Glicosídeos totais de Cistanche Deserticola promovem a recuperação da função neurológica ao induzir a regeneração neurovascular
Mar 29, 2022
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Fujiang Wang1, Ruiyan Li 2, Pengfei Tu1, Jianping Chen3, Kewu Zeng1* e Yong Jiang1*
Fundo:A medicina tradicional chinesa Cistanche deserticola tem sido relatada como válida para doenças cardiovasculares e cerebrovasculares. No entanto, seus componentes ativos para a proteção do acidente vascular cerebral isquêmico não são claros. Nosso objetivo foi explorar os componentes ativos de C. deserticola contra acidente vascular cerebral isquêmico, bem como seus potenciais mecanismos.
Métodos:Nós investigamos os efeitos protetores do cérebro de extratos de C. deserticola, glicosídeos totais (TGs), polissacarídeos (PSs) e oligossacarídeos (OSs) em um modelo de rato de oclusão-reperfusão da artéria cerebral média (MCAO/R). 2, 3, 5-A coloração com cloreto de trifenil tetrazólio (TTC) foi usada para avaliar o volume do infarto cerebral e o ensaio de Evansblue foi adotado para avaliar a permeabilidade da barreira hematoencefálica (BHE). Em seguida, as expressões CD31, a-SMA, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, ZO-1, claudin-5, occludin,Keap-1 e Nrf{{13) }} foram analisadas por western blotting ou imunofluorescência, e as atividades MDA, SOD, CAT e GSH-Px foram analisadas por meio de kits.
Resultados:O tratamento com TGs diminuiu notavelmente os escores de déficit neurológico e os volumes de infarto, promoveu angiogênese e remodelação neural e manteve efetivamente a integridade da barreira hematoencefálica em comparação com o grupo modelo. Além disso, os TGs diminuíram significativamente os níveis de MDA e aumentaram as atividades antioxidantes (SOD, CAT e GSH-Px) no cérebro. Enquanto isso, os TGs reduziram notavelmente a expressão Keep-1 e facilitaram a translocação nuclear Nrf-2. Ao contrário, nenhum efeito protetor foi observado para os grupos PSs e OSs.
Conclusão:Os TGs são os principais componentes ativos de C. deserticola contra lesão cerebral induzida por MCAO/R, e a proteção é principalmente pela via Nrf-2/Keap-1.
Palavras-chave:Cistanche deserticola,lesão cerebral, glicosídeos totais, polissacarídeos, oligossacarídeos, via Nrf-2/Keap-1
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INTRODUÇÃO
O AVC é considerado uma das principais causas de morte e incapacidade no mundo (Donnan et al., 2008). Quase 87 por cento de todos os casos de AVC são desencadeados por AVC isquêmico (Ovbiagele e Nguyen-Huynh, 2011). Atualmente, o agente mais eficaz e o único medicamento aprovado pela FDA usado para o tratamento de acidente vascular cerebral isquêmico é o ativador de plasminogênio tecidual recombinante. No entanto, um grande número de pacientes com AVC não responde a esta droga, devido à sua estreita janela de tempo terapêutico e um sério risco de complicações hemorrágicas (Lee et al., 2012; Schellinger e Kohrmann, 2014). Um grande desafio do tratamento trombolítico é a lesão de isquemia/reperfusão (I/R), considerada a principal causa de lesão cerebral e destruição da função. A reperfusão após isquemia cerebral aumenta o risco de hemorragia cerebral, levando a lesão neurovascular e produzindo espécies reativas de oxigênio (EROs) excessivas que danificam a barreira hematoencefálica (Alluri et al., 2015). Vários estudos confirmaram que a ruptura da BHE é uma das principais causas da patogênese do acidente vascular cerebral isquêmico (Cao et al., 2016b).
A BHE consiste principalmente de células endoteliais, pericitos, astrócitos, neurônios e membranas basais. Os componentes centrais da BHE são células endoteliais microvasculares cerebrais que são unidas por junções apertadas, restringindo assim as moléculas exógenas ao cérebro. As alterações patológicas das junções apertadas—particularmente ocludina, claudina-5 e zonulaocludense-1 (ZO-1)—afetam significativamente a função BBB durante um acidente vascular cerebral isquêmico, especialmente a permeabilidade da barreira (Liuet al., 2014 ; Hu et al., 2018; Liu et al., 2019). Durante os períodos de I/R, o excesso de ROS é um dos principais fatores que levam ao dano direto dos neurônios cerebrais (Ding et al., 2014). A superprodução de ROS leva à degradação de certas junções e ruptura da BBB, o que resulta em moléculas exógenas que entram no cérebro através da BBB, levando ao agravamento dos danos cerebrais (Cheon et al., 2016; Zhang QY et al., 2017). Portanto, a proteção da BHE por antioxidantes tem sido considerada uma forma potencial de prevenir a lesão de reperfusão.
Além da quebra do BBB, I/R pode resultar em lesão neurovascular e morte neuronal (Jung et al., 2010). mostraram que a ERO agrava a gravidade do AVC e os danos neurológicos (Kondo et al., 1997; Crack et al., 2001; Crack et al., 2006). Embora os ensaios clínicos não tenham obtido resultados satisfatórios, a neuroproteção ainda é uma estratégia promissora para o tratamento do AVC isquêmico agudo (Moretti et al., 2015). Assim, encontrar drogas de neuroproteção eficazes para o tratamento do AVC é um benefício para os pacientes com AVC.
A Medicina Tradicional Chinesa (MTC) toma medidas para intervir contra o desequilíbrio interno do organismo (Gaire, 2018). Devido à complexa patogênese do AVC isquêmico, o efeito multifatorial da MTC e seus constituintes ativos desempenham papel fundamental no tratamento do AVC. Cistanche deserticola YC Ma, difundida em áreas áridas ou semi-áridas em toda a Mongólia e noroeste da China, tem sido uma erva TCM amplamente utilizada para o tratamento de várias doenças, como esquecimento e depressão por mais de 1,000 anos na China. Estudos farmacológicos modernos indicaram que os extratos brutos de C. deserticola mostrou múltiplas atividades farmacológicas, como melhorar a função de aprendizagem e memória, neuroproteção, aumentar a imunidade, antioxidante, antienvelhecimento e efeitos antifadiga (Ko e Leung, 2007; Wang et al., 2012; Li et al., 2015).Análise química de C. deserticola mostrou que seus principais constituintes incluem glicosídeos feniletanoides, iridoidglicosídeos, polissacarídeos e oligossacarídeos (Jiang e Tu, 2009). No entanto, os componentes ativos de C. deserticola para proteção cerebral não são muito claros.
A propriedade neuroprotetora da C. deserticola implica em seu potencial terapêutico em doenças cognitivas, como acidente vascular cerebral e depressão, além da doença de Alzheimer (Wang et al., 2017). No entanto, a pesquisa sobre o impacto dos golpes de C. deserticola, incluindo seus componentes ativos e mecanismos de ação, é muito limitada. No presente trabalho, exploramos o efeito protetor de três extratos de C. deserticola, glicosídeos totais (TGs, glicosídeos feniletanoides e outros glicosídeos), polissacarídeos (PSs) e oligossacarídeos (OSs) em lesões I/R cerebrais. Nossos achados podem contribuir para a aplicação clínica precisa de C. deserticola e fornecer um agente candidato para terapia de acidente vascular cerebral isquêmico.
Cistanche tem tpotencial terapêuticoem doenças cognitivas, como acidente vascular cerebral e depressão,assim como a doença de Alzheimer.
MATERIAIS E MÉTODOS
Produtos Químicos e Reagentes
Os caules de Cistanche deserticola foram adquiridos de Alashan, Mongólia Interior, e identificados por um dos autores (P.-F. Tu). TGs, PSs e OSs foram preparados de acordo com nosso método previamente relatado (Gao et al., 2015) . A análise quantitativa dos TGs foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) conforme descrito anteriormente (Li et al, 2019), e seu cromatograma é mostrado na Figura 1. Os principais componentes dos TGs são echinacoside, tubuloside A, acteoside, isoacteoside, and2'- acetilacteósido; seus conteúdos são 163,05 mg/g, 4,125 mg/g, 41,66 mg/g, 22,655 mg/g e 12,045 mg/g, respectivamente. Os teores de PSs e OSs são 69,42% e 65,24%, respectivamente, conforme determinado por HPLC e pela análise de ácido fenol-sulfúrico, respectivamente (Zhang A. et al., 2018; Shi et al, 2019).
As referências padrão de echinacoside (A0282), tubulosideA (A0942), acteside (A0280), isoacteoside (A0281) e 2'-acetilacteoside (A0943) foram adquiridas de Chengdu MustBiotechnology (Sichuan, China). A pureza de todos os padrões é superior a 98%. Os kits de coloração Nissl H&E foram adquiridos na Boster (Wuhan, China). Edaravone (T0407-1) foi comprado da TargetMol (Xangai, China). MAP anti-rato de coelho-2 (ab32454), Nrf-2(ab31163), PDGFRb (ab32570), Keap-1 (ab66620) e CD31 anti-rato de rato (ab24590) foram adquiridos de Abcam Inc (Cambridge, MA, EUA). Anti-rato de coelho Claudin5 (BS1069),ZO-1 (BS9802M) e Occludin (BS72035) foram comprados da Bioworld Technology (Nanjing, China). Cell SignalingTechnology Inc. (Boston, MA, EUA) foi a fonte de Synapsin de coelho anti-rato -1 (SYN,5297T), PSD95 (3450T), a-SmoothMuscle Actin (a-SMA,19245T). O GAPDH (HRP-60004) foi adquirido da Proteintech Group, Inc. (Chicago, EUA). Os anticorpos secundários foram fornecidos pela Zhongshan GoldenBridge Biotechnology (Pequim, China). O Hoechst 33258 foi adquirido em Beyotime (Jiangsu, China).
FIGURA 1|Os cromatogramas de HPLC dos TGs (A) e referências padrão (B).
Animais
Ratos Sprague-Dawley (machos, pesando 250-300g) foram obtidos do Vital River Laboratory Animal Technology (Pequim, China) e alojados em uma sala com ar condicionado e um ciclo claro/escuro de 12 h. Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes de pesquisa animal ARRIVE (Kilkenny et al., 2010; McGrath et al., 2010), e aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee of Peking University HealthScience Center (LA2019123).
Protocolos experimentais em animais
Os ratos foram submetidos a MCAO/R, conforme descrito anteriormente (Wang et al., 2018). Resumidamente, a artéria carótida comum esquerda (ACC), artéria carótida externa (ECA) e artéria carótida interna (ACI) foram expostas e uma sutura de monofilamento de náilon 3-0 foi inserida da ECA na ACI até atingir a artéria cerebral média ( MCA). Após 1,5 h de oclusão da ACM, a reperfusão foi simulada pela remoção do filamento. Durante o procedimento cirúrgico, a temperatura corporal de todos os ratos foi mantida em 37,0 graus.
Administração de Drogas
Os ratos foram separados aleatoriamente em seis grupos usando o software SPSS versão 22.0 conforme descrito (Jiang et al., 2014): grupo normal (NOR); grupo modelo (MOD); grupo edaeavona (droga positiva, 6 mL/kg, EDI); grupo TGs (280 mg/kg, TGs); Grupo PSs (280 mg/kg, PSs) e grupo OSs (280 mg/kg, OSs). TGs, PSs e OSs foram administrados ig uma vez ao dia após MCAO/R por 14 dias. Os grupos NOR e MOD foram tratados com solução salina normal. Os números de animais são mostrados na Tabela 1.
TABELA 1|Número de animais para diferentes grupos experimentais e vários parâmetros aos 14 dias após a administração.
Medição de Peso e Escores de Déficit Neurológico Modificado (mNSS)
O peso corporal foi monitorado no 14º dia com uma Balança Digital ADVENTURE™ (OHAUS, New Jersey, EUA). O NSS foi avaliado de acordo com o método descrito por FJ Wang (Wang et al., 2018), com pequenas revisões.
2, 3, 5-coloração com cloreto de trifeniltetrazólio (TTC)
O volume do infarto foi medido conforme descrito anteriormente (Wanget al., 2015). Em resumo, os cérebros foram seccionados em sete blocos coronais igualmente espaçados (2 mm). Essas seções foram coradas com 2% TTC (Coolaber, Pequim, China) a 37 graus por 15 min. Volume do infarto ( por cento )=(volume do hemisfério isquêmico ipsilateral-volume do hemisfério isquêmico contralateral)/volume do hemisfério isquêmico contralateral × 100.
Coloração Nissl e H&E
Os ratos foram profundamente anestesiados e todo o cérebro foi rapidamente removido do crânio e fixado com paraformaldeído a 4% e embebido em cera de parafina e seccionado em fatias de 7 µm de espessura. Os cortes foram corados com Nissl e H&E. Neste estudo, seis campos aleatórios de 200 ×200 µm foram capturados em cada espécime de tecido com um microscópio de luz. O número de corpos de Nissl foi contado com IPPsoftware versão 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, EUA).
Ensaio Azul Evans
Os ratos foram injetados com 2 por cento de EB (Coolaber Science & TechnologyCo., LTD) após MCAO/R. Duas horas depois, os ratos foram anestesiados e todo o cérebro foi rapidamente removido e homogeneizado em acetona. Os sobrenadantes foram analisados a 620 nm por um leitor de absorbância de 800 TS (BioTek, EUA).
Medição das Atividades de Catalase (CAT), Superóxido Dismutase (SOD), Malondialdeído (MDA) e GlutationaPeroxidase (GSH-Px)
Todas as amostras de soro foram centrifugadas a 4,000 × rpm por 15 min a 4 graus e depois analisadas para detectar as atividades de MDA, CAT, SOD e GSH-Px seguindo as instruções do fabricante (Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd , China).
Análise de Western Blot
Tecidos cerebrais (100 mg) coletados de cada rato foram homogeneizados e lisados em tampão de lise RIPA, e então analisados para detectar a concentração de proteína usando um kit BCA (Beijing TransGenBiotech Co., Ltd.). As proteínas totais do tecido foram carregadas em géis de SDS-PAGE a 10 por cento e transferidas para uma membrana de nitrocelulose. A membrana foi bloqueada usando leite desnatado a 5 por cento, depois incubada durante a noite com anticorpos primários a 4 graus. A membrana foi então incubada com um anticorpo secundário. A análise de Western blot foi analisada usando o Kodak Digital Imaging System (5200 Multi, Tanon, China).
Análise imunofluorescente
A coloração de imunofluorescência para CD31, a-SMA, ZO-1, claudina5, ocludina, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, Nrf-2 e Keap-1 foi realizada. Anticorpos primários contra Nrf-2,CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, ocludina, PDGFRb, SYN,PSD95, MAP-2 e Keap-1 foram diluídos para 1:200 e 1:100, respectivamente. Os anticorpos secundários de IgG anti-coelho de rato Alexa Flur 488 e IgG anti-coelho de cabra de rodamina (TRITC) foram ambos diluídos a 1:200. Os núcleos foram corados por Hoechst 33258. As imagens foram capturadas com o Vectra® Polaris™ Automated Quantitative Pathology Imaging System (PerkinElmer, EUA). A expressão da proteína foi analisada usando o software IPP versão 6.0.
Análise estatística
Todos os dados foram descritos como média ± DP. O software SPSS versão 22.0foi realizado para análise estatística. A ANOVA de uma via foi utilizada na comparação de diferentes grupos. P < 0,05="" foi="" considerado="" a="" diferença="">
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RESULTADOS
TGs aumentam o peso corporal e reduzem os danos cerebrais em ratos MCAO/R
Após 14 dias de cura com TGs, PSs, Oss e EDI, os pesos corporais, déficits neurológicos e volumes de infarto dos ratos I/R foram avaliados. Os resultados mostraram que os pesos corporais no grupo MOD foram muito diminuídos, enquanto os pesos diminuídos nos grupos TGs, PSs e EDI foram obviamente aumentados (Figura 2A). Os escores de déficit neurológico foram substancialmente reduzidos por EDI e TGs (Figura 2B). As fatias de cérebro nos ratos do grupo NOR eram vermelho-escuras e não houve infartos, enquanto os ratos do grupo MOD apresentaram um grande infarto cerebral ipsilateral. Após o tratamento com TGs, os volumes do infarto foram significativamente reduzidos (Figuras 2C, D). O tratamento com PSs e OSs não apresentou efeito óbvio nos índices acima. Os dados acima mostraram que os TG podem aliviar marcadamente a lesão cerebral induzida por I/R, mas os PSs e OSs não.
FIGURA 2|Os TGs reduzem o dano cerebral induzido por isquemia cerebral focal transitória.
TGs melhoram o dano histopatológico em ratos MCAO/R
A fim de determinar alguns dos efeitos do tratamento com TGs, PSs e OSs nos danos histopatológicos, a coloração H&E foi feita para revelar os danos patológicos. As estruturas histomorfológicas dos cérebros do grupo NOR foram organizadas regularmente. As alterações morfológicas nos grupos TGs foram menores do que no grupo MOD. No entanto, os grupos de tratamento PSs e OSs não apresentaram melhora significativa das alterações morfológicas (Figura 3).
TGs atenuam a lesão neuronal após ratos induzidos por I/R
A coloração de Nissl mostrou as alterações histopatológicas dos neurônios na penumbra da área isquêmica. Conforme mostrado na Figura 4, os neurônios normais tinham um nucléolo claro e estrutura intacta. No grupo MOD, os neurônios apresentaram espaços intercelulares aumentados. Os corpos estavam desaparecidos, encolhidos e profundamente manchados. No entanto, essas alterações raramente foram observadas nos grupos EDI, TGs e PSs. Esses resultados ilustram que TGs e PSs podem atenuar significativamente a lesão neuronal induzida por isquemia/reperfusão.
TGs atenuam a interrupção do BBB após ratos tratados com I/R
O ensaio azul de Evans é um método clássico para pesquisar a alteração da permeabilidade da BBB. Os resultados do experimento mostraram que o aumento do azul de Evans foi observado no grupo MOD, enquanto houve uma diminuição significativa do azul de Evans nos ratos tratados com TGs e EDI. Além disso, não houve diferença significativa entre os grupos de terapia PSs e OSs (Figura 5). Esses resultados sugeriram que os TGs poderiam atenuar significativamente a ruptura da BBB.
FIGURA 3|Os TGs melhoram o dano histopatológico em ratos MCAO/R.
TGs promovem angiogênese em ratos com lesão de I/R
Estudos mais recentes mostram que a angiogênese desempenha um papel crítico na recuperação funcional neurológica e no resultado prognóstico após acidente vascular cerebral isquêmico agudo (Yuen et al., 2015). Para avaliar os efeitos de TGs, PSs e OSs na angiogênese, o CD31 e a-SMA foram utilizados para quantificar os números capilares. A coloração de imunofluorescência mostrou que o grupo MOD causou uma diminuição notável nas expressões de CD31 (Figuras 6A, B) e a-SMA (Figuras 6C, D) na penumbra de áreas isquêmicas de ratos I/R, em comparação com ratos normais. Este resultado ilustrou que I/R pode causar danos vasculares na penumbra do córtex dos hemisférios isquêmicos. No entanto, o tratamento com TGs e EDI aumentou notavelmente a densidade capilar, angiogênese e arteriogênese, conforme indicado pelo aumento das expressões de CD31 e a-SMA. Esses resultados sugerem que os TGs podem promover angiogênese na penumbra isquêmica de ratos I/R, mas os PSs e OSs não.
TGs aumentam a expressão de proteínas de junção apertada em ratos feridos por I/R
A interrupção do BBB pode elevar o conteúdo de água cerebral e o inchaço dos tecidos, levando a lesão cerebral. As proteínas de junção estreita são componentes estruturais importantes do BBB (Tenreiro et al., 2016; Jiang et al., 2018). Para testar se o tratamento com TGs, PSs e OSs após acidente vascular cerebral pode influenciar a integridade da BBB, as expressões de ZO-1, claudina-5 e ocludina foram realizadas por análise de imunofluorescência. Os resultados indicaram que as expressões de claudina-5, ocludina e ZO-1 foram visivelmente diminuídas no grupo MOD. No entanto, eles foram substancialmente aumentados após 14 dias de administração de TGs. Os grupos PSs e OSs não apresentaram alterações significativas nestas expressões de proteínas (Figura 7). Esses dados indicaram que os TGs podem regular as expressões de proteínas de junção apertada e provavelmente manter a integridade da BBB após lesão de I/R.
TGs aumentam a cobertura de pericitos em capilares em ratos feridos por I/R
A cobertura de pericitos nos capilares desempenha um papel crítico na manutenção da integridade do BBB (Armulik et al., 2010; Daneman et al., 2010). Assim, testamos se a cobertura de pericitos poderia ser aumentada pelo tratamento com TGs, PSs e OSs. Os resultados da análise de intensidade de imunofluorescência mostraram que as expressões de PDGFRb e CD31 foram drasticamente diminuídas no grupo MOD. A administração de TGs aos ratos I/R recuperou significativamente ou até aumentou as intensidades de expressão do PDGFRb e CD31, mas não foi observada diferença nos grupos de tratamento PSs e OSs (Figura 8). Assim, o tratamento de TGs poderia aumentar significativamente a cobertura de pericitos. Esses achados confirmaram ainda que os TGs podem manter a integridade da BBB após I/R.
TGs Promovem Remodelação Neural em Ratos Feridos I/RI
De acordo com vários estudos, a neurogênese após um acidente vascular cerebral pode melhorar significativamente a recuperação funcional (Grefkes e Ward, 2014; Zhang et al., 2019). Sinaptofisina (SYN), proteínas de densidade pós-sináptica 95 (PSD-95) e proteína 2 associada a microtúbulos (MAP-2) foram utilizadas como marcadores para examinar a plasticidade neuronal na penumbra isquêmica do córtex. A fim de avaliar os efeitos do tratamento com TGs, PSs e OSs na neurogênese em ratos lesados por I/R, foram realizadas imunofluorescência e western blot para as expressões SYN, PSD95 e MAP-2. Conforme mostrado nas Figuras 9 e 10, os níveis de expressão de SYN, PSD95 e MAP{12}} em ratos I/R após 14 dias de reperfusão diminuíram em comparação com os ratos NOR, enquanto a cura de TGs e PSs poderia regular significativamente seus níveis de expressão . O grupo OSs não teve alteração significativa em relação ao grupo MOD. Os dados indicaram que a cura de TGs e PSs foi capaz de promover dramaticamente a remodelação neural após lesão de I/R.
TGs Alter Nrf-2 e Keap-1 Expressões em Ratos Feridos I/R
O estresse oxidativo é o principal mecanismo patogênico na lesão de I/R (Ya et al., 2018; Yu et al., 2018). Os estudos verificaram que Nrf-2 é um regulador mestre das respostas antioxidantes (Thompson et al.,2015). Para investigar as respostas oxidativas mediadas por Nrf-2 e Keap-1 após lesão de I/R, avaliamos a expressão citoplasmática, bem como a translocação nuclear de Keap-1. Enquanto isso, a expressão de Nrf{{7 }} em tecidos cerebrais de ratos lesados por I/R também foi testado (Figuras 10 e 11). De acordo com a análise de imunofluorescência, Nrf{10}} foi encontrado principalmente no citoplasma no grupo NOR. No grupo TGs, a expressão de Nrf-2 na localização citoplasmática foi regulada negativamente, mas suprarregulada no núcleo, e também foi observada uma expressão diminuída de Keap-1. Os dados mostraram que a proteção cerebral dos TGs pode estar associada à modulação de Nrf-2 e Keap-1.
FIGURA 4|Os TGs atenuam a lesão neuronal após ratos tratados com I/R.
TGs Atenuam o Estresse Oxidativo do Tecido Cerebral em Ratos Feridos por I/R
Para confirmar os efeitos antioxidantes dos TGs, as atividades de SOD, CAT, GSH-Px e MDA foram avaliadas em ratos lesados por I/R. Na Figura 12, o conteúdo de MDA foi acentuadamente aumentado no grupo MOD e, ao mesmo tempo, as atividades de SOD, CAT e GSH-Px diminuíram, em comparação com os ratos normais. Por outro lado, o tratamento com TGs levou a uma diminuição significativa no conteúdo de MDA e aumento das atividades de SOD, CAT e GSH-Px. Esses resultados confirmaram ainda a atividade antioxidante dos TGs.
DISCUSSÃO
Muitos estudos sugerem que a MTC C. deserticola possui extensas atividades biológicas, por exemplo, aumentando a capacidade de aprender, memória e imunidade (Dong et al., 2007; Jiang e Tu, 2009; Wanget al., 2017; Xia et al., 2018 ). No entanto, os componentes ativos de C. deserticola para neuroproteção permanecem obscuros. O presente trabalho visa a triagem dos componentes ativos de C. deserticola contra acidente vascular cerebral isquêmico no modelo MCAO/R. Três extratos de C. deserticola (TGs, PSs e OSs) foram utilizados para avaliar seus efeitos em ratos MCAO/R, bem como possíveis mecanismos.
O AVC é uma doença cerebrovascular aguda comum. Estudos epidemiológicos mostram que o AVC é mais comum em homens do que em mulheres (Sealy-Jefferson et al., 2012; Guzik e Bushnell, 2017). Assim, em nosso experimento, ratos machos foram adotados para os testes. Nossos resultados provaram que a indução de I/R acelerou o estresse oxidativo e o volume do infarto, rompendo a BHE e levando a lesão nervosa e cerebrovascular. Após a triagem, descobriu-se que os TGs diminuem o volume do infarto e promovem a remodelação neural e a angiogênese. Além disso, TGs foram observados para manter a integridade da BBB após lesão de I/R. Pelo contrário, PSs e OSs não trazem alívio significativo para a lesão de I/R. Assim, os TGs são considerados a principal fração ativa da C. deserticola para a neuroproteção, potencialmente através da promoção de remodelação neural, angiogênese e integridade do BBB via ativação da via Nrf-2/Keap-1.
FIGURA 5|Os TGs atenuam a ruptura da BBB após lesão de I/R.
Evidências crescentes indicam que o estabelecimento de circulação colateral efetiva é significativamente importante para evitar a formação de infarto e penumbra isquêmica, e é um tratamento crítico em um estágio inicial de acidente vascular cerebral isquêmico (ElAli, 2016; Iwasawa et al., 2016). A proliferação de células endoteliais vasculares e células musculares lisas após o infarto isquêmico determina o estabelecimento da circulação colateral. No entanto, os modelos de isquemia têm um fenômeno comum – isto é, o estresse oxidativo existia amplamente na microvasculatura cerebral. Os dados do estudo mostraram que um grande número de antioxidantes pode perturbar a função do BBB e as propriedades da angiogênese (Mentor e Fisher, 2017). CD31 e a-SMA são os marcadores de células endoteliais vasculares, bem como células musculares lisas, respectivamente (Saboor et al., 2016). Para investigar o efeito dos extratos de C.deserticola sobre a proliferação celular acima mencionada, examinamos as expressões de CD31 e a-SMA no homogenato de penumbra isquêmica cerebral. Nossos dados mostraram que os TGs aumentaram notavelmente as expressões de CD31 e a-SMA. No entanto, não houve diferenças significativas para os grupos PSs e OSs. Portanto, deduzimos que os TGs podem reduzir os danos cerebrais promovendo a angiogênese através do aumento das expressões de CD31 e a-SMA, enquanto os PSs e OSs não forneceram tal proteção contra danos cerebrais. Estes resultados confirmaram ainda que apenas os TG podem prevenir a lesão cerebral de I/R.
O AVC isquêmico pode ser pensado como resultado de isquemia cerebral causada por comprometimento da plasticidade neuronal ou remodelação de áreas cerebrais. A maioria dos pacientes com AVC sofre de déficits neurológicos. A ativação da neurogênese é uma estratégia promissora para pacientes com AVC melhorarem suas funções neurológicas (Cramer e Chopp, 2000). A neurogênese participa diretamente na recuperação da função neurológica após lesão cerebral I/R (Zhang et al., 2019). Pesquisas anteriores mostram que os TGs podem melhorar a taxa de sobrevivência das células piramidais do hipocampo e induzir a neurogênese (Lian et al., 2017). O estresse oxidativo causa a perda de neurônios durante muitas doenças, como Parkinson, acidente vascular cerebral e assim por diante (Duan e Si, 2019; Singh et al., 2019). Nrf-2transcreve muitos genes relacionados à neuroproteção em sua região promotora, incluindo principalmente SOD, MDA, CAT e g glutamil cisteína ligases, etc (Satoh et al., 2006). As proteínas SYN, PSD-95 e MAP-2, que estão intimamente associadas à formação sináptica e neurotransmissão, podem ser consideradas marcadores de pesquisa de plasticidade neuronal na região da penumbra isquêmica. Os TGs podem aumentar significativamente as expressões de PSD95, SYN e MAP-2, indicando que a proteção cerebral dos TGs foi correlacionada com a plasticidade neuronal aumentada durante I/R. No entanto, é uma pena que não haja diferença óbvia para PSsas também como grupos de SOs. Esses resultados indicaram que os TGs podem aumentar a neuroplasticidade após lesão cerebral de I/R.
Pesquisas de imagem em pacientes com AVC mostraram que a disfunção BBB pode ser pensada como um atributo marcante do cérebro periisquêmico (Bang et al., 2007). As TJs, que são compostas por proteínas citoplasmáticas, proteínas transmembranares e moléculas de adesão juncional entre células endoteliais capilares, são muito importantes na manutenção da integridade da BHE (Ye et al., 2019). Entre elas, ZO-1, claudina-5 e ocludina são as proteínas mais importantes em TJs. Evidências crescentes indicam que o aumento da permeabilidade da BBB induzida por isquemia geralmente se correlaciona com as alterações de ZO-1, claudina-5 e ocludina (Cao et al., 2016a; Page et al., 2016; Yu et al. ., 2017; Liu et al., 2018). Neste trabalho, os resultados demonstraram que, embora os TGs possam aumentar significativamente as expressões das proteínas ZO-1, claudina-5 e andoccludina em tecidos cerebrais induzidos por MCAO, nem PSs nem OSs o fizeram. O BBB consiste em células endoteliais cerebrais e está intimamente associado com pericitos (Nyul-Toth et al., 2016). Os pericitos são vitais para a integridade do BBB (Bell et al., 2010). O AVC isquêmico desencadeia a morte dos pericitos e o desprendimento das células endoteliais cerebrais na fase aguda, desestabilizando a microvasculatura e alterando as propriedades da BHE (Zechariahet al., 2013). Nossos dados mostraram que os TGs podem aumentar a cobertura de pericitos nos capilares e aumentar os níveis de expressão de ZO-1, claudina-5 e ocludina. Esses fenômenos provaram que os TGs podem proteger efetivamente a integridade da BBB após lesão de I/R cerebral. Em resumo, os TGs podem atenuar a lesão cerebral de várias maneiras, como promover a angiogênese, melhorar a plasticidade neuronal e manter a integridade da BHE.
Em seguida, investigamos a via de sinalização para explorar o mecanismo subjacente à proteção cerebral dos TGs. O processo de lesão de I/R é multifatorial e, portanto, numerosos mecanismos estão envolvidos na patogênese. O estresse oxidativo é um fator de risco fundamental que contribui para a lesão cerebral induzida por I/R (Suda et al., 2013), como danos na estrutura da BBB, disfunção endotelial vascular e agravamento da lesão neuronal isquêmica (Xiong et al., 2015; Caglayan et al., 2019; Priestley et al., 2019). Assim, o estresse oxidativo tornou-se um alvo terapêutico atraente na lesão cerebral induzida por I/R. As enzimas da fase 2, que são mediadas pelo fator nuclear E2-fator relacionado-2 (Nrf-2), têm tem sido considerado como um importante meio pelo qual os neurônios se protegem contra o estresse oxidativo (Suzukiand Yamamoto, 2015; Ya et al., 2018). Evidências crescentes indicam que a ativação de Nrf-2 durante I/R é um potencial alvo terapêutico para neuroproteção (Ding et al., 2015; Zhang R. et al., 2017). Nrf-2, como um importante regulador da defesa antioxidante endógena, medeia o nível de heme oxigenase 1 (HO-1) e outras enzimas antioxidantes, como NAD(P)H quinona oxidorredutase1 (NQO1), SOD, CAT, GSH e MDA (Siow et al., 2007; Dinget al., 2014). Além disso, Nrf-2 desempenha um importante papel regulador na angiogênese. O presente estudo mostra que Nrf-2 pode ser significativamente aprimorado e ativado no processo de desenvolvimento vascular (Wei et al., 2013).
Como descrito anteriormente (Jiang e Tu, 2009), os TGs contêm muitos compostos bioativos, por exemplo, echinacoside, tubuloside A, acteside, isoacteoside e 2'-acetylacteside, e alguns deles mostraram funções neuroprotetoras após lesão cerebral de I/R (Penget al. ., 2016). O echinacoside tem muitos efeitos farmacológicos, como antioxidante, anti-senescência, neuroproteção, anti-inflamatório, promoção da cicatrização, hepatoproteção, promoção da formação óssea e atividades antitumorais (Yu et al., 2016; Li et al., 2018; Zhang Y. et al., 2018; Ji et al., 2019; Xu et al., 2019). Recentemente, o echinacoside foi identificado como um potente antioxidante no sistema nervoso central (Lu et al., 2016). O echinacoside pode reduzir o conteúdo de MDA e melhorar as atividades de SOD e GSH Px na lesão cerebral de isquemia, e a análise de docking molecular mostrou que o echinacoside pode se ligar ao Keap-1, levando à translocação nuclear do Nrf-2 (Li et al. , 2018). O estudo de Xia mostrou que o acteosídeo pode diminuir o volume do infarto e o conteúdo de água cerebral para melhorar os déficits neurológicos em ratos MCAO/R através da mitigação do estresse oxidativo (Xia et al., 2018). Outros estudos demonstraram que o isoacteoside pode aumentar as atividades de enzimas antioxidantes celulares, SOD e CAT em células H2O2-tratadas79-4 (Chae et al., 2005). Com base nos relatos acima dos compostos ativos contidos nos TGs, é possível deduzir que os TGs podem proteger contra acidente vascular cerebral isquêmico através das vias de antioxidante.
Li relatou os efeitos neuroprotetores de feniletanoidesglicosídeos (PhGs) na apoptose induzida por H2O2-em células PC12 através da via Nrf2/ARE (Li et al., 2018). Esses PhGs foram significativamente suprimidos ao desencadear a translocação nuclear de Nrf2 e aumentar as expressões de HO-1, NQO1, subunidade catalítica de glutamato-cisteína ligase (GCLC) e subunidade modificadora de glutamato-cisteína ligase (GCLM) (Li et al., 2018; Gong et al., 2019). Portanto, esses achados sugerem que a via Nrf-2/ARE desempenha um papel crucial nos efeitos protetores mediados por PhGs em células neuronais. Da mesma forma, neste estudo, descobrimos que os TGs podem diminuir o nível de MDA e aumentar os níveis de SOD, CAT e GSH-Px nos ratos I/R. no citoplasma e diminuem significativamente a expressão de Keap-1. Portanto, a via Nrf-2/Keap-1 pode estar envolvida em efeitos neuroprotetores mediados por TGs. A validação adicional desta via seria realizada em cultura de células in vitro com modelos de lesão de privação de oxigênio-glicose/reoxigenação no futuro. Além disso, C. extratos de deserticola foram administrados em nosso estudo por 14 dias continuamente. Uma vez que a neurogênese adulta afetaria a interpretação dos efeitos neuroprotetores durante 14 dias de reperfusão, a neurogênese não pode ser excluída em nosso atual desenho de experimento para explorar o efeito neuroprotetor das TCs. Esta é a limitação de nossa pesquisa.
Em conclusão, são os TGs de C. deserticola que podem aumentar a angiogênese e a neurogênese, bem como manter a integridade do BBB em ratos com lesão I/R, mas não os PSs e OSs. Os efeitos podem ser mediados pela ativação da via Nrf-2/Keap-1.
