Determinação de equinacosídeo em extrato aquoso de Cistanche Herba por HPLC

Resumo: ObjetivoUm método de HPLC foi estabelecido para a determinação de equinacosídeo no extrato aquoso deCistanche erva.MétodosO equinacósido foi determinado por HPLC. A separação foi realizada no Inertsil ODS-SP-C18 coluna com fase móvel composta por acetonitrila(A)e solução de ácido fosfórico 0,4%(B), por gradienteeluição. O comprimento de onda de detecção foi definido em 333 nm, e a temperatura da coluna era de 30 graus. A vazão foi de 1,0mL·min-1 e o volume de injeção foi de 10μL. ResultadosA relação linear deequinacósidodentro da concentraçãointervalo de 44.939 7-539.276 4 ug ·mL- 1 foi bom(r = 0.999 8). As recuperações foram de 94,59%-105,31%(RSD=2.93%,n = 9). O conteúdo de equinacosídeo nos extratos aquosos de Cistanche herba foi de 15,527,7.347,12,267 mg·g-1. 

ConclusãoO método HPLC estabelecido com boa repetibilidade é preciso, simples e viável. É adequadopara a determinação de equinacosídeo noextrato aquoso de Cistanche herba. 

Palavras-chave:HPLC;extrato aquoso de Cistanche herba; equinacósido; determinação de conteúdo

NOVA FORMULAÇÃO HERBAL PARANUTRITIVO YANG DO RIM

Cistanche deserticolaé um tônico da medicina tradicional chinesa comumente usado na prática clínica e é conhecido como "ginseng do deserto" [1]. OCistanche deserticolaregistrado na edição de 2015 doFarmacopeia Chinesaé o caule carnudo e seco com folhas escamosas deCistanche deserticola YC MaouCistanche tubulosa (Schenk) Wight. É quente, doce e salgado e retorna aos meridianos dos rins e do intestino grosso. Tem os efeitos de nutrir o yang do rim, reabastecer a essência e o sangue e hidratar os intestinos e laxantes [2]. "A Matéria Médica de Shen Nong" diz que pode "tonificar o meio, nutrir os cinco órgãos internos, fortalecer o yin e nutrir a essência". Cistanche deserticola contém principalmente glicosídeos feniletanóides, iridóides e seus glicosídeos, lignanas e seus glicosídeos, polissacarídeos, compostos de éster e alcalóides [3].

Os glicosídeos feniletanóides são os principais ingredientes ativos da Cistanche deserticola, entre os quais a equinaceasida e o verbascosídeo são os componentes do índice para identificação e determinação do conteúdo de Cistanche deserticola na Farmacopeia Chinesa. Estudos farmacológicos [4] mostram que Cistanche deserticola tem vários efeitos farmacológicos, como laxante, proteção hepática, anti-osteoporose, antioxidante, anti-envelhecimento e anti-fadiga. O extrato aquoso de Cistanche deserticola pode promover o gene da proteína morfogenética óssea 2 em osteoblastos de ratos, bem como fosfatase ácida resistente ao tartarato e cálcio ósseo no soro de camundongos ovariectomizados.

A expressão dos genes Smad1, Smad5, fator transformador de crescimento, etc. na medula óssea e na medula óssea tem efeito antiosteoporótico [5-6].

A equinácea pode promover a proliferação de osteoblastos e promover a diferenciação de células-tronco mesenquimais da medula óssea cultivadas in vitro em osteoblastos [7-9]. Nos últimos anos, tem havido muitos relatórios de pesquisa sobre a determinação do conteúdo de equinacosídeo e verbascosídeo no extrato etanólico de Cistanche deserticola e suas preparações compostas [10-12], mas há poucos relatórios sobre a determinação do conteúdo dos componentes do índice em Cistanche deserticola extrato aquoso. Neste estudo, a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) foi usada para determinaro conteúdo da equináceanoextrato aquoso de Cistanche deserticola.

1 material

1.1 Instrumentos

Cromatógrafo líquido de alto desempenho LC-20AT, detector SPD-20A, amostrador automático SIL-20A, forno de coluna ASvp CTO{4}}, estação de trabalho de cromatografia líquida em solução LC, Shimadzu Corporation, Japão; Balança analítica eletrônica MES125P-OCE-DU, Sartorius, Alemanha; Bomba de vácuo multifuncional de água circulante SHZ-D (III), Henan Yuhua Instrument Co., Ltd.; Sistema de circulação de resfriamento do evaporador rotativo RC2B SO25, evaporador rotativo RV 10 D S96, IKA, Alemanha; Banho-maria elétrico de temperatura constante DK-S26, Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.; Máquina de água ultrapura série UPR, Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd.

1.2 Materiais medicinais e reagentes

Os materiais medicinais Cistanche deserticola foram adquiridos da Guangzhou Lingnan Chinese Medicine Pieces Co., Ltd., números de lote: 1801001, 1806001 e 181001. Foi identificado como o caule carnudo seco com folhas escamadas de Cistanche deserticola YCMa da família Orobanchaceae pelo Chefe Chinês Farmacêutico de Medicina Tu Xingming do Terceiro Hospital Afiliado da Universidade de Medicina Chinesa de Guangzhou. A amostra é armazenada na Sala de Testes de Drogas do Terceiro Hospital Afiliado da Universidade de Medicina Chinesa de Guangzhou; a substância de referência equinacosídeo, o conteúdo é de 89,7%, o número do lote é: 111670-201706 do China Food and Drug Inspection Institute; o acetonitrilo é cromatograficamente puro (Merck, Alemanha); o metanol e o ácido fosfórico são analiticamente puros (Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.); a água é ultrapura.

2 Métodos e Resultados

2.1 Preparação do extrato aquoso de Cistanche deserticola

Pegue o pó bruto de Cistanche deserticola, adicione 10 vezes a quantidade de água destilada, aqueça e refluxe para extrair duas vezes, cada vez por 1 h, filtre, combine o filtrado e concentre o filtrado para 0,100 g·mL -1 de droga bruta por evaporador rotativo e armazene-a a 4 graus para uso posterior.

2.2 Condições cromatográficas e adequação do sistema

Coluna cromatográfica: coluna Inertsil ODS SP C18 (150 mm × 4,6 mm, 5 μm); fase móvel: acetonitrila (A)-0solução de ácido fosfórico 0,4% (B), eluição gradiente: 0 ~ 5 min, 17%A; 5~25 min, 20% de A; 25~30 min, 17% de A; comprimento de onda de detecção: 333 nm; temperatura da coluna: 30 graus; vazão: 1,0 mL·min-1; volume de injeção: 10 μL. Sob esta condição cromatográfica, a separação entre o equinacósido e os picos dos componentes adjacentes é superior a 1,5, e o número teórico de placas baseado no pico do equinacósido não deve ser inferior a 4,000. O cromatograma é mostrado na Figura 1.

Figura 1 Cromatogramas de HPLC de equinacosídeo (A) e extrato aquoso de Cistanche herba (B)

2.3 Preparação da solução

2.3.1 Solução de referência

Pesar uma quantidade apropriada de referência de equinacósido, pesá-lo com precisão, colocá-lo em um balão volumétrico de 10 mL, adicionar metanol para dissolvê-lo e preparar uma solução de referência contendo 898,794 ug de equinacósido por mL e armazená-la a 4 graus para uso posterior.

2.3.2 Solução de teste

Meça com precisão 2.0 mL de extrato aquoso de Cistanche deserticola, evapore até a secura em banho-maria, adicione metanol para dissolvê-lo, complete o volume em um balão volumétrico de 10 mL, agite bem, e filtrá-lo através de uma membrana de filtro microporosa de 0,22 μm para obter a solução.

2.4 Investigação de relacionamento linear

Meça com precisão {{0}},25, 0,50, 1.00, 2.00, 2,50, 3.00 mL da solução de referência em 2.3.1 e colocar em um balão volumétrico de 5 mL, adicionar metanol para completar o volume, agitar bem e obter uma solução de referência com gradiente de concentração de 44.939 7, 89.879 4, 179.{ {21}}, 359.517 6, 449.397 0, 539.276 4ug·mL-1,e filtrar através de uma membrana microporosa de 00,22 μm. Medir de acordo com as condições cromatográficas em 2.2 e registar a área do pico.

Execute a regressão linear com a concentração de massa de referência como eixo horizontal (X, ug·mL{{0}}) e a área do pico como eixo vertical (Y) e obtenha a equação de regressão: Y{{1 }}.0X-32 273.0, r=0.999 8. Os resultados mostraram que o equinacosídeo teve uma boa relação linear na faixa de concentração de 44,939 7 ~ 539,276 4 ug·mL-1.

2.5 Teste de precisão

Pegue 539.276 4 ug ·mL- 1 de solução de referência e injete e meça continuamente 6 vezes de acordo com as condições cromatográficas em 2.2 e registre a área do pico. O RSD da área do pico do equinacósido foi de 1,81%, indicando que o instrumento apresentou boa precisão.

2.6 Teste de estabilidade

Meça com precisão 2.0 mL de extrato aquoso de Cistanche deserticola, evapore até a secura em banho-maria, dissolva em metanol, dilua para balão volumétrico de 10 mL, agite bem, filtre com 0 Membrana de filtro microporosa de 0,22 μm e injete e meça em 0, 2, 4, 8, 12 e 24 h de acordo com as condições cromatográficas em 2.2 e registre a área do pico. Resultados O RSD da área do pico do equinacosídeo foi de 1,16%, indicando que a solução de teste apresentou boa estabilidade em 24 horas.

2.7 Teste de repetibilidade

Meça com precisão 6 porções de 2,0 mL de extrato aquoso de Cistanche deserticola, prepare 6 porções de solução de teste em paralelo de acordo com o método em 2.3.2, e injete e meça de acordo com as condições cromatográficas em 2.2, e registre a área do pico. Resultados O RSD da concentração mássica de equinacósido foi de 1,28%, indicando que o método apresentou boa repetibilidade.

2.8 Teste de recuperação de amostra

Meça com precisão 9 porções de 1,0 mL de extrato aquoso de Cistanche deserticola, adicione 0,8, 1,0 e 1,2 mL de solução de referência (1,552 mg·mL{{11 }}) respectivamente, evaporar até a secura em banho-maria, dissolver em metanol e diluir para um balão volumétrico de 10 mL; agite bem, filtre com uma membrana de filtro microporosa de 0,22 μm para obter concentrações altas, médias e baixas da solução de teste, prepare 3 porções de cada concentração em paralelo e meça de acordo com as condições cromatográficas em 2.2, registre a área do pico e calcule a recuperação da amostra. Os resultados são mostrados na Tabela 1.

2.9 Determinação do Conteúdo da Amostra

Meça com precisão 2.0 mL de extrato aquoso de Cistanche deserticola em 3 porções, evapore até a secura em banho-maria, dissolva em metanol, dilua para 10 mL em balão volumétrico, agite bem, filtre com uma membrana de filtro microporosa de 0,22 μm e determine de acordo com as condições cromatográficas em 2.2, registre a área do pico e calcule o conteúdo de equinacosídeo. Os resultados são mostrados na Tabela 2.