Os condensados ​​de Imd regulados por teaflavina controlam a homeostase intestinal e o envelhecimento da Drosophila Parte 2

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Fundo:A fibrose é uma das características patológicas mais comuns do processo de envelhecimento do rim, e a fibrose nos rins envelhecidos também agrava o processo de doença renal crônica (DRC). Corallodiscus flabellata BLBurtt (C.flabellata, CF) é uma droga botânica comumente usada no folclore chinês. No entanto, poucos estudos relataram seus efeitos farmacológicos. Este estudo teve como objetivo explorar o efeito do extrato etanólico de CF na fibrose renal em camundongos SAMP8 e identificar compostos potencialmente ativos.

Métodos:Camundongos 8 propensos à senescência (SAMP8) foram usados ​​como modelos animais e diferentes doses de FC foram administradas por gavagem por um mês. Observar o grau de envelhecimento renal em camundongos usando coloração com -galactosidase. A coloração de Masson e os níveis de expressão de Col-lI, a-SMA e FN foram usados ​​para avaliar a fibrose renal em camundongos. Os níveis de expressão proteica da via Nrf2 e da via Wnt/-catenina/RAS no rim foram medidos. E células NRK-52E induzidas por -galactosidase (-gal) como um modelo in vitro para rastrear os componentes ativos da FC.

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Resultados:O extrato etanólico de CF inibiu significativamente a atividade da -galactosidase renal e os níveis de expressão de camundongos Coll, a-SMA e FNin SAMP8, e melhorou a coloração de Masson em camundongos SAMP8. A FC reduziu notavelmente a proteína urinária, creatinina, nitrogênio ureico e os níveis séricos de TNF-a e IL-1 em camundongos SAMP8, e aumentou significativamente os níveis de SOD e GSH-Px. Além disso, a FC ativou a via Nrf2 e bloqueou a via Wnt/-catenina/RAS nos rins de camundongos. Além disso, 3,4-diidroxifeniletanol (SDC-0-14,16) e (3,4-diidroxifeniletanol-8-O-[4-O-trans -cafeoil- -D-apiofuranosy-(1→3)- -D-glucopiranosil (1→6)]- -D-glucopiranosídeo (SDC-1-8) foram isolados de CF , que reduziu a senescência das células NRK-52E, e talvez os ingredientes ativos da FC desempenhando o papel antienvelhecimento.

Conclusões:Nossos experimentos mostraram que o extrato etanólico de FC pode melhorar a fibrose renal em camundongos SAMP8 através da via Wnt/-catenina/RAS. E SDC-0-14,16 e SDC-1-8 podem ser a base material para que a FC exerça efeitos relacionados à senescência anti-renal.

Palavras-chave:Envelhecimento, Corallodiscus flabellata, Rim, Fibrose renal, SAMP8, Senescência, Wnt/-catenina/RAS

Introdução

A prevalência global da doença renal crônica (DRC) está aumentando com o envelhecimento da população e representa um fardo significativo para a sociedade [1-3]. A manifestação patológica mais comum da DRC é alguma forma de fibrose renal[4]. Da mesma forma, a fibrose renal também é um dos sinais do envelhecimento renal [2]. Estudos mostraram que o estresse oxidativo, inflamação, Wnt/-catenina, sistema renina-angiotensina-aldosterona (RAS) e sinalização de rapamicina (mTOR) estão todos relacionados à DRC induzida pela senescência [5]. A fibrose renal em rins envelhecidos está intimamente relacionada à ativação da via de sinalização Wnt/-catenina e RAS [6]. Após a ativação de Wnts, a -catenina no citoplasma é translocada para o núcleo, onde se liga à família de fatores de transcrição do fator de ligação ao intensificador linfóide (LEF)/fator de células T (TCF) e inicia a transcrição de genes alvo a jusante. Curiosamente, a região promotora do gene RAS também contém sítios de ligação LEF/TCF, o que permite que -catenina promova a ligação de LEF-1 a esses sítios[7].colesterol cistache,Portanto, direcionar a via de sinalização Wnt/-catenina/RAS pode ser uma estratégia terapêutica potencial para a fibrose renal [8,9]. . Xiaoyan Shen et al. descobriram que o ginsenosídeo Rgl melhorou a fibrose glomerular durante o envelhecimento renal, inibindo a ativação do inflamassoma NLRP3 em camundongos SAMP8 [11]. Este estudo explorou o efeito do extrato de C. flabellate(CF) na fibrose renal em camundongos SAMP8 da via Wnt/-catenina/RAS.

Cistanche pode anti-envelhecimento

A FC como planta medicinal na China foi registrada pela primeira vez no "Dian Nan Ben Cao". A planta inteira é comumente usada para tratar disenteria, ejaculação precoce, doença da vesícula seminal e doença renal em áreas de minorias étnicas da China [12]. , existem poucos relatos sobre FC na pesquisa moderna. Os estudos farmacológicos em nosso laboratório descobriram que o extrato de FC teve efeitos diuréticos e melhorou a insuficiência hepática induzida por lipopolissacarídeo/D-galactosamina e danos cerebrais em ratos [13, 14]. revelou que glicosídeos feniletanoides e flavonóides eram os principais componentes químicos da FC [15,16].O objetivo deste estudo foi investigar o efeito do extrato de FC na fibrose renal em camundongos SAMP8 e elucidar seu possível mecanismo, de modo evidência experimental para o tratamento da doença renal com FC descrita em livros antigos.

Materiais e métodos

Coleta e extração do material vegetal

"Yunnan Chinese Herbal Medicine" registra que a FC pode ser colhida durante todo o ano. As plantas CF usadas neste experimento foram colhidas no condado de Xixia, província de Henan, China, em setembro. Foi identificado pelo professor Suiqing Chen, da Universidade de Medicina Chinesa de Henan, e os espécimes foram armazenados na biblioteca de espécimes do laboratório.efeitos colaterais do cistanche deserticolaAs plantas (1 kg) foram submetidas a refluxo com etanol a 50 por cento (3 x 12 L, cada 1 h), e a mistura foi filtrada com 16 camadas de gaze. Os filtrados combinados foram secos por evaporação rotativa usando um liofilizador. Finalmente, o rendimento percentual de 50 por cento de extrato bruto de etanol de CF foi de 15,5 por cento. O extrato seco foi mantido em geladeira até o uso posterior. Os materiais suplementares listam os dados relevantes sobre a designação do ingrediente do extrato CF.

Outro processo de separação relatado anteriormente foi usado neste estudo para obter a fração de eluição de água, fração de eluição de 20 por cento de etanol, fração de eluição de 30 por cento de etanol e fração de eluição de 40 por cento de etanol de CF [13]. A fração de etanol a 40 por cento foi separada usando Sephadex LH-20 e coluna de sílica gel e purificada por cromatografia líquida de alta eficiência semipreparativa (HPLC) para finalmente obter compostos como SDC-0-14,16, SDC{ {10}}, SDC-0-60(álcool p-hidroxibenzílico).

Animais e administração

Camundongos SAMP8 machos de seis meses de idade e camundongos 1(SAMR1) acelerados pela senescência do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Tianjin (Tianjin, China) foram usados ​​neste estudo. Os animais foram alojados sob condições controladas de luz (12-h ciclo claro/escuro), temperatura (23-25 graus C) e umidade (45-55 por cento) e receberam uma dieta padrão e água e libitum. Um total de 48 camundongos SAMP8 foram divididos em quatro grupos experimentais (n=12/grupo): camundongos modelo SAMP8 (M), camundongos SAMP8 tratados com extrato de etanol CF de baixa dose (CF-L, 387,5 mg/kg, intragástrica), camundongos SAMP8 tratados com extrato de etanol CF de dose média (CF-M,775 mg/kg, intragástrico) e camundongos SAMP8 tratados com extrato de etanol CF de dose alta (CF-H,1550 mg/ kg, intragástricamente). Os camundongos nos grupos de controle SAMRI (Con, n=10) e SAMP8 modelo (M) foram tratados com solução salina fisiológica (0,9 por cento). Todos os camundongos foram tratados oralmente por 1 mês. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo comitê de ética da Universidade de Medicina Chinesa de Henan e realizados sob as diretrizes institucionais (Henan, China Approval Number: HACTCM-2018009060-19). Durante o experimento, houve uma morte de camundongo em cada um dos grupos Con e M, e dois camundongos morreram no grupo CF-H.

Coleta de amostras

Ao final do experimento, os camundongos foram alojados individualmente em gaiolas metabólicas para 12-h coletas urinárias. Os camundongos foram então anestesiados com isoflurano, e amostras de sangue foram coletadas por meio de sangramento retro-orbital. Os rins de cada camundongo foram então removidos cirurgicamente e mantidos a 80 graus C até as análises.

Cultura celular e estudo in vitro

NRK-52Células E compradas do Cell Bank da Academia Chinesa de Ciências (Xangai, China) foram cultivadas para investigar o efeito do extrato de FC no envelhecimento celular causado por D-galactose (D-gal, S11050, Yuanye, Xangai, China). As células NRK-52E foram cultivadas na modificação de Dulbecco do meio de Eagle Dulbecco (DMEM,12.100.046, Thermo Fisher, Massachusetts, EUA) fornecido com 10 por cento de soro fetal bovino em uma incubadora a 37 graus C e na presença de 5 percent , CO.As células foram cultivadas em 96-placas de poços ou 6-placas de poços até 80-85 por cento de confluência e depois tratadas com meio de crescimento contendo diferentes combinações de drogas: Meio mais D-gal ( 20 mg/mL）, Meio mais D-gal mais CF（10, 25,50, 100 ug/mL）ou Meio mais D-gal mais composto monomérico（10 μM） respectivamente por 48 h. Subsequentemente, o metil tiazolil tetrazólio( MTT) foi usado para detectar a viabilidade celular e a coloração com -galactosidase foi usada para observar a senescência celular.

Coloração de -galactosidase associada à senescência

Rins congelados de camundongos cortados em seções de 10-μm de espessura e células NRK-52E foram coradas com -galactosidase associada à senescência (SA- -gal, C0602, Beyotime Biotechnology, Xangai, China) seguindo os protocolos do fabricante.

Análise histológica

Os cortes de rim foram fixados com paraformaldeído tamponado a 4% e os cortes embebidos em parafina de 10-μm de espessura foram corados com tricrômio de Masson (G1006, Service, Wuhan, China) e observados microscopicamente. As áreas de cor azul nas seções coradas com tricrômio de Masson foram medidas quantitativamente a partir de seis campos selecionados aleatoriamente e analisadas pelo software Image-Pro Plus 6.0.

Medições bioquímicas

As amostras de soro e homogeneizado de rim foram descongeladas à temperatura ambiente e os níveis de superóxido dismutase (SOD, CSB-E08556m, Wuhan Huamei, Wuhan, China), glutationa peroxidase (GSH-Px, A005-1-2, Nanjing Jiancheng, Nanjing, China), interleucina-1 (IL-1 , RK00006, ABclonal, Wuhan, China), fator de necrose tumoral- (TNF-, RK00027, ABclonal, Wuhan, China), nitrogênio ureico (C{ {10}}, Nanjing Jiancheng, Nanjing, China), creatinina(Cr, C011-2-1, Nanjing Jiancheng, Nanjing, China) em soro de camundongo, proteína urinária total (C035-2-1, Nanjing Jiancheng, Nanjing , China) na urina de camundongos e os níveis de expressão de colágeno tipo I (Col-I, MU30364, Bio-Swamp, Wuhan, China), -actina do músculo liso (-SMA, MU30359, Bio-Swamp, Wuhan, China), fibronectina (FN, MU30179, Bio-Swamp, Wuhan, China) em tecidos de rim de camundongo foram medidos sequencialmente de acordo com o protocolo do fabricante do kit de ensaio.

Análise imunohistoquímica

A análise imuno-histoquímica foi realizada pelo método de rotina [17]. Os anticorpos utilizados incluíram o seguinte: Wnt4 (14371-1-AP, Proteintech, Chicago, EUA), -catenin(17565-1-AP,Proteintech,Chicago, EUA), receptores de angiotensina II tipo 1 (AGTR1,{{ 7}}AP, Proteintech, Chicago, EUA), fator p-nuclear eritróide 2-fator 2 relacionado (p-Nrf2, ab76026, Abcam, Cambridge, Reino Unido), pc-Fos(ab27793,Abcam,Cambridge, Reino Unido ), fator de crescimento do tecido conjuntivo (CTGF, GB11078, Service, Wuhan, China). Os cortes foram observados ao microscópio (Olympus, Tóquio, Japão).dosagem de cistache redditMeça a área e a densidade óptica integrada (IOD) da área com expressão tan usando o software Image-Pro Plus 6.0 e calcule a densidade óptica média (MOD, MOD=IOD/área) para semi -análise quantitativa.

Análise de Western Blot

O ensaio Western blot foi realizado conforme descrito em um estudo anterior [18]. Resumidamente, os tecidos renais foram homogeneizados em tampão de lise e quantificados usando um Bradford Protein Assay Kit (AR0197, Boster Biological Technology, Wuhan, China). Os homogeneizados foram então submetidos à eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida, transferidos para membrana de fluoreto de polivinilideno e bloqueados em tampão de bloqueio (leite em pó desnatado a 4%) por 90 min. Eles foram então incubados com anticorpos primários (Wnt4; renina; AGTR1; p-Nrf2; pc-Fos; proteína 1 associada a ECH semelhante a Kelch (Keapl, GB11847, Service-bio, Wuhan, China); -actina (AC026, Abclonal, Wuhan, China); e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH, AC033, Abclonal, Wuhan, China)) durante a noite a 4 graus, seguido de incubação com um anticorpo secundário conjugado com presença de fluo apropriado por 1 h em temperatura ambiente . As proteínas de interesse foram escaneadas com um scanner Odyssey IR (LI-COR Biosciences, Nebraska, EUA), e as intensidades de sinal foram quantificadas usando o software Image Studio. Os níveis de proteína foram normalizados contra a -actina ou GAPDH.

Análise UPLC-Q-TOF-MS para amostras de rim

Os tecidos renais foram pesados ​​e homogeneizados em soro fisiológico gelado (p/v=1:1). Em seguida, 1 mL de acetonitrila foi adicionado a 200 μL de amostras de tecido homogeneizado, seguido de extração ultrassônica por 30 min. O extrato foi centrifugado a 12,000 ge 4 graus por 10 min. O sobrenadante foi levado para o frasco para análise. A separação cromatográfica foi realizada em cromatografia líquida de ultraperformance (UPLC) (Dionex UltiMate 3000 System, Thermo Scientific, Massachusetts, EUA), com o sistema LC compreendendo uma coluna Acclaim RSLC 120 C18 （2,2 μm, 2,1×100 mm; Termo Científico).benefícios do extrato de cistacheA fase móvel consistia de solvente A(acetonitrila) e água com {{0}},1 por cento de ácido fórmico (B). A separação foi realizada por eluição em gradiente como segue:10-70 porcentagem A de 0 a 3 min,70-78 porcentagem A de 4 a 13 min,78-90 porcentagem A de 14 a 15 min, 90 por cento -10 por cento A de 15 a 16 min e 10 por cento A de 16 a 20 min. O volume de injeção da amostra de teste foi de 2μL. A análise de espectrometria de massa (MS) foi realizada usando uma fonte ESI nas seguintes condições: a tensão capilar no modo positivo foi de 3,5 kV e a tensão capilar no modo negativo foi de 3,2 kV. A pressão do nebulizador era de 2,0 bar, a temperatura do gás seco era de 230 graus e a vazão era de 8 L/min.

Análise estatística

The acquired raw data from ultra-performance liquid chromatography coupled to quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q/TOF-MS) analysis were first preprocessed using profile analysis(version 2.1, Bruker, Germany). The"bucket table" was obtained and imported into the SIMCA-P software(version13.0 Umetrics AB, Sweden)for principal component analysis (PCA). Other results were presented as mean±stand-ard deviation(SD). The data were processed using IBM SPSS Statistics 26.0. The normal distribution of the data used the Levene test, which required the average value, P>{{0}}.05; a análise de variância unidirecional foi utilizada para comparação entre os grupos. Valor de AP menor que 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

A FC melhorou o envelhecimento e a fibrose dos rins em camundongos SAMP8

Para investigar o efeito da FC nos rins de camundongos SAMP8, a atividade de SA- -gal foi medida nos rins. Na Fig. la, a atividade da SA- -gal nos tecidos renais aumentou significativamente no grupo M (realce azul). A administração de CF-L e CF-M inibiu significativamente a atividade de -galactosidase nos rins de camundongos SAMP8 enquanto a melhora por CF-H não foi significativa. Além disso, o índice renal do grupo modelo foi significativamente menor do que o do grupo controle (Fig. 1b, P<0.05). after="" treatment="" with="" cf-m,="" the="" kidney="" index="" of="" samp8="" mice="" was=""><0.01). next,="" the="" results="" of="" masson's="" trichrome="" staining="" (fig.="" lc,=""><0.01)and the="" expression="" of="" fibrosis="" indicators="" col-i,="" α-sma,="" and="" fn="" revealed="" that="" m-group="" mice="" had="" more="" severe="" renal="" fibrosis="" than="" con-group="" mice,="" and="" cf-l="" and="" cf-m="" significantly="" attenuated="" renal="" fibrosis="" in="" samp8="" mice(fig.leg,=""><>

A FC melhorou a função renal, o estresse oxidativo e os níveis de inflamação em camundongos SAMP8

Além disso, foram testados os indicadores de função renal de cada grupo de camundongos, que incluíram volume de urina em camundongos por 12 h, níveis de Cr e nitrogênio ureico no soro e níveis de proteína na urina. Conforme mostrado na Fig. 2a-d, os níveis de proteína na urina, Cr sérico e nitrogênio uréico sérico do grupo modelo foram significativamente maiores do que os do grupo controle (Fig.2a, P<0.01), while="" the="" urine="" volume="" of="" the="" model="" group="" was="" significantly="" lower="" than="" that="" of="" the="" control="" group(fig.2b-d,=""><0.01). cf="" supplementation="" down-regulated="" the="" levels="" of="" urine="" protein,="" serum="" cr="" and="" urea="" nitrogen="" in="" the="" model="" group(fig.2b-d,=""><0.05 or=""><0.01) while="" increasing="" the="" urine="" output="" of="" model="" mice.="" collectively,="" the="" results="" indicated="" that="" samp8="" mice="" had="" kidney="" damage="" associated="" with="" aging,="" and="" treatment="" with="" cf="" effectively="" ameliorated="" this="" injury.="">cistanche genghis khanEm seguida, foi explorado se a FC modulava beneficamente o estresse oxidativo e a inflamação nos rins de camundongos que envelhecem rapidamente. Conforme mostrado na Fig.2e-h, os níveis de SOD e GSH-Pxin nos rins do grupo M foram significativamente menores do que os do grupo Con, e os níveis de IL-1 foram significativamente maiores do que os de o grupo Con. Após o tratamento da FC, os indicadores acima foram melhorados, especialmente o efeito de melhora do CF-L e CF-M é melhor.

CF ativou a via Nrf2 no ​​rim de camundongos SAMP8

O nível de expressão de p-Nrf2 foi medido em tecidos renais para investigar se a via Nrf2 estava envolvida no efeito protetor da FC (Fig.3a-c) no presente estudo. O nível de expressão de p-Nrf2 diminuiu significativamente no grupo SAMP8 sozinho (P<0.01, fig.="" 3c),="" and="" the="" downregulation="" was="" reversed="" to="" some="" extent="" by="" the="" treatment="" of="" cf="" crude="" extract.="" there="" was="" no="" significant="" change="" in="" the="" expression="" level="" of="" keapl="" among="" the="" groups(fig.="" 3b="" and="" d).="" further,="" the="" expression="" level="" of="" p-c-fos="" was="" detected="" and="" analyzed="" by="" immunohistochemical="" and="" western="" blot="" analyses.="" it="" was="" found="" that="" the="" expression="" level="" of="" p-c-fos="" in="" the="" kidneys="" of="" mice="" in="" the="" m="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" con="" group;="" while="" cf="" treatment="" significantly="" reduced="" the="" expression="" levels="" of="" p-c-fos="" in="" the="" kidneys="" of="" the="" mice="" (fig.3a-b="" and="">

A CF atenuou a ativação da sinalização Wnt/-catenina/RAS no rim de camundongos SAMP8

A fim de explorar ainda mais o potencial mecanismo da FC exercendo o efeito anti-fibrose. A localização da proteína foi realizada por imuno-histoquímica. Conforme mostrado na Fig. 4a, o nível de expressão de Wnt4 e

-catenina foi induzida predominantemente em células tubulares renais. Resultados semelhantes foram observados quando AGTR1, os alvos da via a jusante da sinalização Wnt, foram avaliados (Fig. 4a). Depois disso, o nível de expressão da proteína foi quantificado e os resultados mostraram que as proteínas Wnt4, -catenina, renina e AGTR1 foram acumuladas no tecido renal dos camundongos do grupo modelo, enquanto a FC inibiu significativamente essas alterações (Fig. 4b-f ). Além disso, o nível de expressão de CTGF também foi localizado e analisado quantitativamente. Consistente com os resultados acima mencionados, CTGF foi expresso principalmente nos túbulos renais, e CF inibiu marcadamente a atividade de CTGF (Fig. 4d g).

CF e seus compostos inibiram a senescência de células NRK-52E induzidas por D-gal

Células NRK-52E induzidas por D-gal foram usadas para rastrear certos ingredientes ativos em CF, para determinar a base material para o tratamento de rins senis pelo extrato de CF. Os resultados mostraram que a CF aumentou a viabilidade celular de maneira dose-dependente e os compostos

SDC-0-14,16 e SDC-1-8 isolados de CF tiveram melhores efeitos na proliferação celular. Além disso, 25 ug/mL de CF e os compostos SDC-0-14,16 e SDC-1-8 exibiram o efeito de inibição da atividade da -galactosidase (Fig.5).

A FC melhorou a análise de PCA do tecido renal em camundongos SAMP8 A análise de componentes principais (PCA) foi realizada para explorar os efeitos da FC em camundongos SAMP8. Conforme mostrado na Fig.6a, houve um agrupamento óbvio entre os grupos de controle e modelo (R2X=0.542; Q2=0.38), sugerindo que os metabólitos endógenos de camundongos SAMP8 eram diferentes de SAMR1 camundongos, o que faz com que eles se desviem do grupo SAMR1. Conforme mostrado na Fig.6b, os diferentes grupos de CF também se agruparam em diferentes classes dos grupos de controle e modelo, e os grupos de CF se aproximaram do grupo de controle, indicando que o

os metabólitos endógenos dos camundongos SAMP8 intervencionados com FC foram semelhantes aos dos camundongos SAMR1.

Discussão

O envelhecimento desempenha um papel importante na progressão da DRC [19]. À medida que a fibrose da DRC progride, as células senescentes expressam e secretam fatores pró-fibróticos (TGF- , CTGF e assim por diante) e fatores pró-inflamatórios (IL-1 , IL-6, TNF- e assim por diante ), que são fatores fenótipos secretores associados à senescência, acelerando assim a fibrose renal [20, 21]. Atualmente, a medicina tradicional chinesa tem alcançado bons resultados no tratamento da fibrose renal com menos efeitos colaterais [22]. Este estudo explorou os efeitos intervencionistas do extrato de FC na fibrose renal em camundongos SAMP8. A linhagem de camundongo selecionada para este estudo foi SAMP8, que foi desenvolvida com base na expectativa de vida, senescência e pontuações de classificação fenotípica patológica de camundongos AKR/ e foi um modelo de envelhecimento acelerado exclusivamente de origem genética [23,24]. Estudos mostraram que as alterações na patologia renal de camundongos SAMP8 (9 meses) incluem fibrose tubulointersticial e glomeruloesclerose segmentar focal [25]. E descobriu-se que a fibrose renal em camundongos SAMP8 estava relacionada à idade [6]. Portanto, testamos a atividade da -galactosidase e

o nível de fibrose renal em camundongos SAMP8 e descobriu que CF-L e CF-M melhoraram a fibrose renal e a atividade de -galactosidase em camundongos SAMP8 (Fig.1). E também testamos a produção de urina dos camundongos. Consistente com estudos publicados anteriormente indicando que a FC obtida por dois processos diferentes teve efeitos diuréticos [13], o extrato aumentou significativamente o volume de urina de camundongos SAMP8. Além disso, o presente estudo mostrou que a suplementação com FC melhorou a função renal, a atividade de enzimas antioxidantes e os níveis de fatores inflamatórios em camundongos SAMP8(Fig.2).

O sistema Keap1-Nrf2 ganhou a atenção de muitos estudiosos nos últimos anos devido às suas propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias. Seu potencial farmacológico no tratamento de doenças renais foi extensivamente estudado em estudos não clínicos e clínicos [26]. Nrf2 é um regulador transcricional mestre para genes relacionados ao status redox e efeitos antioxidantes [27]. Estudos mostraram que a fosforilação é necessária para a ativação do Nrf2 e a indução do gene alvo [28]. A ativação do Nrf2 melhorou a progressão da DRC, prevenindo o estresse oxidativo e mantendo a homeostase redox celular [29]. Como um fator chave de transcrição, o Nrf2 desempenha um papel crucial na defesa contra o estresse oxidativo, regulando seus antioxidantes e enzimas de desintoxicação a jusante [30]. Kim et ai. relataram que o resveratrol, como um potente ativador de Nrf2, melhorou a lesão renal progressiva relacionada ao envelhecimento [31]. No presente estudo, CF melhorou a atenuação de Nrf2 no ​​rim de camundongos SAMP8 sem afetar o nível de expressão de Keapl, sugerindo que o extrato bruto de CF pode melhorar o dano oxidativo nos rins ativando a via Nrf2 (Fig. 3).

A fibrose renal é caracterizada pela deposição excessiva de matriz extracelular (MEC) levando à formação de cicatrizes no parênquima renal [32]. Acredita-se que o fator de crescimento transformador (TGF-) seja uma citocina chave na superativação de fibroblastos [33, 34]. Obviamente, direcionar apenas a via de sinalização do TGF é insuficiente para reduzir a fibrose renal. Alguns estudos indicaram que CTGF, Wnt/-catenina, sistema renina-angiotensina, estresse oxidativo e assim por diante estavam implicados na fibrose renal [35-37]. Wnt/-catenina é uma via de sinalização evolutivamente conservada envolvida na regulação da homeostase tecidual, desenvolvimento de órgãos e reparo de lesões[38]. Cisternas et ai. discutiram o efeito pró-fibrótico da sinalização Wnt no músculo esquelético e no rim [39]. Evidências crescentes estabeleceram que a via de sinalização Wnt/-catenina desempenha um papel crucial na regulação do desenvolvimento e progressão de lesões fibróticas renais após lesão [40-42]. O sinal Wnt/-catenina é relativamente silencioso nos rins de adultos saudáveis ​​e é ativado quando os rins são submetidos a vários tipos de danos [43].

Nos mamíferos, a família Wnt tem pelo menos 19 membros da família críticos para o desenvolvimento renal. E pelo menos 15 desses membros da família são regulados diferencialmente no rim envelhecido, incluindo Wnt4 [6]. Os resultados do presente estudo mostraram que o nível de expressão da proteína Wnt4 nos rins de camundongos SAMP8 foi significativamente maior do que em camundongos SAMR1, o que foi verificado tanto por Western blot quanto por análises imuno-histoquímicas (Fig. 4a, d e f). Coincidentemente, o nível de expressão da proteína -catenina também foi regulado positivamente. Além disso, tanto Wnt4 quanto -catenina foram expressos em células epiteliais tubulares renais, conforme revelado pela análise imuno-histoquímica (Fig.4a ef). Wnt/ -catenina induziu fibrose renal induzindo múltiplos genes fibrogênicos, como componentes RAS, metaloproteinase de matriz-7 (MMP-7), inibidor do ativador de plasminogênio 1 (PAI-1) e Snail [37 ]. Zhou et ai. descreveram Wnt/-catenina como o principal regulador a montante, que controla a expressão de todos os componentes RAS testados nos rins [44]. Zhou et al. usaram um modelo de rato de nefrectomia 5/6 (5/6 NX) para mostrar os níveis de expressão dos principais componentes do RAS no cérebro e nos rins, como angiotensinogênio, enzima conversora de angiotensina e angiotensina II AT{{25 }} receptor foi significativamente regulado positivamente. O nível de expressão suprarregulado foi inibido por um bloqueador central de Wnt, que era um vetor de vírus adeno-associado superexpressando o gene DKK1 [45]. Da mesma forma, o presente estudo descobriu que AGTR1 ainda era expresso no epitélio tubular renal, e os níveis de expressão de renina e AGTRl nos tecidos renais de camundongos SAMP8 eram significativamente maiores do que aqueles em camundongos SAMR1 (Fig. 4a e dg). Esses resultados indicaram que a via de sinalização Wnt/-catenina/RAS foi ativada nos rins de camundongos SAMP8, e a FC inibiu efetivamente a ativação dessa via.

O CTGF exerce múltiplas funções biológicas, incluindo a promoção da mitose de células quimiotáticas, indução de adesão e promoção da proliferação celular e síntese de MEC [35,46]. CCN2 (CTGF) modulado Wnt sinalização por ligação à proteína relacionada com o receptor de lipoproteína de baixa densidade 5/6 (LRP5/6) para mediar ainda mais a fibrose [39, 47]. Outros estudos usaram o silenciamento gênico para descobrir e confirmar que o Nrf2 regulava a via Wnt regulando o nível de expressão de CTGF, afetando a doença intersticial renal. Além disso, Nrf2 regulou o nível de transcrição de CTGF principalmente via regulador de transcrição de CTGF c-Fos [48]. A análise imuno-histoquímica revelou que CTGF e pc-Fos foram expressos principalmente em células epiteliais tubulares renais, e pc-Fos também foram distribuídos nos glomérulos. A análise quantitativa mostrou que os níveis de expressão de ambas as proteínas foram inibidos pela CF(Figs.3b ee e 4a ec). Finalmente, a análise de PCA foi usada para verificar se a FC melhorou o dano renal em camundongos SAMP8 (Fig.6). O presente estudo forneceu evidências de que a FC não apenas ativou a sinalização Nrf2, mas também contou com Nrf2 para equilibrar o estresse oxidativo e a inflamação, inibiu a sinalização Wnt/-catenina/RAS e melhorou o envelhecimento renal e a fibrogênese renal. No entanto, também encontramos uma melhora inconsistente no efeito da CF na coloração de Masson e SA- -gal neste experimento. Especula-se que isso pode ser devido à progressão inconsistente do envelhecimento renal e fibrose renal em camundongos SAMP8. O grau de envelhecimento renal nos camundongos neste experimento pode ser mais grave do que a fibrose. Portanto, o efeito de melhora do CF-H no envelhecimento renal em camundongos SAMP8 não foi tão óbvio quanto o da fibrose renal.

Como um monossacarídeo redutor, a D-galactose é amplamente utilizada em várias doenças relacionadas à idade in vivo e in vitro. Descobriu-se que D-gal causa senescência e lesão em células NRK-52E [49], induz a senescência de células epiteliais tubulares proximais do rim humano (células HKC-8) e aumenta os níveis de expressão de duas células renais proteínas marcadoras de fibrose FN e a-SMA [6]. Neste estudo, D-gal foi usado para induzir células NRK-52E in vitro. Usando o ensaio de MTT e coloração de -galactosidase para detectar os compostos isolados de CF, verificou-se que SDC-0-14,16 e SDC-1-8 aumentaram a viabilidade celular induzida por D-gal e inibiu D-gal induzida senescência celular (Fig.5). Estes sugeriram que SDC-0-14,16 e SDC-1-8 podem ser a base material para a FC retardar o envelhecimento renal. SDC-1-8 é um dos glicosídeos feniletanoides. glicosídeos feniletanoides foram encontrados para prolongar a vida útil de Caenorhabditis Elegans [50], com efeitos antienvelhecimento, [51] e neuroprotetores [52-54]. Estes fornecem uma direção para nosso estudo de acompanhamento sobre os efeitos farmacológicos da FC.

Conclusões

Em conclusão, estudos in vivo mostraram que a FC reduziu a fibrose renal em camundongos idosos. Alguns ingredientes ativos potenciais foram encontrados em experimentos in vitro. Essas descobertas forneceram suporte farmacológico para o tratamento de doenças renais usando FC e uma direção para mais pesquisas sobre os ingredientes ativos da FC.

Este artigo é extraído de Cao et al. BMC Medicina Complementar e Terapias (2022) 22:52