Parte 1: Cistanosídeo de Cistanche Herba melhora os danos reprodutivos masculinos induzidos por hipóxia através da supressão do estresse oxidativo
Mar 26, 2022
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Fengqi Yan1*, Xiaoliang Dou1*, Guangfeng Zhu1*, Mingyuan Xia1, Yahui Liu3, Xiaozi Liu3, Guojun Wu2, HeWang1, Bo Zhang1, Qiuju Shao4, Yong Wang1
Abstrato:Evidências crescentes mostram que a hipóxia é uma causa de infertilidade masculina, e a hipóxia pode estar relacionada ao estresse oxidativo (OS). O cistanosídeo (Cis) é um composto glicosídeo feniletanoide que pode ser extraído de CistanchesHerba e possui várias funções biológicas. Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos protetores da Cis sobre os danos reprodutivos induzidos pela hipóxia e explorar os mecanismos subjacentes específicos. Modelos experimentais de hipóxia celular e animal foram construídos e os efeitos protetores de diferentes subtipos de Cis no sistema reprodutor masculino foram avaliados in vitro e in vivo. Os resultados indicaram que a hipóxia reduziu significativamente a viabilidade das células GC-1 através da parada do ciclo celular e ativação da apoptose, que foram associadas ao aumento da OS. Além disso, Cis mostrou fortes efeitos antioxidantes tanto in vitro quanto in vivo, restaurando significativamente as atividades de enzimas antioxidantes e regulando negativamente os níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS) enquanto aumenta a viabilidade celular e diminui a apoptose. É importante ressaltar que os subtipos de Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-C e Cis-H) aqui estudados mostraram certos efeitos antioxidantes, entre os quais os efeitos de Cis-B foram os mais significativos. Este estudo demonstra que Cis atenua marcadamente os efeitos nocivos da OS induzida por hipóxia, afetando as atividades de enzimas antioxidantes em testículos e células GC-1.
Palavras-chave: Cistanosídeo, hipóxia hipobárica, infertilidade masculina, estresse oxidativo, proteção reprodutiva
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Introdução
Atualmente, cerca de 48,5 milhões (15 por cento) de casais em idade reprodutiva em todo o mundo são acometidos por infertilidade [1], dentre os quais 40-50 por cento dos casos são atribuídos à infertilidade masculina [2], uma condição fortemente associada a fatores ambientais e de estilo de vida fatores. Evidências sugerem que a suscetibilidade do mamífero anestesista à baixa pressão de oxigênio é um fator causador de algumas formas de infertilidade masculina [3]. Conforme demonstrado em estudos anteriores, a espermatogênese é prejudicada e reduzida com a exposição à hipóxia hipobárica [4-7].
Para explorar o mecanismo subjacente, estudos mostraram que a exposição à hipóxia hipobárica aumenta a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) [8, 9]. ROS desempenha um papel importante no sistema reprodutor masculino. Em níveis baixos, eles são necessários para a capacitação espermática, a reação acrossômica e a fusão espermatozóide-oócito[10]. No entanto, ROS excessivos podem induzir danos no DNA espermnuclear/mitocondrial e danos peroxidativos na membrana plasmática, que por sua vez são os principais fatores etiológicos para o aumento do risco de infertilidade masculina [11, 12]. Assim, o acúmulo de ERO induzida por hipóxia pode ser uma causa de infertilidade masculina.
Cistanches Herba, uma planta medicinal parasitária perene, é amplamente distribuída em áreas áridas [13] e amplamente utilizada devido às suas atividades farmacológicas [14-17]. Entre todos os conteúdos eficazes de Cistanches Herba, os PhGs têm sido considerados como o principal componente ativo. Até o momento, 34 PhGs foram isolados de plantas de Cistanches [13]. O cistanosídeo (Cis), um PhG ativo isolado da Cistanches Herba, tem recebido atenção por seus efeitos antioxidantes.
Considerando os efeitos antioxidantes da Cis e o papel das EROs na infertilidade masculina induzida por hipóxia, Cis é considerado um potencial fármaco candidato para o tratamento da infertilidade masculina induzida por hipóxia. No entanto, poucos relatos abordaram os efeitos antioxidantes da Cis extraída de Cistanches Herba no tratamento da infertilidade masculina induzida por hipóxia ou nas vias de sinalização envolvidas. Neste estudo, modelos experimentais de hipóxia in vitro e in vivo foram construídos e os componentes dos efeitos de diferentes Cis foram avaliados.
Cistanche temefeito de produção reprodutiva.
Materiais e métodos
Cultura celular e reagente
A linhagem celular de espermatogônia de camundongo GC-1spg(GC-1) foi adquirida da American TypeCulture Collection (ATCC) e cultivada em DMEM (Invitrogen, EUA) suplementado com 10 por cento de soro fetalbovino, 1 por cento de L- glutamina (100 mM), penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 ug/mL) a 37 graus em uma incubadora umidificada com 5 por cento de CO2. Cis (Cis-A, B, C, H) foi adquirido de Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd. (China).
Ensaio de viabilidade celular
A viabilidade celular foi testada pelo ensaio do kit de contagem de células{{0}}(CCK-8). Em resumo, as células GC-1 foram semeadas em 96-placas de poços a 1,5×103 por poço e cultivadas a 37 graus por 24 h. Em seguida, as células foram tratadas com diferentes concentrações (20 por cento, 15 por cento, 10 por cento, 5 por cento) de oxigênio ou diferentes concentrações (2 μM, 0,2 μM, 0,02 μM) de Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-C , Cis-H) pelo tempo necessário. Em seguida, o sobrenadante foi descartado e as viabilidades celulares foram detectadas usando um kit CCK-8 (DojindoJapan). A absorbância de cada poço foi medida a 450 nm usando um leitor de microplacas (BioRad USA). Por fim, as viabilidades celulares foram calculadas de acordo com a seguinte fórmula:
Viabilidade celular=(grupo ODexperimental - grupo ODbranco)/(grupo ODcontrole - grupo ODbranco) × 100 por cento.
Análise de Western Blot
As células ou tecidos colhidos foram homogeneizados em tampão RIPA para extrair proteínas (RIPA BeyotimeChina; Coquetel Roche Suíça). Os sobrenadantes foram coletados e a concentração de proteínas foi testada pelo método BCA (Beyotime). Aproximadamente 40 µg das proteínas extraídas de cada amostra foram separadas por SDS-PAGE e eletrotransferidas para membrana de filtro de nitrocelulose (NC) (BeyotimeChina). As membranas do filtro NC foram bloqueadas com 5% de leite desnatado por 1,5 h e incubadas com anticorpos específicos (anti-PARP 1:1000, anti-Caspase-3 1:1000, anti-Bcl-2 1:1000, anti-Bax1: 1000, anti-GAPDH 1:1000; todos os anticorpos foram adquiridos da Cell Signaling Technology, EUA) durante a noite a 4 graus. Em seguida, todas as membranas NC foram incubadas com o anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano correspondente por 1,5 h à temperatura ambiente e fotografadas com um sistema de imagem (Tannon, China).
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Detecção do ciclo celular
Um ensaio de citometria de fluxo (FCM) foi realizado para analisar o ciclo celular. As células foram tratadas sob diferentes condições por 72 h e colhidas. As células foram então lavadas com PBS, fixadas em etanol a 75% e coradas com iodeto de propídio (PI). Para cada amostra, 1×104 células foram coletadas e analisadas por citometria de fluxo (FACSCalibur, BD Biosciences). Em seguida, a proporção de células da fase G1/S/G2 e o índice de proliferação [Fase(S mais G2)/Fase(G1 mais S mais G2) × 100 por cento] foram calculados.
Coloração Ki-67
As células foram cultivadas em placa confocal e tratadas com hipóxia ou diferentes subtipos de Cis por 72 h. Após a fixação de todas as células com 4% de paraformaldeído, elas foram incubadas com anticorpo anti-Ki-67 (1:200, Cell Signaling Technology). Em seguida, todas as células foram incubadas com um anticorpo IgG anti-coelho conjugado com CY-3- correspondente (1:200, Boster, China) e solução DAPI (1,0 ug/mL, Beyotime). A fluorescência foi observada com um microscópio confocal Fluoview FV1000 (Olympus, Japão).
Detecção de ROS
O FCM foi introduzido para medir os níveis de ROS intracelular usando DCFH-DA. As células suspensas foram semeadas em 6-placas de poços e submetidas a diferentes tratamentos. Após 72 h de tratamento, as células foram suspensas em DMEM sem soro com 10 μM DCFH-DA (Beyotime). Os teores de ROS foram então determinados por classificação de células ativadas por fluorescência em um sistema de citometria de fluxo Beckman Coulter com um comprimento de onda de excitação de 488 nm e comprimento de onda de emissão de 525 nm [18].
Determinação da Peroxidação Lipídica (LPO)
O ensaio de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) foi realizado para detectar LPO. Todas as etapas operacionais foram realizadas de acordo com as instruções (Sigma USA). As concentrações foram calculadas utilizando-se um coeficiente de extinção molar de 1,56×105/(M·cm), obtido utilizando-se o malondialdeído como padrão. Os resultados são expressos em nmol de equivalentes de MDA/mg de proteína.
Determinação das atividades enzimáticas
As atividades enzimáticas foram testadas usando kits de ensaio incluindo glutationa redutase (GR), glutationa peroxidase (GPx) e superóxido dismutase (SOD). Todas as etapas operacionais foram realizadas de acordo com as instruções fornecidas (Nan Jing Jian Cheng Bioengineering Institute China).
Animais e protocolo experimental
Ratos Wistar machos maduros (180-220 g, 8 w) foram obtidos do centro de animais da Fourth Military Medical University, Xi'an, China. A permissão para uso dos animais foi obtida do Comitê de Ética da Universidade (número de referência : 20190506). O experimento animal foi realizado de acordo com as diretrizes da universidade para o cuidado e uso de animais de laboratório.
Todos os ratos foram autorizados a se adaptar por aproximadamente uma semana antes do início do experimento. Após aclimatação, os ratos foram distribuídos aleatoriamente em 6 grupos com 5 animais em cada grupo. Os ratos do grupo controle foram criados sob pressão normal (PO2: 20 por cento; pressão do ar: 101,3 kPa), enquanto os ratos dos grupos modelo e cistratado foram criados em uma câmara de oxigênio de baixa pressão (pressão interna de 61,6 kPa, equivalente a uma altura de 4.000 metros acima do nível do mar; PO2: 14,55 por cento) para simular um ambiente hipóxico de alta altitude. Todos os ratos tiveram livre acesso a comida e água em gaiolas plásticas a 22± 2 graus e condições de umidade com um ciclo automático 12-h claro/escuro. Os ratos dos grupos modelo e tratado com Cis permaneceram em condições hipobáricas, mas foram transferidos para condições normobáricas a cada 96 h, momento em que lhes foi fornecida comida e água e as gaiolas limpas. A duração da transição de hipobárica para hipobárica foi de aproximadamente 2 h. Todos os grupos de tratamento foram tratados com o correspondente Cis (8 mg/kg/d) via gavagem oral por 8 semanas, enquanto os ratos controle e modelo foram tratados com igual volume de água.
Após 8 semanas, os ratos foram sacrificados sob anestesia. Testículos, epidídimo e vesículas seminais foram separados e pesados, e o índice de órgãos foi calculado de acordo com a seguinte fórmula: (peso do órgão/peso do animal) × 100 por cento . Posteriormente, os espermatozóides do epidídimo foram coletados e sua motilidade e atividade da acrossomoenzima foi testada. Da mesma forma, tecidos testiculares foram coletados para estudos histopatológicos e detecção de ROS, LPO e atividade enzimática antioxidante.
Avaliação da taxa de esperma vivo
O epidídimo foi incisado com tesoura cirúrgica e a suspensão de espermatozóides foi preparada em soro fisiológico. Para avaliar a taxa de esperma vivo, 5 μL da suspensão de esperma foi cuidadosamente misturado com um volume igual de eosina-Ystain. Os espermatozóides foram então contados sob um microscópio de luz. As taxas de espermatozóides vivos foram avaliadas calculando tanto espermatozóides corados (espermatozóides mortos) quanto espermatozóides não corados (espermatozóides vivos).
Cistanche tubulosa em póaumenta otaxas de esperma vivo.
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Determinação da atividade enzimática acrossômica do esperma
O ensaio de atividade enzimática acrossômica do esperma foi utilizado para avaliar as enzimas acrossômicas do esperma [19]. Os resultados em cada grupo foram calculados usando a seguinte fórmula: Atividade da enzima acrossomal (μIU)=(Grupo de experiência ODB - grupo ODBlank)/(247,5×10) × 106.
Análise estatística
Todos os dados quantitativos são expressos como média±DP e foram analisados usando o software SPSS 22.0. O teste t de Student Independente foi utilizado para comparar os dados entre os dois grupos. *P< 0.05="" and="" **p="" <="" 0.01="" were="" considered="" statistically="" significant="">
