Expressão específica de tecido do receptor SARS-CoV-2, enzima conversora de angiotensina 2, em modelos de camundongos de doença renal crônica
Mar 22, 2022
Desde janeiro de 2020, a doença de coronavírus 2019 (COVID-19), causada pela síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2), tem sido um problema de saúde pública global. A infecção por SARS-CoV-2 é estabelecida quando a proteína S viral se liga à enzima conversora de angiotensina 2 (ACE2) do hospedeiro e entra na célula1,2. Portanto, a expressão elevada de ACE2 em órgãos que são alvos potenciais de SARS-CoV-2 pode aumentar o risco de infecção por COVID- 19. A ACE2 é uma enzima que desempenha um papel importante no sistema renina-angiotensina (RAS), onde converte a angiotensina (Ang) II em Ang1-7 e forma um componente da ACE2-Ang{{21 }}eixo do receptor MAS3. Também exerce um efeito protetor do órgão ao neutralizar a atividade do eixo do receptor da ECA-Ang II-angiotensina tipo 1 (AT1)4–7. Relatórios anteriores mostraram que ACE2 altera seus padrões de expressão específicos de tecido sob várias condições, incluindo doenças cardiovasculares, diabetes mellitus (DM) edoenças renais 8-11. A expressão pulmonar de ACE2, que é particularmente importante para a infecção por SARS-CoV-2, é reduzida na síndrome do desconforto respiratório agudo induzida por lipopolissacarídeos12. Outro relato mostra que a expressão de ACE2 é maior em homens mais velhos13. No Departamento de Ciências Médicas e Medicina Cardiorrenal, Escola de Pós-Graduação em Medicina da Yokohama City University, 3-9 Fukuura, Kanazawa-ku, Yokohama 236-0004, Japão. 2Programa de Distúrbios Cardiovasculares e Metabólicos, Duke-NUS Medical School, Cingapura, Cingapura. 3Department of Medicine, Mount Sinai Beth Israel, Nova York, NY, EUA. 4Department of Molecular Biology, Yokohama City University Graduate School of Medicine, Yokohama, Japão. 5Departamento de Otorrinolaringologia, Cirurgia de Cabeça e Pescoço, Faculdade de Medicina, Yokohama City University, Yokohama, Japão. 6Medicina Interna, Kanagawa Dental University.
Palavras-chave;doenca renal; rins; ACE2 renal; tecidos renais; insuficiência renal
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além disso, a expressão nasal e branquial de ACE2 é maior em adultos do que em crianças14. No entanto, até onde sabemos, poucos estudos examinaram como a expressão pulmonar de ACE2 é alterada em outras doenças. Pacientes com doenças crônicasdoenca renal(DRC) têm risco de doença grave de COVID-19, mas não há evidências do aumento da prevalência de COVID-19 em pacientes com DRC15–21. Considerando o fato de que o ACE2 é necessário para a infecção por COVID-19, esses achados podem sugerir que a expressão pulmonar do ACE2 não é aumentada em pacientes com DRC. Notavelmente, a expressão celular de ACE2 está presumivelmente associada à suscetibilidade ao risco de infecção por SARS-CoV, que está relacionado ao SARS-CoV{10}}. O fato de crianças com baixa expressão de ACE2 serem menos suscetíveis à COVID-19 do que adultos23 também corrobora essas hipóteses. Portanto, conduzimos experimentos para examinar as alterações na expressão pulmonar de ACE2 em dois tipos de camundongos modelo CKD: induzido por adenina (ou seja, camundongos adenina) e induzido por ácido aristolóquico (AA) (ou seja, camundongos AA) para abordar essa hipótese. A relação da expressão de ACE2 com bloqueadores de RAS também foi investigada. Até agora, o uso de bloqueadores do RAS demonstrou aumentar a expressão de ACE2 do órgão em alguns casos24–27. Investigações epidemiológicas recentes mostraram que o uso de bloqueadores de RAS não aumenta o risco de COVID-1928–30. Além disso, a expressão de ACE2 nos pulmões não foi aumentada quando os bloqueadores do RAS foram administrados a camundongos normais31. No entanto, não há relatos sobre os efeitos dos bloqueadores do SRA na expressão pulmonar de ACE2 no contexto da DRC; este ponto é essencial para o manejo futuro do COVID-19 e suas sequelas. Aqui, investigamos alterações na expressão pulmonar de ACE2 devido ao tratamento com bloqueador de RAS em camundongos modelo CKD.
ResultadosCamundongos modelo de DRC induzida por adenina mostraram perda de peso significativa, declínio funcional renal e pressão arterial (PA) elevada, em comparação com os controles. O peso corporal basal (PC) e a PA sistólica foram idênticos entre os grupos controle e adenina. O PC aumentou ao longo do tempo no grupo controle, enquanto diminuiu no grupo adenina; este ganho de peso corporal foi significativamente diferente entre os grupos (Fig. 1A). A PA sistólica foi significativamente elevada no grupo adenina, em comparação com o grupo controle, ao longo do tempo (Fig. 1B). Em 2 semanas, a excreção urinária de albumina foi significativamente elevada no grupo adenina, em comparação com o grupo controle (camundongos adenina 41.0±8,3 ug/dia vs. controle 13,6±1,7 ug/dia, P<0.001; fig. 1e).="" there="" were="" also="" signifcant="" enhancements="" of="" plasma="" creatinine="" and="" blood="" urea="" nitrogen="" (bun)="" levels="" in="" the="" adenine="" group,="" compared="" with="" the="" control="" group="" at="" 2="" or="" 4 weeks="" (creatinine:="" 2 weeks:="" adenine="" mice="" 0.22±0.01 mg/dl="" vs.="" control="" 0.10±0.01 mg/="" dl,=""><0.05; 4 weeks:="" adenine="" mice="" 0.31±0.06 mg/dl="" vs.="" control="" 0.11±0.01 mg/dl,=""><0.01; bun:="" 2 weeks:="" adenine="" mice="" 65.0±7.0 mg/dl="" vs.="" control="" 25.7±0.5 mg/dl,=""><0.01; 4 weeks:="" adenine="" mice="" 61.7±12.5 mg/dl="" vs.="" control="" 25.6±1.6 mg/dl,=""><0.01; fig. 1c,="" d).="" moreover,="" creatinine="" clearance="" also="" showed="" a="" signifcant="" reduction="" in="" the="" adenine="" group="" (2 weeks:="" adenine="" mice="" 170±15 μl/min="" vs.="" control="" 397±25 μl/min,=""><0.001; 4 weeks:="" adenine="" mice="" 136±29 μl/min="" vs.="" control="" 357±31 μl/min,=""><0.001;>
A expressão de ACE2 nos rins foi significativamente reduzida em camundongos modelo de DRC induzida por adenina, em comparação com os controles, enquanto a expressão de ACE2 nos pulmões não diferiu entre os grupos.A histologia renal mostrou aumento heterogêneo e atrofia dos túbulos, além de infiltração celular norenalinterstitium, em camundongos adenina. A coloração ACE2 foi observada principalmente nos túbulos proximais em ambos os grupos, mas o grau de coloração foi reduzido no grupo adenina (Fig. 2A). Níveis de proteína ACE2 norins(estimado por análise de Western blotting) mostrou uma redução signifcativa no grupo de adenina, em comparação com o grupo de controle, em 2 e 4 semanas (2 semanas: camundongos adenina 0,55±0).{{ 9}}4 vs. controle 1.00±0,10, P<0.001; 4 weeks:="" adenine="" mice="" 0.32±0.07="" vs.="" control="" 0.90±0.07,=""><0.001; fig. 2c).="" in="">ACE2 renalA expressão de mRNA mostrou uma redução signifcativa no grupo adenina em 2 semanas (camundongos adenina 0,61±0.04 vs. controle 1.00±0,03, P<0.001; fig. 2e);="" a="" similar="" tendency="" for="" reduction="" was="" observed="" at="" 4 weeks,="" although="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" signifcant="" (fig. 2e).="" lung="" histology="" findings="" did="" not="" differ="" between="" groups;="" ace2="" staining="" was="" observed="" in="" type="" 2="" alveolar="" epithelial="" cells="" (fig. 2b).="" there="" were="" no="" differences="" in="" ace2="" protein="" or="" mrna="" expression="" levels="" in="" the="" lungs="" at="" 2="" or="" 4 weeks="" (fig. 2d,="" f).="" the="" difference="" in="" plasma="" ace2="" activity="" was="" not="" statistically="" signifcant="">
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Camundongos modelo de DRC induzida por AA apresentaram perda de peso signifcativa e declínio funcional renal, em comparação com o grupo veículo, enquanto a PA não diferiu entre os grupos.O PC basal e a PA sistólica foram idênticos entre os grupos veículo e AA. O PC aumentou ao longo do tempo no grupo veículo, enquanto diminuiu no grupo AA; este ganho de peso corporal foi significativamente diferente entre os grupos (Fig. 3A). No entanto, não houve diferença na PA sistólica entre os grupos (fig. 3B). Comparado com o grupo do veículo, houve melhoras signifcativas dos níveis plasmáticos de creatinina e BUN, bem como excreção urinária de albumina, no grupo AA (creatinina: camundongos AA 0,40±{{6} }.03 mg/dL vs. veículo 0,14±0,01 mg/dL, P<0.001; bun:="" aa="" mice="" 62.8±4.6 mg/="" dl="" vs.="" vehicle="" 29.0±1.4 ="" mg/dl,=""><0.001; urinary="" albumin="" excretion:="" aa="" mice="" 61.3±7.3 ="" μg/day="" vs.="" vehicle="" 9.5±0.9 μg/day,=""><0.001; fig. 3c–e).="" creatinine="" clearance="" also="" showed="" a="" signifcant="" reduction="" in="" the="" aa="" group="" (aa="" mice="" 72±12="" μl/min="" vs.="" vehicle="" 159±13="" μl/min,=""><0.001;>
A expressão de ACE2 nos rins foi significativamente reduzida em camundongos modelo de DRC induzida por AA, em comparação com controles, enquanto os níveis de proteína ACE2 pulmonar não diferiram entre os grupos. A análise histológica renal mostrou atrofia tubular e infiltração celular norenalinterstício no grupo AA. A coloração de ACE2 foi observada principalmente nos túbulos proximais em ambos os grupos, mas o grau de coloração foi reduzido no grupo AA (Fig. 4A). Níveis de proteína ACE2 norinsmostrou uma redução signifcativa no grupo AA, em comparação com o grupo veículo (camundongos AA {{0}},22±0,03 vs. veículo 1.00±0,08, P<0.001; fig. 4c).="" in="" addition,="">ACE2 renalA expressão de mRNA foi significativamente reduzida no grupo AA (camundongos AA {{0}},30±0,02 vs. veículo 1.00±0,06, P<0.001; fig. 4e).="" lung="" histology="" findings="" did="" not="" differ="" between="">
A coloração de ACE2 foi observada em células epiteliais alveolares tipo 2 (Fig. 4B) e não houve diferença no nível de proteína ACE2 pulmonar entre os grupos (Fig. 4D). A expressão de mRNA de ACE2 nos pulmões foi significativamente menor no grupo AA do que no grupo veículo (camundongos AA 0,76±0.04 vs. veículo 1.{{11} }±0,04, P<0.01; fig. 4f).="" moreover,="" there="" was="" a="" signifcant="" reduction="" in="" plasma="" ace2="" activity="" in="" the="" aa="" group="" (aa="" mice="" 84.8±2.6="" rfu/min="" vs.="" vehicle="" 98.3±3.0="" rfu/min,=""><0.01;>
Olmesartan atenuou os aprimoramentos da excreção de BP e albumina urinária e redução da perda de peso em camundongos modelo de DRC induzida por adenina.O tratamento com olmesartan atenuou a perda de peso em camundongos adenina (Fig. 5A). O tratamento com olmesartana também reduziu significativamente a PA sistólica nos grupos controle e adenina (camundongos adenina 131,5±0,4 mmHg vs. controle 121,2±0,7 mmHg, P<0.001; olmesartan="" mice="" 111.7±1.1 ="" mmhg="" vs.="" control="" 121.2±0.7 ="" mmhg,=""><0.001; adenine+olmesartan="" mice="" 117.2±0.9 ="" mmhg="" vs.="" adenine="" mice="" 131.5±0.4 mmhg,=""><0.001; fig. 5b).="" in="" adenine="" mice,="" olmesartan="" treatment="" improved="" plasma="" creatinine="" level="" (adenine="" mice="" 0.19±0.02="" vs.="" control="" 0.13±0.01,="" p="" <="" 0.01;="" adenine+olmesartan="" mice="" 0.14±0.01="" vs.="" adenine="" mice="" 0.19±0.02,="" p="" <="" 0.01;="" fig. 5c)="" and="" suppressed="" urinary="" albumin="" excretion="" (adenine="" mice="" 67.9="" ±6.7 μg/day="" vs.="" control="" 18.0±3.6 μg/day,="" p=""><0.001; adenine+olmesartan="" mice="" 52.5±2.3="" vs.="" olmesartan="" mice="" 17.4±3.7 μg/day,=""><0.001; adenine-olmesartan="" mice="" 52.5±2.3 μg/day="" vs.="" adenine="" mice="" 67.9±6.7 μg/day,=""><0.05;>
Olmesartan não afetou a expressão de ACE2.Nos grupos de controle e adenina, nem os níveis de expressão de mRNA nem de proteína de ACE2 no rim foram alterados pelo tratamento com olmesartan (Fig. 6A, C). Não houve alterações nos níveis de expressão de proteína ou mRNA de ACE2 pulmonar entre os grupos de controle e adenina (Fig. 6B, D). Também não houve diferença significativa na atividade de ACE2 no plasma (Fig. 6E). A expressão de mRNA de ACE2 no trato respiratório superior (faringe) também foi examinada, mas nenhuma diferença signifcativa foi observada entre os grupos (Figura complementar S1).
DiscussãoA pandemia de COVID-19 teve um impacto profundo em todo o mundo. Para idosos e pessoas com comorbidades, informações sobre o risco de infecção e a gravidade da COVID-19 são uma consideração crítica. Existem vários estudos epidemiológicos de COVID-19 em todo o mundo, que mostraram que pacientes com DRC são mais propensos a desenvolver COVID grave-1917, mas a morbidade do COVID-19 pode não ser elevada em pacientes com DRC15-21. Notavelmente, os resultados de várias meta-análises revelaram que a prevalência de DRC foi de 1,7% a 5,2% em pacientes com COVID-1915–17,21. Além disso, uma análise de 5.700 pacientes com COVID-19 em Nova
A área de York mostrou que 8,5% tinhamdoença renal19. Dado que a prevalência estimada de DRC é de 9,1% em todo o mundo18 e aproximadamente 15% nos Estados Unidos20, o risco de infecção por SARS-CoV-2 pode não aumentar em relação à presença de DRC. O ACE2 desempenha um papel importante na transmissão do COVID-191,2. Além disso, o nível de expressão de ACE2 nas células das vias aéreas está associado ao risco de infecção por SARS-CoV, um coronavírus semelhante ao agente causador da COVID-1922. Como a COVID-19 é uma doença respiratória, a expressão de ACE2 nos pulmões é um componente importante da transmissão da doença. No presente estudo, levantamos a hipótese de que a falta de aumento da expressão pulmonar de ACE2 na DRC está ligada à ausência de morbidade elevada por COVID-19. Essa hipótese é apoiada pelo fato de que crianças com baixa expressão de ACE2 são menos suscetíveis à COVID-19 do que adultos. Usamos dois tipos de camundongos modelo CKD em nossos experimentos para examinar as mudanças na expressão pulmonar de ACE2 em conexão com a patogênese da CKD. A DRC induzida por adenina é um modelo animal representativo da doença32. A administração excessiva de adenina pode induzir a DRC por causarrenalobstrução tubular e degeneração, bem comorenalfibrose intersticial, devido à deposição de 2–8 dihidroxiadenina32,33. Em contraste, a DRC induzida por AA é causada pela indução de fibrose de dano tubular induzido por AA34. Esses dois modelos foram escolhidos porque a PA mostrou aumentar no modelo de DRC induzida por adenina35, enquanto não aumenta no modelo de DRC induzida por AA36. Notavelmente, a hipertensão é uma complicação comum observada em pacientes com DRC; presumimos que seria útil investigar se a presença ou ausência de hipertensão influencia a expressão pulmonar de ACE2 na patogênese da DRC. Os resultados mostraram que aACE2 renalos níveis de proteína foram reduzidos em ambos os modelos de DRC. Em camundongos adenina, não houve diferença signifcativa nos níveis de mRNA em 4 semanas, mas houve uma diminuição nos níveis de proteína. Uma das razões para essa discrepância pode ser o envolvimento da repressão translacional. Lambert DW, et ai. mostraram que miR-421 reprimiu a tradução da proteína ACE2 sem afetar os níveis de transcrição de ACE237. Outro estudo também mostrou que o miR-421 sérico estava aumentado em pacientes com DRC ou hipertensão38,39. Assim, no grupo de camundongos adenina com maior período de DRC e hipertensão (4 semanas), miR-421
pode ser aumentada e a tradução de proteínas suprimida, resultando em uma discrepância entre a expressão de mRNA e proteína. Os níveis de proteína ACE2 pulmonar não diferiram em ambos os modelos de DRC em comparação com os controles e veículos. Embora seja intrigante que a expressão pulmonar de mRNA de ACE2 tenha sido reduzida no modelo de DRC induzida por AA, nossos achados foram mais notáveis porque não encontramos diferença nos níveis de proteína pulmonar de ACE2, que influenciam diretamente a infecção por SARS-CoV-2. Além disso, a atividade da ACE2 no plasma não diferiu em ambos os modelos de DRC em comparação com os controles e veículos. O ACE2 solúvel no plasma é considerado clivado e liberado das células do tecido. Foi relatado que o aumento da atividade da ACE2 no plasma está associado a um aumento na liberação da proteína ACE2 dos tecidos, sugerindo uma diminuição da proteína ACE2 nos tecidos40. Assim, os resultados do presente estudo de que a atividade da ACE2 no plasma não foi alterada no estado CKD indica que a liberação da proteína ACE2 expressa nos tecidos não é alterada no estado CKD, o que corrobora os achados de que a expressão da proteína ACE2 nos tecidos está inalterada em o contexto da DRC. A relação entre COVID-19 e bloqueadores de RAS é um foco contínuo de discussões de pesquisa. Estudos anteriores em animais mostraram que os bloqueadores de RAS regulam positivamente a expressão tecidual de ACE2, o que levou a temores de que o uso de bloqueadores de RAS possa aumentar o risco de infecção por SARS-CoV-2. No entanto, o uso de bloqueadores do SRA nesses estudos anteriores apenas levou à regulação positiva da ECA2 tecidual em condições patológicas específicas24,27; esta regulação positiva não excedeu o intervalo normal. Outro estudo examinando doenças pulmonares eACE2 renala expressão em camundongos normais tratados com bloqueadores do RAS não apresentou aumento, em comparação com o grupo controle31. Por outro lado, houve relato de que bloqueadores do SRA, como candesartana e captopril, aumentaram a expressão pulmonar de ECA2 em ratos normais41. Na prática clínica do mundo real, alguns estudos epidemiológicos sobre o uso de bloqueadores do RAS em pacientes com COVID-19 demonstraram que o uso desses medicamentos não aumenta o risco de COVID-1928–30. No entanto, o efeito dos bloqueadores do SRA na expressão pulmonar de ACE2 ainda é controverso. Nenhum estudo anterior examinou os efeitos dos bloqueadores do SRA na expressão pulmonar de ECA2 no contexto da DRC, embora os bloqueadores do SRA sejam essenciais para o tratamento de pacientes com DRC. O presente estudo foi realizado para suprir essa lacuna na literatura. Para modelar mais de perto a prática clínica do mundo real, usamos o modelo de DRC induzida por adenina, que exibe hipertensão concomitante. Os resultados mostraram que a administração de olmesartan, um bloqueador do RAS, não aumentou a expressão pulmonar de ACE2, em comparação com os controles. Além disso, a expressão de mRNA de ACE2 no trato respiratório superior, o alvo inicial da infecção por SARS-CoV-2, não foi aumentada em resposta ao tratamento com olmesartana.Renal ACE2os níveis de proteína foram reduzidos no modelo de DRC; a administração de olmesartana não aumentou os níveis de proteína ACE2 renal nos camundongos controle e adenina. A falta de restauração da ECA2 renal em camundongos adenina tratados com olmesartana pode ter sido devido ao uso de um modelo de DRC diferente, comparado a um estudo anterior27, bem como à duração relativamente curta do tratamento com bloqueador do receptor de angiotensina25,27. No entanto, o tratamento com olmesartan melhorou vários parâmetros de insuficiência renal, incluindo a excreção urinária de albumina. Esses resultados apoiam o uso contínuo de bloqueadores RAS em pacientes com COVID-19 que têm DRC.
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Este estudo teve algumas limitações. Primeiro, ele apenas examinou alterações na expressão pulmonar de ACE2 em camundongos modelo CKD, enquanto não investigou diretamente a infecção por SARS-CoV-2. Em segundo lugar, observamos os camundongos adenina por 4 semanas e os camundongos AA por 8 semanas neste estudo, mas os resultados podem ser diferentes em um período mais longo de observação. Terceiro, a expressão de ACE2 nos pulmões pode diferir entre camundongos e humanos. Quarto, em pacientes com DRC, a gravidade de COVID-19 provavelmente será maior, mas não pudemos nos referir ao mecanismo subjacente de gravidade. Quinto, não é apenas o nível de expressão de ACE2 pulmonar que determina a suscetibilidade ao COVID-19, mas também pode ser afetado por muitos outros fatores. Em conclusão, não encontramos alteração na expressão da proteína ACE2 pulmonar em camundongos modelo CKD, independentemente do status de hipertensão. Além disso, o uso de tratamento com bloqueador do receptor de angiotensina em camundongos modelo DRC não aumentou a expressão pulmonar de ACE2. Esses resultados sugerem a hipótese de que o risco de morbidade por COVID{11}} pode não ser elevado em pacientes com DRC devido à sua expressão pulmonar estável de ACE2. As descobertas também fornecem evidências científicas básicas importantes de que os bloqueadores do RAS podem ser usados com segurança no tratamento de pacientes com COVID-19 que têm DRC.
Material e métodos Animais.Este estudo foi realizado de acordo com as diretrizes do National Institutes of Health para o uso de animais experimentais. Todos os experimentos com animais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Estudos Animais da Yokohama City University (Número de Aprovação: FA{{{{10}}}}), que estava em conformidade com as diretrizes ARRIVE. Esforços foram feitos para minimizar o número de animais utilizados e garantir o mínimo de sofrimento. Os camundongos foram alojados em um ambiente controlado com um ciclo claro-escuro 12-h a uma temperatura de 25 graus. Os camundongos tiveram livre acesso a comida e água. Ratos modelo CKD. Os experimentos foram realizados usando camundongos machos C57BL/6 J de 8–9-semanas de idade, após 1-semana de aclimatação em todos os grupos. No experimento de adenina, os camundongos foram alimentados com uma dieta misturada com 0,2 por cento de adenina (0,2 por cento de adenina mais 0,3 por cento de NaCl, 3,6 kcal/g, CE{{ 18}}; CLEA, Tóquio, Japão; grupo adenina) ou uma dieta padrão (0,3 por cento NaCl, 3,6 kcal/g, CE-2; CLEA; grupo controle) por 2 ou 4 semanas. No experimento AA, os camundongos foram injetados intraperitonealmente com AA (3 mg/kg) duas vezes por semana durante 4 semanas, seguido por um período de recuperação 4-semana; o grupo veículo foi injetado com veículo (75 por cento de dimetilsulfóxido). No experimento de tratamento com olmesartana, os camundongos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos experimentais: (1) grupo controle; (2) grupo adenina, alimentado com dieta misturada com 0,2 por cento de adenina; (3) grupo controle-olmesartana, tratado com olmesartana, antagonista do receptor AT1, em água potável (4 mg/kg/dia; Daiichi Sankyo Chemical Pharma Co., Ltd, Tóquio, Japão); e (4) grupo adenina-olmesartana, cujas doses são idênticas às dos grupos 2 e 3.
Medição de PA.A PA sistólica foi medida pelo método tail-cuf (BP-Monitor MK-2000; Muromachi Kikai Co., Tóquio, Japão), conforme descrito anteriormente42,43. Todas as medições foram realizadas entre 9:00 e 14:00 h. Pelo menos 10 medições foram realizadas em cada camundongo e o valor médio foi usado para análise.Análise quantitativa em tempo real da reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa.O RNA total foi extraído do pulmão,renal, e tecido da faringe usando ISOGEN (Nippon Gene, Tóquio, Japão); O cDNA foi sintetizado usando o SuperScript III First-Strand System (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). A análise quantitativa em tempo real da reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa foi realizada usando um Sistema de Detecção de Sequência ABI PRISM 7000; os produtos de transcrição reversa foram incubados com TaqMan PCR Master Mix e uma sonda TaqMan personalizada (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), conforme descrito anteriormente44,45. A seguinte sonda TaqMan foi usada: ACE2 (Mn01159003_m1). Os níveis de mRNA foram normalizados para os de 18S rRNA.
Análise de Western blotting.A expressão proteica foi analisada por Western blotting usando homogeneizados de tecido, conforme descrito anteriormente45,46. Resumidamente, o extrato de proteína total foi preparado a partir de tecidos com tampão de amostra contendo dodecil sulfato de sódio. A concentração de proteína de cada amostra foi medida com NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific), usando albumina de soro bovino como padrão. Quantidades iguais de extrato de proteína de cada amostra de tecido (tecido pulmonar: 24 ug, tecido renal: 10 ug) foram fracionadas em um gel de poliacrilamida de 5 a 20 por cento (Atto, Tóquio, Japão). As proteínas separadas foram então transferidas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno usando o sistema iBlot Dry Blotting (Invitrogen). As membranas foram bloqueadas por 1 h à temperatura ambiente com solução salina tamponada com fosfato contendo 5% de leite em pó desnatado. As membranas foram incubadas com anticorpos primários para ACE2 (Ab108252 1:500 [pulmão] ou 1:1000 [rim], Abcam, Cambridge, MA, EUA) e -actina (A{{16} }:10.000, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). As membranas foram lavadas e depois incubadas com anticorpos secundários durante 60 min à temperatura ambiente. Os locais das reações anticorpo-antígeno foram visualizados por substrato de quimioluminescência aprimorado (Merck, Kenilworth, NJ, EUA). As imagens foram analisadas quantitativamente usando um ChemiDoc Touch (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). Para comparar os níveis de expressão da proteína ACE2 no pulmão etecidos renaisem camundongos normais, foi realizado Western blotting adicional na mesma membrana (Figura Suplementar S2). A quantidade de proteína descrita foi fracionada em géis ((A) pulmão: 24/10/1 ug, rim: 24/10/1 ug, (B) pulmão: 24/12 ug , rim: 0,2/0,15/0,1 ug); o mesmo anticorpo primário para ACE2 (Ab108252 1:1000, Abcam, Cambridge, MA, EUA) foi usado. Para examinar a especificidade do anticorpo, um peptídeo de bloqueio seletivo ACE2-(ab198988) foi usado. Western blotting mostrou uma única banda de proteína, que foi abolida por um peptídeo de bloqueio seletivo ACE2-(Figura complementar S3).
Análise imunohistoquímica.Pulmão erenaltecidos de camundongos foram fixados com 4% de paraformaldeído e posteriormente incluídos em parafina. Seções de quatro micrômetros de espessura foram desparafinadas e reidratadas; a recuperação do antígeno foi realizada por aquecimento por micro-ondas. As seções foram bloqueadas para reduzir a atividade de biotina endógena usando reagente bloqueador de peroxidase (Dako, Carpinteria, CA, EUA) e tratadas por 60 min com 10% de soro normal de cabra em solução salina tamponada com fosfato. As seções foram então incubadas com anticorpo anti-ACE2 diluído a 1:500 (Ab15348, Abcam). Para examinar a especificidade do anticorpo, a imunocoloração também foi examinada pela omissão do Ab primário e usando um peptídeo de bloqueio seletivo da ACE (ab15352). coloração ACE2 no pulmão etecido renals foi observado, o que não foi observado quando o anticorpo foi pré-absorvido com um peptídeo de bloqueio seletivo ACE2-(ab15352) ou omissão do anticorpo ACE2. (Figura S4 suplementar).
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Análise bioquímica.Após anestesia inalatória com isoflurano a 5%, amostras de sangue foram coletadas por punção cardíaca no estado alimentado por punções cardíacas. Os animais experimentais foram sacrificados humanamente após anestesia. As amostras de sangue total foram centrifugadas a 3000 rpm (MR-150, Tomy Seiko Co., Ltd., Tóquio, Japão) a 4 graus por 10 minutos para separar o plasma. As amostras de plasma resultantes foram armazenadas a -80 graus até o uso. Os níveis de creatinina plasmática, BUN, creatinina urinária e albumina urinária foram medidos usando um autoanalisador Hitachi 7180 (Hitachi, Tóquio, Japão).
Atividade plasmática de ACE2.A atividade do ACE2 foi medida pela TechnoPro R&D Company (Tóquio, Japão) usando o ACE2 Activity Assay Kit (SensoLyte 390) a uma temperatura de 27 graus. As amostras foram diluídas 1:10 usando o tampão de ensaio fornecido com o ACE2 Activity Assay Kit. O ensaio foi realizado em 384-placas de poços. Amostras de plasma, apenas tampão de ensaio (fundo) ou 4-metil-cumarina-7-amida (0,16–5 μM) como padrão de referência foram adicionados a uma placa de reação OptiPlate-384 F a 10 µL/poço. Dez, solução de substrato ACE2 (0,05 mM de 4-metilcumaril-7-amida/Dnp em tampão de ensaio) foi adicionada a 10 μL/poço. Após a reação, a intensidade de fluorescência (Ex/Em=330 nm/390 nm) foi medida em intervalos de 5-min por 3 h usando um leitor de placas EnSpire (PerkinElmer, Waltham, MA, EUA). A intensidade de fluorescência das amostras em cada ponto de tempo foi calculada a partir da intensidade de fluorescência das amostras. A inclinação de cada amostra (UFR/min) foi determinada a partir de uma aproximação linear da parcela durante o período de 30 a 90 min após o início da medição.
Análise estatística.Os dados são expressos como média±erro padrão da média. As diferenças foram analisadas como se segue. A análise de variância de duas vias, seguida pela análise post hoc de Bonferroni, foi realizada para determinar as diferenças ao longo do tempo entre os grupos adenina e controle (Figs. 1, 2), grupos AA e veículo (Fig. 3A, B) ou adenina e olmesartana grupos (Figs. 5, 6 e S1). Testes t não pareados foram usados para determinar as diferenças entre os camundongos AA e veículo (Figs. 3C-F, 4). Valores P<0.05 were="" considered="" statistically="">
