Perfil de transcriptoma e lipidoma de células-tronco mesenquimais humanas com senescência reduzida e capacidade de diferenciação de trilinhagem aumentada após tratamento com drogas

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ABSTRATO

As células-tronco mesenquimais humanas (hMSCs) são células multipotenciais amplamente utilizadas na terapia celular. No entanto, a senescência frequentemente surgida e a diminuição das capacidades de diferenciação limitaram as amplas aplicações do MSC. Várias estratégias, como o tratamento com pequenas moléculas, têm sido amplamente estudadas e usadas para melhorar as características do caule, contornando a senescência, mas os mecanismos exatos para reduzir a senescência não foram totalmente estudados. Neste estudo, as hMSCs foram tratadas com rapamicina, oltipraz, metformina e vitamina C pelo tempo indicado e essas células foram submetidas à avaliação de senescência e diferenciação de trilinhagem. Além disso, conjuntos de dados transcriptômicos e lipidômicos de hMSCs após o tratamento com drogas foram analisados ​​para interpretar as vias biológicas responsáveis ​​por seus efeitos anti-senescência. Embora quatro drogas tenham exibido atividades significativas na promoção da diferenciação osteogênica de MSC, a metformina é a droga ideal para promover a diferenciação de trilinhagem. Os termos GO ilustraram que os efeitos antienvelhecimento das drogas estavam principalmente associados aos processos de senescência celular, mitótica e meiose. A biossíntese de fosfatidilcolinas (PC) e fosfatidiletanolamina (PE) foi inibida enquanto a produção de fosfatidilinositóis (PIs) e ácidos graxos saturados (SFA)/ácidos graxos monoinsaturados (MUFA) foi ativada. Os ácidos graxos livres médios (FFA) foram aumentados em hMSCs com diferentes fenótipos antienvelhecimento. Portanto, estabelecemos um método abrangente para avaliar a intervenção medicamentosa com base nos resultados da transcriptômica e da lipidômica. O método pode ser usado para estudar diferentes fenótipos biológicos mediante intervenção medicamentosa em MSC, o que ampliará a aplicação clínica de hMSCs.

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INTRODUÇÃO

O envelhecimento, um processo dependente do tempo, causará disfunção fisiológica. O envelhecimento é o principal fator de risco para muitas doenças, incluindo câncer, doenças neurodegenerativas e diabetes. A exaustão das células-tronco e a senescência celular são uma das marcas que determinam o fenótipo fisiológico durante o envelhecimento [1]. As células-tronco mesenquimais humanas (hMSCs) são células multipotenciais presentes na medula óssea, tecido adiposo, placenta, cordão umbilical, músculo e muitos outros tecidos [2-6]. Sob meio de linhagem específica, as hMSCs podem sofrer diferenciação em adipócitos, osteoblastos e condrócitos, bem como outras linhagens celulares in vitro. Portanto, as hMSCs desempenham papéis importantes na medicina regenerativa e na terapia celular. No entanto, o uso clínico de MSC é limitado pelo envelhecimento durante o cultivo in vitro mais longo. O envelhecimento das hMSCs foi geralmente associado à alteração do comprimento dos telômeros, densidade celular, potencial de proliferação, potencial de diferenciação da linhagem, epigenética, função mitocondrial e secretoma [7]. Portanto, a superação do envelhecimento das MSC merece estudos mais aprofundados para explorar as estratégias para inibir a senescência das hMSC. A metformina (TAME) é o primeiro medicamento aprovado em um ensaio clínico para retardar o envelhecimento [8] e também é um medicamento de primeira linha aprovado pela FDA para o tratamento do diabetes mellitus tipo e 2 [9].cistanchA agonizante via Nrf2 é considerada o mecanismo subjacente para a metformina mediar o alongamento da vida útil [10]. Oltipraz, um agente antiesquistossomótico, também foi usado para inibir a progressão do câncer pela via NRF2 em um modelo de roedor [11, 12]. Também foi relatado que o oltipraz exibiu um efeito antienvelhecimento ao reprimir a via antioxidante NRF2 [13]. Além disso, a rapamicina (Sirolimus) foi usada para revestir stents coronários, prevenir a rejeição de transplantes de órgãos e tratar linfangioleiomiomatose [14]. Foi relatado que a rapamicina poderia inibir a ativação de células T e células B através da inibição de mTOR [15], o que foi confirmado pelo agravamento da deficiência de células-tronco [16]. A vitamina C é um redutor bem conhecido e foi relatado para aliviar o envelhecimento no modelo de células-tronco da síndrome de Werner [17]. No entanto, se eles compartilharam caminhos semelhantes para exercer seus papéis no antienvelhecimento e os mecanismos específicos para suprimir o envelhecimento celular em humanos ainda não estão claros. Além disso, o transcriptoma e o lipidoma para essas MSC tratadas pelas quatro drogas não foram totalmente investigados, o que nos levou a realizar os experimentos abaixo para abordar essas questões importantes.

Cistanche pode anti-envelhecimento

Neste estudo, metformina, oltipraz, rapamicina e vitamina C foram usados ​​para tratar hMSCs de medula óssea (BM-hMSCs). Primeiramente, fenótipos de diferenciação de hMSCs após o tratamento foram caracterizados para ilustrar seus potenciais antienvelhecimento. A análise transcriptômica e lipidômica foi realizada nas células tratadas com a droga. Posteriormente, a análise de GO com base no conjunto de dados transcriptômicos foi realizada para ancorar os eventos de sinalização responsáveis ​​pelas atividades de senescência e antienvelhecimento. O perfil metabólico e a análise da via foram conduzidos, o que ilustra uma flutuação da produção de lipídios durante o tratamento com drogas. Ao todo, estabelecemos um sistema geral de avaliação da intervenção medicamentosa na senescência de hMSCs. O sistema pode ser usado para estudar diferentes fenótipos biológicos mediante intervenção medicamentosa em MSC, o que ampliará a aplicação clínica de hMSCs.

RESULTADOS

BM-hMSC sujeitos à senescência após um longo tempo de cultura in vitro

As BM-hMSCs são células-tronco multipotentes com características comuns de autorrenovação e diferenciação em diferentes tipos celulares. No entanto, com o aumento da passagem in vitro, as células são gradualmente sujeitas à senescência e perderão a maior parte de suas capacidades de diferenciação. O estado das BM-hMSCs foi analisado em diferentes passagens (P2, P8, P13) e a condição da célula piorou, comprovada pela desaceleração da proliferação celular, aumento da morte e alongamento da morfologia (Figura 1A). Além disso, as habilidades de diferenciação de trilinhagem de P8 BM-hMSCs também foram testadas. Conforme mostrado na Figura 1B, em comparação com os nossos estudos anteriores [18], a capacidade de diferenciação de P8 BM-diminuiu, mas ainda pode se diferenciar em osteoblastos, adipócitos e condrócitos em meio de indução.cistache AustráliaDe acordo com o modelo de senescência de MSC in vitro conforme relatado [18], tratamos ainda BM-hMSCs com quatro drogas candidatas com o objetivo de intervir na senescência in vitro. Conforme mostrado na Figura iC, as células foram plaqueadas em uma placa de 24-poço com uma densidade de 60 por cento e as drogas foram adicionadas às células após 48 horas. O sobrenadante de células foi coletado a cada três dias sete vezes. No dia 21 após a droga

(Figura 1A suplementar). Oltipraz, rapamicina e vitamina C podem efetivamente melhorar o potencial de diferenciação que foi diretamente proporcional ao antagonismo da senescência (Figura 1B suplementar). Curiosamente, apenas oltipraz mostrou um efeito positivo no meio de diferenciação de adipócitos (Figura complementar 1C,1D).benefícios do cistache,Em resumo, oltipraz é a melhor droga para melhorar as habilidades de diferenciação de trilinhagens, rapamicina e vitamina C podem efetivamente melhorar o potencial de diferenciação osteogênica e condrogênica, enquanto a metformina exibe apenas um efeito positivo limitado na diferenciação osteogênica.

Perfil transcriptômico de BM-hMSCs tratadas com drogas Dado que todas as quatro drogas podem neutralizar a senescência de BM-hMSCs com eficiência diversa, em seguida procuramos explorar os mecanismos subjacentes para seu efeito distinto investigando o perfil transcriptômico de BM-hMSCs após tratamento com drogas . Calculamos a mudança de expressão gênica entre cada par de droga-controle, respectivamente. Para cada par droga-controle, os genes expressos diferencialmente (DEGs) com alteração de dobra acima de 2 foram selecionados, que contêm genes de regulação positiva e negativa (Tabela Complementar 1). Obtivemos 1758 genes no total após analisar todos os DEGs das drogas tratadas com BM-hMSCs (Figura 3A). Para investigar as funções dos DEGs, identificamos os termos de ontologia de genes (GO) enriquecidos ("p<0.01) based="" on="" each="" drug's="" degs="" [19](supplementary="" table="" 2).="" these="" enriched="" go="" terms="" represent="" the="" functions="" influenced="" by="" the="" drugs.="" furthermore,="" we="" plot="" the="" venn="" diagram="" to="" study="" the="" similarity="" and="" specificity="" of="" the="" enriched="" go="" terms.="" as="" shown="" in="" figure="" 3b,="" although="" each="" drug="" has="" its="" unique="" regulated="" go="" terms,="" the="" drugs="" also="" share="" a="" common="" go="" which="" suggests="" that="" there="" are="" common="" functions="" influenced="" by="" all="" four="" drugs.="" these="" common="" go="" terms="" may="" associate="" with="" the="" effects="" of="" the="" drug="" on="" senescence="" alleviation="" and="" trilineage="" differentiation="">

Doze termos GO comuns foram compartilhados por quatro drogas (Figura 3B, 3D), dos quais enriquecidos principalmente na regulação negativa da motilidade celular (Figura 3E), regulação positiva da organização da estrutura da actomiosina, regulação do processo celular e organização do componente celular, organização do citoesqueleto , processo catabólico de macromoléculas, regulação da proliferação celular, processo catabólico de proteínas e transdução de sinal mediada por pequenas GTPases (Figura 3C, 3E). Essas funções estão intimamente relacionadas ao destino celular, especialmente fenótipos relacionados à senescência.

Após analisar os termos GO comuns entre metformina e oltipraz, descobrimos que eles compartilham a mesma função que os agonistas de NRF2. Conforme mostrado na Figura 3F, a função do ciclo celular, o processo catabólico de macromoléculas e a organização do envelope nuclear foram regulados positivamente. Além disso, a função de movimento de componentes, migração/adesão celular e resposta à vitamina E/composto cíclico orgânico/lipídio foi regulada negativamente (Figura 3G). Esses resultados juntos indicaram que a metformina e o oltipraz podem afetar as habilidades de diferenciação celular, o destino celular e o metabolismo celular. Como o oltipraz é a melhor droga para melhorar as habilidades de diferenciação de trilinhagens, buscamos ainda identificar as vias específicas alteradas pelo oltipraz. Curiosamente, os 85 termos GO enriquecidos foram relacionados principalmente à senescência celular, ciclo celular, processo mitótico e meiose, resposta celular a drogas, vitamina, AMPc, estímulo de dano ao DNA, estresse nutricional e osmótico (Figura complementar 2A,2B). Perfil lipidômico de BM-hMSCs tratadas com drogas Para investigar a flutuação global de lipídios em relação à diferenciação osteogênica de BM-hMSCs após tratamento com drogas, a análise de perfil lipidômico baseado em LC-MS foi conduzida. Um total de 139 espécies de lipídios foram identificados no lipidoma celular, incluindo lisofosfatidiletanolaminas (LPE), 21 PEs, 4 PE-Os, 4 fosfatidilinositóis (PI), 5 fosfatidilserinas (PS), 8 Ceramidas (Cer), 4 Cerys, 11 esfingomielinas (SM), 6 diacilglicerídeos (DG), 18 triacilglicerídeos ( TG) e 20 ácidos graxos livres (FFA)(Figura 4A-4M). De acordo com a questão de agrupamento, as células tratadas com oltipraz apresentaram as maiores variações de lipídios, o que está de acordo com seu melhor efeito no alívio da senescência celular e na melhora da diferenciação da trilinhagem. Em detalhe, os LPCs de monofosfatidilgliceróis foram aumentados no grupo de tratamento com oltipraz em comparação com o controle, enquanto suas contrapartes PCs e PEs foram reguladas negativamente (Figura 4B,4D,4E). Os níveis de PIs e SFAs também estão elevados, enquanto os níveis de Ceres e MUFAs foram reduzidos (Figura 4F, 4L,4H,4M). Esses resultados

Análise de via baseada em lipidômica e transcriptômica em hMSCs tratadas com drogas

Para investigar ainda mais os mecanismos subjacentes à melhoria da diferenciação de trilinhagem pelo oltipraz, a análise da via foi realizada com base nos conjuntos de dados lipidômicos e transcriptômicos. Conforme mostrado na Figura 5A, CDP-Diacilglicerol Sintase 1 (CDS1) foi a única enzima regulada positivamente em células tratadas com oltipraz, o que pode ser a razão para causar elevação de IPs e reduções de PCs. No entanto, a lecitina colesterol acil transferase (LCAT) regulada negativamente e a lisofosfatidilcolina aciltransferase3 (LPCAT3) inalterada foram inconsistentes com os LPCs aumentados, sugerindo que os LPCs produzidos excessivamente podem não ser sintetizados a partir de PCs/Pes (Figura 5A). Curiosamente, uma conversão óbvia pode ser observada entre SFAs e MUFAs (Figura 5B). O aumento de ácidos graxos saturados (SFA) e a diminuição de MUFAs podem resultar da regulação negativa da estearoil-CoA dessaturase (SCD). Esse layout tende a revelar o mecanismo para a diminuição da atividade da lipogênese após o tratamento com oltipraz. Embora o tratamento com oltipraz pudesse reduzir a produção de Ceres, as conversões mediadas por Cars não foram alteradas significativamente (Figura 5C).

Perfis globais de espécies lipídicas no sobrenadante de hMSCs após tratamento com drogas

Além disso, as alterações lipidômicas no meio foram caracterizadas a fim de investigar minuciosamente a influência das drogas nas hMSCs. Conforme mostrado na Tabela Complementar 3, a análise de agrupamento demonstrou que os lipídios foram classificados em dois agrupamentos, ou seja. a maioria dos AGL e outros lipídios (não AGL).colesterol cistancheConforme mostrado na Figura 6, em quatro grupos, os FFAs exibiram alterações óbvias em diferentes períodos de tratamento. Em contraste, não-FFAs mostraram pequenas flutuações em quatro grupos (Figura 6A-6D). Os FFAs foram significativamente elevados nos estágios iniciais em todos os grupos (Figura 6E-6H).efeitos colaterais do cistanche deserticolaAlém disso, os FFAs nas células induzidas por metformina (Figura 6E), oltipraz e tratamento com vitamina C aumentaram rapidamente do 2º ponto de tempo para o 3º ponto de tempo. No entanto, nas células tratadas com rapamicina, os FFAs foram elevados da lista para o 2º ponto de tempo (Figura 6F-6H). Curiosamente, os FFAs em células tratadas com metformina mostraram um declínio maior do que nos outros três grupos (Figura 6E). Então, ligeiros aumentos de FFAs puderam ser vistos no grupo de tratamento com oltipraz e vitamina C, enquanto do 4º ao 5º ponto de tempo, os FFAs mostraram um ligeiro declínio no grupo de tratamento com metformina (Figura 6E, 6F, 6H).

Em células tratadas com rapamicina, os níveis de FFAs foram basicamente mantidos do 3º ao 5º ponto de tempo. Especificamente, conforme mostrado na Figura Suplementar 3 e na Tabela Suplementar 4, os padrões de alteração dos FFAs podem ser classificados em 8 grupos. Nele, o cluster 6 consistindo principalmente de SFAs mostrou o mesmo layout que os mostrados no grupo oltipraz e vitamina C, enquanto o cluster I era basicamente o mesmo que o grupo rapamicina. Geralmente, os FFAs médios em todos os grupos, exceto para metformina, foram globalmente aumentados junto com a indução, sugerindo a associação entre FFAs no ambiente cultural interno e senescência celular. As células induzidas por metformina e vitamina C contribuíram de forma semelhante para os SFAs no ambiente interno em comparação com a indução de rapamicina (Figura 6A,6D,6E,6H).

A estratégia geral para estudar os efeitos antienvelhecimento de drogas em hMSCs

Para resumir, como mostrado na Figura 7, para caracterizar os efeitos antienvelhecimento de quatro drogas em hMSCs, um estudo sistemático foi realizado com base no workshop consistindo em caracterização de fenótipo, transcriptômica, lipidômica celular e análise lipidômica média. Oltipraz aliviou a senescência e melhorou a eficiência de diferenciação de trilinhagens, promovendo a produção de IPs, inibindo a biossíntese de PCs/PEs e bloqueando a conversão de SFA em MUFA. Os termos GO também ilustraram o fenótipo associado à senescência celular, processo mitótico e meiose, resposta celular ao estímulo de dano ao DNA, íon amônio e níveis de oxigênio. Curiosamente, a via NRF2 foi regulada por oltipraz e metformina para promover a diferenciação celular em diferentes graus. Enquanto isso, o layout lipidômico médio demonstrou os papéis críticos dos FFAs médios na diferenciação de MSC em vários tipos de células. Portanto, a estratégia multidimensional fornece múltiplas perspectivas para interpretar diferentes efeitos da intervenção medicamentosa na senescência de hMSCs. Este método pode ser usado para estudar diferentes fenótipos biológicos após intervenção medicamentosa em MSC, o que ampliará a aplicação clínica de hMSCs.

DISCUSSÃO

A nova doença do coronavírus 2019(COVID-19) tornou-se uma emergência global de saúde pública. Atualmente, não havia medicamentos específicos para proteger os pacientes dos efeitos imunomoduladores. Foi relatado que a aplicação de MSC em casos graves de COVID-19 melhora o resultado dos pacientes, regulando a resposta inflamatória do corpo e promovendo o reparo e a regeneração do tecido pulmonar [20]. No entanto, a senescência frequentemente emergente de hMSCs durante mais tempo de cultura in vitro dificultou a aplicação clínica de hMSCs. Neste estudo, estabelecemos um sistema de triagem de drogas in vitro baseado no fenótipo de senescência de BM-hMSCs [21]. Muitos estudos conduziram pesquisas de intervenção relacionadas ao envelhecimento para hMSCs com base na manipulação de TFs [22-27] e aplicação de diferentes drogas [10. 13,17,28,29]. No entanto, somos os primeiros a avaliar minuciosamente o efeito antienvelhecimento de diferentes drogas em BM-hMSCs da perspectiva da atividade de SA{15}}gal e eficiência de diferenciação. Rapamicina, oltipraz, metformina e vitamina C são as quatro drogas tradicionais usadas pela primeira vez para intervenção no envelhecimento de hMSCs. Embora todas as quatro drogas neutralizem a senescência de BM-MSC, os efeitos exatos e o mecanismo subjacente das quatro drogas na promoção da diferenciação celular foram diferentes. Mais importante, também estabelecemos um sistema de avaliação geral da intervenção medicamentosa por análise integrada de perfis transcriptômicos e lipidômicos em sobrenadantes e lisados ​​celulares. Em detalhe, os dados transcriptômicos foram totalmente analisados ​​em combinação com o fenótipo das células-tronco após o tratamento medicamentoso para explorar a via alterada e os mecanismos subjacentes influenciados pelo tratamento medicamentoso. Além disso, o padrão de alteração lipídica das células tratadas com diferentes drogas em diferentes momentos foi determinado por LC-MS. Além disso, através da integração dos dados de transcriptômica e metabonômica lipídica, as vias metabólicas específicas da droga e as alterações lipídicas relacionadas à droga foram analisadas e resumidas.

Oltipraz é a melhor droga para melhorar as habilidades de diferenciação de BM-hMSCs entre quatro drogas. Os DEGs afetados pelo tratamento com oltipraz foram enriquecidos principalmente em senescência celular, ciclo celular e resposta celular a drogas, cAMP e assim por diante. Essas mudanças desempenham papéis críticos no envelhecimento celular No entanto, oltipraz e metformina, os inibidores da via Nrf2, influenciaram vias regulatórias comuns [30], que enriqueceram principalmente as habilidades de diferenciação celular, destino celular e metabolismo celular. Como um inibidor da via mTOR, a rapamicina pode prevenir a senescência celular [31, 32] Consistentemente, também descobrimos que a rapamicina desempenha o melhor papel na promoção da diferenciação osteogênica que principalmente através da regulação da via do processo metabólico do composto contendo fosfato, organização do componente celular, comunicação celular, transdução de sinal, processo biossintético de macromoléculas, processo metabólico de proteínas celulares e desenvolvimento do sistema esquelético. A vitamina C é um redutor bem conhecido e desempenha o melhor papel na promoção da proliferação celular em comparação com as outras três drogas, mas não houve efeito significativo na melhora das habilidades de diferenciação de trilinhagem das CTM. Esses fenótipos podem ser causados ​​pela resposta a citocinas/lipídios/estresse oxidativo e regulação positiva da atividade catalítica (Figura 4 complementar).

Os lipídios têm demonstrado desempenhar papéis insubstituíveis na diferenciação de células-tronco [33]. Descobrimos anteriormente que os aumentos de glicerofosfolipídios de membrana, incluindo PCs e PEs, uma marca registrada da senescência, foram observados globalmente nas MSCs envelhecidas [18]. No presente estudo, as reduções de PCs e PEs foram observadas nas células tratadas com oltipraz que tiveram melhor desempenho em retardar a senescência de MSCs PCs e PEs são os lipídios com maior abundância na construção de membranas eucarióticas 34]. O aumento dos níveis de PCs e PEs nos soros foi demonstrado em pessoas idosas em comparação com indivíduos mais jovens [34]. Curiosamente, os IPs foram os GPLs minoritários diminuídos em MSCs idosos em nossas observações anteriores. Neste estudo, os IPs foram dramaticamente elevados em todas as células induzidas. Mecanicamente, a análise da via sugeriu que os aumentos nos IPs podem estar associados com a CDS1.CDS1 quinase provou participar na regulação da sinalização de ROS e influenciar ainda mais a expressão de genes que funcionaram na resistência oxidativa [35]. Outro fluxo metabólico significativamente bloqueado é a conversão de SFA em MUFA mediada por SCD. Como um biobarômetro da lipogênese, o SFA/MUFA ativado foi observado em um lote de doenças como câncer e doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) [36,37] Resultados semelhantes também são observados em camundongos idosos, o que reflete o metabolismo anormal de lipídios no fígado durante o envelhecimento [38]. Ao todo, nossa estratégia pode ser usada na triagem de drogas antienvelhecimento e na exploração do mecanismo molecular após o tratamento medicamentoso em células-tronco e câncer. Ao combinar a estratégia com o sistema de avaliação, podemos realizar o monitoramento em tempo real com base no status relacionado ao envelhecimento das células-tronco para descobrir novos medicamentos que serão usados ​​em terapias com células-tronco.

Este artigo foi extraído de www.aging-us.com