribuições do autor

Li Wang e Jianchun Li conceberam e coordenaram o estudo. Xiao Lin escreveu o jornal. Jianchun Li revisou o artigo. Jianchun Li realizou a análise de bioinformática. Xiao Lin realizou o experimento com animais e realizou o PCR em tempo real, IHC e IF. Xia Zhong e Jieke Yang realizaram o WB e coletaram as amostras renais do camundongo. Ruizhi Tan realizou a análise estatística. Todos os autores revisaram os resultados e aprovaram a versão final do manuscrito.

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