Efeito terapêutico e mecanismo de glicosídeos de feniletanol Cistanche na espermatogênese induzida por ciclofosfamida em camundongos

Contato: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

ZHAODong-hai1, ZHANGLei2, ZHANGYan3, QILing1, ZOU Xiang-ming4

[Resumo]

Propósito:Explorar o efeito terapêutico deGlicosídeos feniletanoides Cistancheem camundongos com espermatogênese induzida por ciclofosfamida e esclarecer preliminarmente seu mecanismo de ação.Método:Método de extração de etanol para extrairGlicosídeos feniletanoides Cistanche. Quarenta camundongos BALB/C foram divididos aleatoriamente em um grupo controle, um grupo modelo, um grupo de baixa doseGlicosídeo feniletanoide Cistanchegrupo (50 mg·kg-1) e um grupo de alta dose (100 mg·kg-1), com 10 camundongos em cada grupo. Com exceção do grupo controle, os camundongos dos outros grupos foram injetados com ciclofosfamida (80 mg·kg-1) todos os dias por 5 dias consecutivos para preparar modelos de camundongos de distúrbios da espermatogênese. Após a última administração, os camundongos dos grupos de baixa e alta dose deGlicosídeos feniletanoides Cistanchereceberam as doses correspondentes por gavagem, e os camundongos do grupo controle e do grupo modelo receberam o mesmo volume de solução salina normal por gavagem, uma vez ao dia durante 30 dias. Vinte e quatro horas após a última sondagem, o tecido testicular do camundongo foi retirado. Um ensaio de imunoabsorção enzimática foi usado para determinar o nível de testosterona em homogenato de tecido testicular de camundongo. A densidade espermática, a motilidade espermática e a taxa de anormalidade espermática de cada grupo foram comparadas. As alterações morfológicas do tecido testicular foram observadas pela coloração HE. Resultados: Comparado com o grupo controle, a densidade espermática e a taxa de motilidade espermática do grupo modelo diminuíram (P<0.01), the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" increased=""><0.01), and="" the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" decreased=""><0.01). 0.01);="" compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility="" of="" mice="" in="" each="" dose="" group="" of="">Glicosídeos feniletanoides Cistancheaumentaram significativamente (P<0.01), the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.01), and="" the="" testicular="" tissue="" the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" homogenate="" increased=""><0.05 or=""><0.01). histological="" observations="" showed="" that="" the="" seminiferous="" tubules="" in="" the="" testis="" of="" the="" model="" group="" were="" atrophied="" and="" degenerated,="" the="" seminiferous="" epithelium="" was="" significantly="" thinner,="" the="" arrangement="" of="" spermatogenic="" cells="" was="" disordered,="" and="" the="" number="" of="" sperm="" in="" the="" cavity="" decreased;="" the="" number="" of="" the="" seminiferous="" epithelium="" in="" the="" testes="" of="" the="">Glicosídeo feniletanoide Cistanchegrupo aumentou significativamente, as camadas são distintas, as células espermatogênicas são organizadas ordenadamente, firmemente e regularmente, e os espermatozóides podem ser vistos no lúmen.Conclusão: Glicosídeos feniletanoides Cistanchetêm efeito terapêutico significativo no distúrbio da espermatogênese causado pela ciclofosfamida em camundongos, e seu mecanismo pode estar relacionado à melhora dos níveis de testosterona nos tecidos testiculares.

[Palavras-chave]Glicosídeos feniletanoides Cistanche; ciclofosfamida; distúrbio da espermatogênese; camundongos, BALB/C

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Devido à aceleração do ritmo social, maus hábitos de vida e poluição ambiental, entre outros fatores, a qualidade anormal do esperma, como oligospermia e astenospermia, tornaram-se a principal causa de infertilidade masculina [1]. Atualmente, existem menos medicamentos para o tratamento de oligospermia e astenospermia, e o efeito terapêutico não é óbvio. As prescrições ou ingredientes ativos da medicina tradicional chinesa têm bons efeitos na melhoria da função reprodutiva masculina [2-6]. No entanto, devido à grande variedade de medicamentos prescritos, a relação entre os efeitos farmacológicos e os ingredientes eficazes do medicamento não é clara, o que limita a promoção e aplicação de medicamentos espermatogênicos. A pesquisa e o desenvolvimento dos ingredientes eficazes da medicina chinesa e o estudo de seus efeitos terapêuticos em lesões reprodutivas têm um bom valor de aplicação.Glicosídeos feniletanoides Cistanchesão um dos ingredientes ativos mais importantesCistanche deserticola. Geralmente são glicosídeos naturais contendo ligações éster e ligações oxoglicosídicas com -glicose como núcleo. Eles são amplamente encontrados em plantas dicotiledôneas [7]. Estudos [8] mostraram queCistanchefeniletanoideglicosídeospode proteger o esperma de rato do dano oxidativo in vitro, mas não há relatos sobre sua espermatogênese. Este experimento estuda o efeito terapêutico dos glicosídeos feniletanoides Cistanche na função espermatogênica de camundongos com espermatogênese induzida por ciclofosfamida e fornece uma base experimental e teórica para a aplicação deGlicosídeos feniletanoides Cistancheno tratamento de distúrbios da espermatogênese.

1. Materiais e métodos

1.1. Animais de laboratório, principais reagentes e instrumentos

40 camundongos BALB/C adultos da classe SPF, 6-8 semanas de idade, com massa corporal de 20-22g, foram adquiridos do Centro Experimental Animal da Escola de Medicina Básica da Universidade de Jilin, e o número do certificado do animal : SCXK (Quirguistão) 2008-005. Os camundongos foram criados adaptativamente por 5 dias antes do experimento. Condições de alimentação: 22 graus ~ 25 graus, ritmo circadiano (12h/12h), água e comida gratuitas. Cistanche é um produto da Xinjiang Dakang Trading Company. A ciclofosfamida para injecção foi adquirida à Jiangsu Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. (lote número 11061921). O kit de imunoensaio ligado a enzima de testosterona homogenato de tecido testicular foi adquirido da Tianjin Jiuding Medical Bioengineering Co., Ltd. (número do lote) 20120812), outros reagentes são todos de qualidade analítica produzida internamente. Leitor de microplacas PLUS384 (MDC nos Estados Unidos), microscópio invertido TE2000U (Nikon, Japão) e centrífuga J-26XP (Nanodrop, Estados Unidos).

1.2 Preparação de Cistanche Feniletanol Glicosídeo

Extraíram-se 10 g de pó de cistancha por refluxo com etanol a 70 por cento, duas vezes, 2 horas de cada vez, para obter o concentrado de glicosídeo de álcool fenetílico. A solução concentrada foi cromatografada na coluna de resina macroporosa D101 e eluída com etanol a 70 por cento para obter álcool fenecosídeo Cistanche. O espectrofotômetro UV identificou o extrato em um comprimento de onda de 333 nm.

1.3 Preparação de modelo animal e método de administração de drogas

Depois que 40 camundongos BALB/C machos foram alimentados de forma adaptativa por 5 dias, os camundongos foram divididos aleatoriamente em 4 grupos (10 camundongos em cada grupo): grupo controle, grupo modelo, CistancheGlicosídeos feniletanoides Cistanchegrupo de baixa dose eGlicosídeos feniletanoides Cistanchegrupo de alta dose. Com exceção do grupo controle, os outros três grupos de camundongos receberam uma injeção intraperitoneal de ciclofosfamida 80 mg·kg-1 para cada camundongo por 5 dias consecutivos para preparar modelos animais de distúrbios da espermatogênese. Depois que o modelo foi preparado, camundongos nos grupos de baixa e alta dose deCistanchefeniletanoide receberam 50 e 100 mg·kg-1·d-1 respectivamente. Os camundongos do grupo controle e do grupo modelo receberam volumes iguais de solução salina normal. Uma vez por dia durante 30 dias. Todos os camundongos foram sacrificados 24 horas após a última administração da droga e foram realizados testes bilaterais. O testículo direito foi fixado com formaldeído. O epidídimo e o testículo foram retirados do lado esquerdo. O testículo foi homogeneizado e centrifugado a 3,000 min por 10 min. O sobrenadante foi retirado e armazenado em uma geladeira a -20 graus para teste. O epidídimo esquerdo foi testado para densidade espermática, motilidade espermática e taxa de deformidade.

1.4 Determinação da densidade espermática, motilidade espermática e taxa de deformidade

Coloque um tubo de ensaio contendo 10 mL de solução nutritiva de esperma [9] em banho-maria com temperatura constante para pré-aquecer a 37 graus, pegue um epidídimo unilateral para remover o tecido conjuntivo e a gordura, corte o tecido e coloque-o em um tubo de ensaio em 37 graus por 10 minutos Depois que o esperma estiver totalmente livre, tome 1 gota na placa de contagem de células sanguíneas e calcule a densidade do esperma de acordo com o método de contagem de células. O resultado é expresso como o número de espermatozóides por mililitro; além disso, pegue 5μL de suspensão de esperma e a mesma quantidade de eosina-Y do tubo de ensaio Misture bem, coloque em temperatura ambiente por 10 minutos, adicione uma lamínula e observe com um microscópio de luz. Os espermatozóides mortos são corados de rosa, os espermatozóides vivos não são corados e o citoplasma é transparente. Cada espécime conta 200 espermatozóides, calcula a viabilidade do esperma, o resultado é expresso em porcentagem, viabilidade do esperma=um número de espermatozóides vivos / o número total de espermatozóides × 100 por cento. Outros 5 μL de suspensão de esperma foram fixados em metanol por 5 minutos, secos e corados com solução aquosa de eosina a 2% por 1 hora, lavados e secos com secador. Procure por partes com menos sobreposição de esperma sob uma lente de baixa potência e use uma lente de alta potência para verificar a morfologia do esperma em ordem. Cada camundongo inspecionou 1,{20}} esperma completo. As cabeças espermáticas sem ganchos, em forma de banana, amorfas, cabeças gordas e cabeças duplas foram julgadas como deformidades. A taxa de deformidade espermática foi calculada e os resultados foram expressos em porcentagem. Taxa de deformidade do esperma=um número de espermatozóides deformados / número total de contagem de espermatozóides × 100 por cento .

1.5 Determinação de hormônios reprodutivos

O testículo foi retirado da membrana e colocado em uma placa-frasco, e o meio de homogeneização pré-resfriado (0.01mol·L-1 sacarose, 0.01mol ·L-1 Tris-HCl, 0,1mmol·L-1 solução de EDTA-Na2, pH 7,4), cortar o tecido testicular com tesoura oftalmológica, despejar em um tubo de homogeneização de vidro e centrifugar a 4, 000×g por 10 minutos em temperatura baixa e pegue o sobrenadante. Use o kit de ensaio imunoenzimático para medir o nível de testosterona no homogeneizado de tecido testicular e teste 3 amostras paralelas para cada amostra. As etapas e métodos experimentais foram concluídos de acordo com as instruções do kit.

1.6 Observação morfológica do testículo

Pegue seções de parafina de testículo de camundongo, coradas com HE, e observe a distribuição de espermatogônias e células espermatogênicas no tecido testicular sob um microscópio de luz.

1.7 Análise estatística

A análise estatística foi realizada usando o software estatístico SPSS17.0. Densidade espermática, taxa de motilidade espermática, taxa de deformidade espermática e nível de testosterona testicular de camundongos em cada grupo foram expressos como x±s, e a comparação entre os grupos foi realizada por análise de variância de fator único.

2. resultados

2.1. Densidade espermática, motilidade espermática e taxa de deformidade espermática de cada grupo de camundongos

Comparado com o grupo controle, a densidade espermática e a viabilidade espermática do grupo modelo diminuíram (P<0.01), and="" the="" sperm="" deformity="" rate="" increased=""><0.01). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility="" rate="" of="" mice="" in="" each="" dose="" of="">Cistanche fenoxietanol glicosídeoaumentado (P<0.05 or=""><0.01), and="" the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.05 and=""><0). .01).="" compared="" with="" the="" low-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group,="" the="" high-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group="" had="" higher="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility=""><0.05), and="" the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.05). see="" table="">

2.2 Níveis de testosterona em tecidos testiculares de camundongos em cada grupo

Os níveis de testosterona nos homogeneizados de tecido testicular do grupo controle e do grupo modelo foram (10,26±0,57) e (5,33±0,84) nmol·L-1, respectivamente. O nível de testosterona do grupo modelo foi significativamente menor do que o do grupo controle (P<0.01). the="" testosterone="" levels="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" of="" the="" low-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group="" were="" (7.55±1.21)="" and="" (10.35±0.94)="" nmol·l-1.="" the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" low="" and="" high-dose="" groups="" of="" cistanche="" cistanche="" ethanol="" glycosides="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" of="" the="" model="" group=""><0.05 or=""><0.01). the="" testosterone="" level="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" of="" the="">Cistanchegrupo de alta dose de cistanche fenetil glicosídeo foi significativamente maior do que o grupo de baixa dose (P<>

2.3 Morfologia dos testículos de camundongos em cada grupo

Observados ao microscópio de luz, os túbulos seminíferos nos testículos do grupo normal estavam densamente organizados, o nível e o número de células germinativas eram grandes, o epitélio seminífero estava organizado e os túbulos seminíferos eram todos vistos com formação de espermatozóides. No grupo modelo, os túbulos seminíferos nos testículos de camundongos foram atrofiados e degenerados, o epitélio seminífero foi significativamente afinado, o número de camadas epiteliais foi reduzido, o arranjo foi desordenado e o número de espermatozóides na cavidade foi reduzido. Comparado com o grupo modelo, a dose baixa deGlicosídeo de álcool fenetílico Cistanche.

No grupo, o número de camadas epiteliais seminíferas de túbulos seminíferos aumentou, o arranjo do epitélio foi mais regular e o dano dos túbulos seminíferos foi obviamente melhorado; a estrutura dos túbulos seminíferos em altas dosesGlicosídeo feniletanoide Cistanchemelhorou mais significativamente, e o número e o número de camadas epiteliais seminíferas aumentaram significativamente. Dispostos ordenadamente, há espermatozóides maduros nos túbulos seminíferos, e a estrutura está basicamente de volta ao normal. Consulte a Figura 1 (Inserção 6).

3 Discussão

A ciclofosfamida é um fármaco antitumoral e imunossupressor comumente usado, que interfere principalmente em uma variedade de funções biológicas intracelulares através da alquilação do DNA. A toxicidade reprodutiva é um dos principais efeitos colaterais da ciclofosfamida [3], que pode facilmente levar a danos no DNA do esperma e ao desenvolvimento anormal do esperma. Estudos clínicos [10-11] indicam que a toxicidade reprodutiva da ciclofosfamida pode causar azoospermia ou oligospermia. , Levando à infertilidade ou à ocorrência de defeitos genéticos ou malformações na prole.

Cistanche tubulosaé uma planta parasitária perene da família Leiden. É uma medicina chinesa bem conhecida que nutre o rim e o yang, nutre o sangue e nutre os intestinos. É um medicamento de prescrição comumente usado para o tratamento tradicional da disfunção reprodutiva masculina [12].Glicosídeos feniletanoidessão um dos componentes ativos mais importantes daCistanche[13] e têm uma ampla gama de efeitos farmacológicos, como antioxidante, antienvelhecimento e antitumoral [14].

Neste estudo, a ciclofosfamida foi usada para preparar um modelo de camundongo de distúrbio da espermatogênese, e o efeito terapêutico dos glicosídeos feniletanoides Cistanche no distúrbio da espermatogênese causado pela ciclofosfamida foi estudado. Os resultados mostraram que em comparação com o grupo normal, a densidade espermática do grupo modelo diminuiu, a taxa de sobrevivência diminuiu e a taxa de deformidade aumentou. Em comparação com o grupo modelo, todos os grupos de dose de glicosídeos fenoxietanol Cistanche podem efetivamente aumentar a densidade do esperma, melhorar a motilidade do esperma e reduzir a taxa de deformidade do esperma. Os resultados acima indicam que os glicosídeos fenoxietanol cistanche podem promover a espermatogênese e proteger o testículo danificado. Os resultados da morfologia testicular mostraram que após o tratamento comGlicosídeo feniletanoide Cistanche, o número do epitélio seminífero nos testículos dos camundongos modelo foi significativamente aumentado, as camadas eram distintas, as células espermatogênicas estavam organizadas ordenadamente, firmemente e regularmente, e os espermatozoides podem ser vistos no lúmen, sugerindo queCistanche feniletanoidepode mudar Shanhe restaura a estrutura e morfologia do epitélio seminífero após lesão reprodutiva.

A testosterona regula a diferenciação das células germinativas masculinas e é uma condição necessária para o desenvolvimento normal dos testículos e a ocorrência normal de espermatozóides. Alguns estudos [15] relataram que o nocaute seletivo dos receptores androgênicos nas células de Sertoli do testículo causou distúrbios no desenvolvimento do esperma e esterilidade masculina. Neste estudo, a ciclofosfamida foi usada para produzir espermatogênico.

Após o modelo de lesão por obstáculo, o nível de testosterona no tecido testicular dos camundongos foi significativamente menor do que no grupo normal. Após a ação dos glicosídeos feniletanoides Cistanche, os níveis de testosterona em cada grupo de dose aumentaram, e o nível de testosterona no grupo de alta dose foi significativamente maior do que no grupo de baixa dose. Sugere-se que os glicosídeos cistanche fenoxietanol podem promover a espermatogênese aumentando o nível de testosterona no tecido testicular para tratar a disfunção espermatogênica, mas o mecanismo de seu efeito sobre a testosterona precisa de mais pesquisas e discussões.

A testosterona regula a diferenciação das células germinativas masculinas e é uma condição necessária para o desenvolvimento normal dos testículos e a ocorrência normal de espermatozóides. Alguns estudos [15] relataram que o nocaute seletivo dos receptores androgênicos nas células de Sertoli do testículo causou distúrbios no desenvolvimento do esperma e esterilidade masculina. Neste estudo, a ciclofosfamida foi usada para produzir espermatogênico.

Após o modelo de lesão por obstáculo, o nível de testosterona no tecido testicular dos camundongos foi significativamente menor do que no grupo normal. Após a ação deGlicosídeos feniletanoides Cistanche, os níveis de testosterona em cada grupo de dose aumentaram, e o nível de testosterona no grupo de alta dose foi significativamente maior do que no grupo de baixa dose. Sugere-se que os glicosídeos cistanche fenoxietanol podem promover a espermatogênese aumentando o nível de testosterona no tecido testicular para tratar a disfunção espermatogênica, mas o mecanismo de seu efeito sobre a testosterona precisa de mais pesquisas e discussões.

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