Gossipitrina, um flavonóide de ocorrência natural, atenua os danos neuronais e mitocondriais induzidos pelo ferro Parte 1

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Abstrato:A ruptura da homeostase do ferro é um fator importante na perda da função mitocondrial nas células neurais, levando à neurodegeneração. Aqui, avaliamos a ação protetora da gossipitrina (Gos), um flavonóide de ocorrência natural, no dano celular neuronal induzido pelo ferro usando células HT-22 do hipocampo de camundongo e mitocôndrias isoladas de cérebros de ratos. Gos conseguiu resgatar células HT22 do dano induzido por 100 uM Fe()-citrato (EC50 8,6 uM). Essa proteção foi ligada à prevenção tanto da dissipação do potencial de membrana mitocondrial induzida pelo ferro quanto da depleção de ATP. Em mitocôndrias isoladas, Gos (50uM) provocou proteção quase completa contra o inchaço mitocondrial induzido pelo ferro, a perda do potencial transmembranar mitocondrial e a depleção de ATP. Gos também preveniu a peroxidação lipídica mitocondrial induzida por Fe(Ⅱ)-citrato com um valor ICs0 （12,45 μM） que foi cerca de nove vezes menor do que o induzido por terc-butil hidroperóxidooxidação. Além disso, o flavonóide foi eficaz na inibição da degradação de 15 e 1,5 mM de 2-desoxirribose. Também diminuiu a concentração de Fe(II) com o tempo, aumentando a taxa de consumo de O2 e prejudicando a redução de Fe(II) pelo ascorbato. Complexos Gos-Fe(I) foram detectados por espectroscopia UV-VIS e IR, com uma estequiometria Gos-ferro aparente de 2:1. Os resultados sugerem que o Gos geralmente não atua como um antioxidante clássico, mas afeta diretamente o ferro, mantendo-o em sua forma férrica após estimular a oxidação do Fe(II). Os íons metálicos seriam, portanto, incapazes de participar de uma reação do tipo Fenton e da fase de propagação da peroxidação lipídica. Assim, Gos poderia ser usado para tratar doenças neuronais associadas ao estresse oxidativo induzido pelo ferro e danos mitocondriais.

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Palavras-chave: gossipitrina; ferro; células HT-22; mitocôndria;neurodegeneração; neuroproteção

1. Introdução

O ferro é um cofator essencial em muitos processos biológicos cruciais, como síntese e restauração de DNA, transporte de oxigênio, respiração celular, metabolismo xenobiótico e síntese hormonal. No entanto, em altos níveis intracelulares, pode aumentar as espécies celulares reativas de oxigênio com uma modificação nos potenciais redox celulares [2,3]. A dishomeostase do ferro é observada em quase todas as condições neurológicas, como doença de Parkinson (DP), doença de Alzheimer (DA), doença de Huntington (HD), esclerose múltipla, ataxia de Friedreich, epilepsia, síndrome das pernas inquietas e acidente vascular cerebral [4,5]. Particularmente, na hemorragia intracerebral, onde há uma ruptura das microvasculaturas e o sangue liberado produz uma exposição de células neurais ao ferro derivado do sangue, os principais mecanismos de neurodegeneração são a produção de EROs induzidas por ferro e heme, inflamação e excitotoxicidade. ,7]. Modelos experimentais in vitro e in vivo de hemorragia cerebral mostraram a presença de ferroptose, uma forma de necrose regulada dependente de ferro [8]. Além disso, evidências crescentes sugerem que a ruptura da homeostase do ferro é essencial na perda da função mitocondrial nas células neurais [9,10], o que poderia, por sua vez, levar à neurodegeneração [11-14. Uma relação foi recentemente relatada entre a forma precoce da doença de Parkinson com desregulação do metabolismo do ferro e comprometimento mitocondrial [15]. A coexistência de quantidades relativamente altas de ferro e ROS nos compartimentos mitocondriais torna essa organela suscetível a danos mediados por radicais hidroxila. Os agentes farmacológicos que visam a regulação do ferro cerebral e o comprometimento mitocondrial mediado pelo ferro podem, portanto, ser terapeuticamente úteis contra a neurodegeneração. Vários agentes quelantes de ferro demonstraram exibir ações neuroprotetoras em diferentes modelos experimentais [16-19]. Por outro lado, tem havido muitos relatos sobre o potencial neuroprotetor de polifenóis naturais devido às suas ações antioxidantes baseadas em uma combinação de quelação de ferro e atividades de eliminação de radicais livres [20,21]. Nosso grupo observou que polifenóis contendo catecol como mangiferina, gutiferona-A e rapanona interagem com o ferro, tanto in vitro quanto in vivo, anulando assim seu papel catalítico na promoção de EROs [22-28]. Também relatamos recentemente os potentes efeitos antioxidantes da gossipitrina (Gos), um flavonóide natural (Figura 1), indicando seu uso potencial como agente neuroprotetor [29]. No entanto, pouco se conhece sobre os mecanismos envolvidos nesses efeitos antioxidantes. A presença de um sistema cíclico planar de seis membros com deslocalização eletrônica, uma porção catecol e mais três grupos hidroxila aromáticos (dois deles adjacentes a um grupo carbonila), sugere fortemente que esta molécula poderia atuar como agente quelante de ferro, uma vez que estes são características estruturais que favorecem a quelação de ferro por flavonóides 30]. Assim, o objetivo deste estudo é avaliar a capacidade de Gos para proteger HT-22células neuronaise mitocôndrias de cérebro de rato isoladas de células mediadas por ferroDano oxidativo. Outros estudos em sistemas livres de células/mitocôndrias foram realizados para caracterizar ainda mais a natureza da interação Gos-ferro.

2. Resultados

2.1. Gos resgata células HT-22 da morte celular induzida por Fe(I)

Fe（II）（100 μM） reduziu a sobrevivência das células HT-22 para 17,4 por cento após 24 h de exposição, conforme estimado pelo ensaio MTT. Gos preveniu a morte das células do hipocampo de forma dose-dependente. O EC50 foi de 8,64± 1,58 μM（Figura 2A, detalhe）. A proteção total das células foi observada com 100 μM de Gos foi mais eficaz do que Trolox（500 uM）, o conhecido antioxidante hidrossolúvel, que preveniu a morte celular em 74%.

A exposição de HT-22 ao ferro por 2 h (antes da execução da morte celular) induziu a dissipação do potencial de membrana mitocondrial, estimado pela retenção de rodamina 123 dentro das organelas (Figura 2B) e depleção de ATP (Figura 2C ). Isso sugere uma possível associação entre os efeitos tóxicos mediados pelo ferro nas mitocôndrias e a viabilidade celular. Gos preveniu o comprometimento das mitocôndrias induzido pelo ferro, seguindo os padrões de viabilidade neuronal que mostrou que pode prevenir a morte celular HT-22 induzida pelo ferro através da proteção mitocondrial.

Figura 2. Proteção de Gos contra dano celular neuronal induzido por ferro. Efeitos de Gos na sobrevivência de neurônios hipocampais de camundongos HT-22 (A), potencial de membrana mitocondrial celular (B) e níveis de ATP celular（C）. Gos（0-100 μM） ou Trolox（500 μM） foram co-incubados por 24 h (viabilidade) ou 2h (potencial de membrana mitocondrial e níveis de ATP) com 100 μM FeCl2/ 1 mM de citrato. As condições do ensaio são descritas na Seção 4. As células de controle danificadas (sem Gos) continham DMSO (0,001 por cento) mais a mistura de citrato de ferro. Os resultados são expressos como a porcentagem de morte celular em relação ao controle não danificado (contendo DMSO0,001 por cento como veículo). Os valores são as médias ± SD de três experiências diferentes. Símbolos diferentes indicam diferenças estatísticas em p<0.05 when="" comparing="" all="" pairs="" of="" experimental="" groups="" according="" to="" the="" anova="" and="" post="" hoc="" newman-keuls="" tests.="" (if="" the="" symbols="" are="" different="" among="" groups="" indicate="" statistical="" differences,="" when="" they="" are="" equal,="" there="" is="">

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2.2. Gos Rescues Rat-Brain Mitochondria from Iron-Induced Mitochondrial Lipoperoxidation Brain mitochondria incubated with Fe（）-citrate （50 μM） underwent a marked lipoperoxidation expressed by an increase in the formation of the thiobarbituric acid reactive substance(Figure 3A). Gos inhibited the iron-mediated mitochondrial lipid peroxidation in a concentration-dependent manner （IC50 value of 12.45±1.24 μM） （Figure 3A, inset）. The effects of Gos on tert-butyl hydroperoxide（300 μM）-induced mitochondrial lipid peroxidation（IC50 value>100 μM） mostra que é mais eficaz na prevenção da peroxidação lipídica induzida pelo ferro do que a peroxidação lipídica induzida por peroxil, sugerindo sua capacidade de agir diretamente no ferro (Figura 3B).

Figura 3. Gos inibe a formação de malondialdeído nas mitocôndrias, induzida por 50 uM de Fe()-citrato (A) ou 300 μM de terc-butil hidroperóxido (B). As mitocôndrias de rato (1 mg/mL) foram incubadas em um meio de reação contendo 125 mM de sacarose, 65 mM de KCl, 10 mM de tampão HEPES (pH 7,4), 2 mM de succinato e 2,5 uM de rotenona, com ou sem Gos(1-50 um). Os experimentos começaram pela adição de 50μM de Fe (II) ou 300 μM de hidroperóxido de terc-butila, exceto para o Controle não danificado (barras cinza). O período de incubação foi de 20 min a 28 graus C. Os valores são as médias ±SD (n=6). Símbolos diferentes indicam diferenças estatísticas em p<0.05 when="" comparing="" all="" experimental="" groups="" according="" to="" the="" anova="" and="" posthoc="" newman-keuls="" tests.="" (if="" the="" symbols="" are="" different="" among="" groups="" indicate="" statistical="" differences,="" when="" they="" are="" equal,="" there="" is="">

2.3.Gos previne a dissipação do inchaço mitocondrial mediado pelo ferro e a depleção de ATP

A Figura 4A mostra que o complexo 50μM Fe（I）-citrato induziu o inchaço mitocondrial conforme expresso por uma diminuição na absorbância a 540nm (linha f versus linha a). Foi associado a uma despolarização △Y espontânea e completa (Figura 4B, linhaf versus linha a) e depleção de ATP (Figura 4C, coluna Fe()/citrato). Gos inibiu o processo de inchaço induzido pelo ferro e a dissipação de AY de uma maneira dependente da concentração (Figura 4A, linhas B). Os valores de absorbância (média ± SD em 7 min) do Painel A foram: 0,482±0.013 (linha a), 0,459± { {23}}.011 (linha b),0,445± 0.007 (linha c),0,435± 0,015( linha d), 0,360±0,011(linha e), e 0,338±0,012(linha f). Os valores de fluorescência do Painel B (média ± SD em 7 min) foram 15,03 ± 1,71 (linha a), 19,41 ± 2,07 (linha b), 22,29 ± 2,58 (linha c), 45,505 ± 4,47 (linha d), 118,468 ± 5,76 (linha e) e 146,201±5,83 (linha f). Foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre a linha f e as demais linhas, em p<0.05. the="" naturally="" occurring="" flavonoids="" also="" prevented="" iron-mediated="" atp="" depletion="" in="" a="" concentration-dependent="" manner(figure="" 4c).="" a="" strong="" interaction="" of="" gos="" with="" iron="" is="" suggested="" as="" the="" key="" mechanism="" for="" neuroprotection="" against="" iron-induced="" damage,="" both="" in="" ht-22="" neuronal="" cells="" and="" in="" brain="" mitochondria.="" to="" further="" characterize="" this="" gos-iron="" interaction,="" different="" experiments="" on="" a="" cell/mitochondria-free="" system="" were="">

Figura 4. (A) Indução de transição de permeabilidade mitocondrial, (B) perda de potencial de membrana mitocondrial （AH） e redução （C） dos níveis de ATP induzida por 50 μM Fe（II）-citrato. A foi estimado usando a sonda de fluorescência safranina （5 uM）. Os efeitos inibitórios de Gos 50,25, 10 e 1μM são mostrados nas linhas (b),(c), (d) e (e), respectivamente. As linhas (a) e (f) representam controles não danificados (sem ferro) e controles danificados (sem Gos), respectivamente. Mitocôndrias de cérebro de rato (RBM-0,5 mg/mL), Fe（II） e 1 μM CCCP foram adicionados onde indicado pelas setas. Diferentes símbolos no gráfico (C) indicam diferenças estatísticas em p<0.05 when="" comparing="" all="" pairs="" of="" experimental="" groups="" according="" to="" the="" anova="" and="" post="" hoc="" newman-keuls="" tests.(if="" the="" symbols="" are="" different="" among="" groups="" indicate="" statistical="" differences,="" when="" they="" are="" equal,="" there="" is="">

2.4. Gos induz autoxidação de citrato de Fe(II) e O, consumo

Gos diminuiu a concentração de Fe() (1-min de pré-incubação) em um meio de reação contendo 2 mM de citrato (sem mitocôndrias) de maneira dose-dependente (Figura 5A, círculos pretos).A 5-min de período de pré-incubação (Figura 5A, caixas vermelhas)diminuiu ainda mais a concentração de Fe(II). Gos também aumentou a taxa de consumo de O2, possivelmente devido à oxidação de Fe(ll) a Fe(ⅡII)(Figura 5B,C). Esses resultados sugerem que Gos pode estar removendo Fe(II) do complexo citrato e oxidando-o para a forma férrica em um processo que requer O2 como aceptor de elétrons. Assim, Gos pode estar impedindo a formação de radicais "OH ao inativar o Fe(Il) necessário para a reação do tipo Fenton-Haber-Weiss, que pode iniciar a peroxidação lipídica da membrana mitocondrial.

Figura 5. (A)Gos estimula a autoxidação de Fe(Ⅲl) na ausência de mitocôndrias de cérebro de rato em um meio padrão suplementado com 1 mM de citrato e 5 mM1,10-fenantrolina.1,10-fenantrolina foi adicionados 1 ou 5 minutos após o período de incubação de Gos-Fe(II), e as absorbâncias foram lidas a 510 nm. Os valores são a média de três determinações. * diferença estatística em p<0.05 when="" comparing="" 1="" vs.="" 5min="" incubation.="" (b)effects="" of="" gos="" on="" o,="" consumption="" mediated="" fe(il)="" autoxidation="" in="" a="" standard="" medium="" supplemented="" with="" 1="" mm="" citrate="" under="" the="" following="" conditions:(a)="" no="" gos,(b)10="" um="" gos,="" （c）="" 30μm="" gos,="" （d）50="" μm="" gos,and="" （e）100μm="" gos.="" fe（ii）="" （50μm）="" was="" added="" where="" indicated="" by="" the="" arrow.="" results="" are="" representative="" of="" three="" experiments.="" (c)="" oxygen="" consumption="" rate="" (nmol="" o2/min/ml)1="" min="" after="" fe()="" addition.legends="" are="" the="" same="" as="" in(b).="" different="" symbols="" indicate="" statistical="" differences="" at=""><0.05 when="" comparing="" all="" pairs="" of="" experimental="" groups="" (in="" the="" same="" cell="" type)="" according="" to="" the="" anova="" and="" post="" hoc="" newman-keuls="" tests.="" (if="" the="" symbols="" are="" different="" among="" groups="" indicate="" statistical="" differences,="" when="" they="" are="" equal,="" there="" is="">

Este artigo foi extraído de Molecules 2021, 26, 3364. https://doi.org/10.3390/molecules26113364 https://www.mdpi.com/journal/molecules