Ingestão oral de peptídeos de colágeno de osso de galinha antienvelhecimento da pele em camundongos, regulando a degradação e a síntese do colágeno, inibindo a inflamação e ativando os lisossomos

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Abstrato:O efeito da dieta no envelhecimento da pele tornou-se um interessante tópico de pesquisa. Estudos anteriores se concentraram principalmente nos efeitos benéficos dos peptídeos de colágeno derivados de organismos marinhos no envelhecimento da pele quando administrados por via oral, enquanto os efeitos benéficos dos peptídeos de colágeno derivados de aves no envelhecimento da pele foram raramente relatados. Neste estudo, peptídeos de colágeno foram preparados a partir de osso de galinha por hidrólise enzimática, e o efeito e mecanismo de ação de peptídeos de colágeno administrados por via oral no alívio do envelhecimento da pele induzido por UV combinado com D-galactose foram investigados. Os resultados mostraram que o colágeno de osso de galinha tinha características típicas de colágeno, e os peptídeos de colágeno de osso de frango (CPs) eram principalmente peptídeos moleculares pequenos com peso molecular de<3000 da.="" in="" vivo="" experiments="" showed="" that="" cps="" had="" a="" significant="" relieving="" effect="" on="" aging="" skin,="" indicated="" by="" the="" changes="" in="" the="" compostion="" and="" structure="" of="" the="" aging="" skin,="" improvement="" of="" skin="" antioxidant="" level,="" and="" inhibition="" of="" inflammation;="" the="" relieving="" effect="" was="" positively="" correlated="" with="" the="" dose="" of="" cps.="" further="" investigation="" showed="" that="" cps="" first="" reduce="" the="" level="" of="" skin="" oxidation,inhibit="" the="" expression="" of="" the="" key="" transcription="" factor="" ap-1(c-jun="" and="" c-fos),="" then="" activate="" the="" tgf-β/smad="" signaling="" pathway="" to="" promote="" collagen="" synthesis,="" inhibit="" the="" expression="" of="" mmp-1/3="" to="" inhibit="" collagen="" degradation,and="" inhibit="" skin="" inflammation="" to="" alleviate="" skin="" aging="" in="" mice.="" moreover,="" the="" skin="" transcriptome="" found="" that="" lysosomes="" activated="" after="" oral="" administration="" of="" cps="" may="" be="" an="" important="" pathway="" for="" cps="" in="" anti-skin="" aging,="" and="" is="" worthy="" of="" further="" research.="" these="" results="" suggested="" that="" cps="" might="" be="" used="" as="" a="" functional="" anti-aging="" nutritional="">

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Palavras-chave:péptidos de colagénio; anti-envelhecimento; transcriptoma da pele;síntese de colágeno;lisossomos

1. Introdução

Era da saúde, seguir com precisão uma dieta saudável, determinar o papel da nutrição no envelhecimento da pele e decidir o que comer para manter a pele jovem e saudável são problemas difíceis. A pele é o maior órgão do corpo, composta pela epiderme, derme e subcutâneo. Atua como uma barreira para proteger o corpo de fatores externos e também desempenha um papel na saúde e na beleza[1. O envelhecimento da pele é um processo complexo, que se divide em envelhecimento cronológico e fotoenvelhecimento e é afetado por fatores internos e externos.haste de cistacheAs principais características incluem o acúmulo de danos macromoleculares na célula, o declínio da função das células-tronco (promovendo a renovação tecidual) e a perda gradual da integridade física da pele [2]. Os principais mecanismos moleculares que causam o envelhecimento da pele incluem principalmente estresse oxidativo, encurtamento dos telômeros, danos no DNA, mutação genética, regulação de micro-RNA, acúmulo de produtos finais de glicação avançada e envelhecimento inflamatório 3]. O fotoenvelhecimento é a hiperplasia epidérmica da pele, ressecamento e degradação da matriz extracelular induzida pela radiação ultravioleta. A principal causa do fotoenvelhecimento são as espécies reativas de oxigênio (ROS) geradas pela radiação ultravioleta que medeiam a expressão de metaloproteinases de matriz (MMPs) e pró-colágeno tipo I através de vias de sinalização, como a sinalização da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK). levando à degradação da matriz extracelular (MEC) na pele e à apoptose dos fibroblastos [4]. Nos últimos anos, manter a saúde da pele e retardar o envelhecimento tornou-se popular, e encontrar ingredientes naturais, como peptídeos bioativos e polifenóis com funções antioxidantes e antienvelhecimento, tornou-se um foco de pesquisa [5].

Cistanche pode anti-envelhecimento

No entanto, o colágeno tem um grande peso molecular e é difícil de ser absorvido e utilizado diretamente, enquanto os pequenos peptídeos de colágeno molecular após a hidrólise do colágeno têm uma atividade biológica mais forte e uma alta taxa de absorção [6]. Enquanto isso, a ampla aplicação de colágeno em alimentos, medicina, engenharia de tecidos, cosméticos e outros campos tornou os peptídeos de colágeno com menor peso molecular, maior eficiência de absorção e atividade biológica mais forte um novo favorito em alimentos funcionais e pesquisas médicas [{{1 }}]. Os peptídeos de colágeno são pequenos, contendo 2-20 resíduos de aminoácidos obtidos após a hidrólise do colágeno. Eles são usados ​​como um suplemento dietético para o tratamento do envelhecimento da pele devido às suas potenciais funções anti-inflamatórias e antioxidantes e regulação imunológica e os efeitos de antioxidante e proliferação nos fibroblastos da pele [10].

Após a administração oral, os peptídeos de colágeno são absorvidos na forma de pequenos peptídeos e rapidamente transportados para o sangue e, eventualmente, para os rins, pele, articulações e outros tecidos para serem armazenados e utilizados. Após 14 dias, os níveis de radioatividade permaneceram altos na pele de camundongos que foram submetidos a gavagem com peptídeos de colágeno marcados com C14-.Cistanche tubulosa benefícios e efeitos colateraisOs peptídeos de colágeno podem ser quase completamente absorvidos e utilizados pelo corpo, enquanto a taxa de absorção e utilização do colágeno é de apenas 50-60 por cento [6,11-13]. Nos últimos anos, os hidrolisados ​​de colágeno de pele de peixe, escama de peixe, osso de vaca, pele de vaca e pele de porco têm sido amplamente relatados como tendo efeitos benéficos no alívio do envelhecimento da pele e receberam atenção considerável dos pesquisadores. Por exemplo, peptídeos de colágeno isolados da pele da carpa prateada promovem a síntese de pró-colágeno e inibem a expressão das proteínas AP-1, MMP-1 e MMP-3 pela ativação da via TGF-/Smad para prevenir a degradação do colágeno e reparar as células da pele fotoenvelhecidas [14]. A administração oral de peptídeos de colágeno bovino pode melhorar o relaxamento da pele, aumentar o conteúdo de colágeno e a atividade de enzimas antioxidantes, reparar a fibra de colágeno e normalizar a proporção de colágeno da pele em camundongos idosos [15]. No entanto, peptídeos de colágeno de diferentes fontes têm efeitos diferentes. A quantidade e a estrutura de peptídeos altamente ativos no sangue após a administração oral de peptídeos de colágeno dependem da fonte de colágeno. O efeito protetor do peptídeo de colágeno extraído da pele de galinhas contra a lesão de fibroblastos induzida por UVA foi superior ao do peptídeo de colágeno extraído da pele de porco, vaca ou tilápia, e seu efeito foi equivalente ao tripeptídeo derivado de colágeno (Gly-Pro -Hip)[16].

Crenças religiosas e preocupações com doenças (como a doença da vaca louca) levaram as pessoas a mudar gradualmente a direção do desenvolvimento do colágeno e seus produtos de mamíferos terrestres para aves e organismos marinhos|17I.Como principal subproduto do processamento de aves, o frango osso é uma fonte promissora de produtos de colágeno. Não só reduz o desperdício de recursos e a poluição ambiental, mas também permite a utilização eficiente de subprodutos. Portanto, neste estudo, usamos peptídeos de colágeno de osso de galinha como matéria-prima, com camundongos nude tratados com D-galactose e UV para induzir o envelhecimento da pele, como modelo para avaliar o efeito da administração oral do peptídeo de colágeno no alívio do envelhecimento da pele em camundongos e determinar o mecanismo relevante.

2. Materiais e métodos

2.1.Materiais, Produtos Químicos e Animais

As granjas de frangos da Yunnan Agricultural University (Kunming, China) forneceram as galinhas gastas, que foram separadas, secas e trituradas para obter a farinha de ossos de frango. Os kits de Su-peróxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GSH-PX) foram adquiridos da Soleibao Biotechnology Co., Ltd. (Pequim, China). Hidroxiprolina (HYP), interleucina-1 (IL-1x), metaloproteinase de matriz-1/3 (MMP-1/3), pró-colágeno tipo I e ácido hialurônico Os kits de imunoensaio (ELISA) ligados a enzimas (HA) foram adquiridos do Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, China). Camundongos BALB/C saudáveis ​​e sem pelos (18±2g, seis semanas de idade) foram adquiridos da Nanijing Junke Bioengineering Corporation, Ltd. (Nanjing, China) com número de licença: SCXK(SU)2016-0010.extrato de cistanche tubulosaPepsina e papaína foram adquiridas da Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. (Xangai, China), e outros produtos químicos eram de grau analítico. Todos os camundongos foram manuseados seguindo os Regulamentos do Laboratório de Cuidados com Animais da Província de Yunnan e aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidados com Animais da Universidade Agrícola de Yunnan (ID de aprovação: YAUACUC01).

2.2. Preparação de colágeno e composição de aminoácidos

A extração e composição de aminoácidos do colágeno de osso de frango seguiram o método descrito por Liuet al. [18]com pequenas modificações. O pó de osso de galinha foi agitado e embebido em 0.05 M NaOH, 10 por cento de n-hexano e 0,25 M EDTA solução (pH 7,5 ) na proporção de 1/10 (m/o). Em cada etapa, a amostra foi tratada por 36 h, e a solução de imersão foi trocada a cada 6 h para inchar o pó de osso, remover proteínas não-colágenas, gordura e minerais do pó de osso. A amostra foi lavada com água pura até a neutralidade após cada etapa. A farinha de osso de frango pré-tratada foi misturada com ácido acético glacial 0,5 M contendo 0,1 por cento (p/v) de pepsina em uma razão sólido-líquido de 1:10 (p/v) e continuamente agitada e extraída a 4 graus para 48h. Em seguida, foi filtrado e o filtrado foi centrifugado a 15,000×g por 15min a 4 graus. O pH do sobrenadante foi ajustado para 7.5-7.8 com solução de NaOH e NaCl foi adicionado a uma concentração final de 1,5 M. Após a mistura ser mantida em repouso por 12 h a 4 graus para salgar, o colágeno O precipitado foi centrifugado a 15,000×g por 15 min a 4 graus, depois dissolvido com ácido acético 0,5 M, dialisado em água pura, liofilizado e o produto final foi colágeno de osso de galinha.

A composição de aminoácidos do colágeno de osso de galinha foi determinada pelo analisador automático de aminoácidos Sykam S433D (Munique, Alemanha). Uma certa quantidade de amostra de colágeno a ser testada foi retirada em um tubo selado, adicionada de 10 mL de HCl 6 M e hidrolizada a 110C por 24 h. O hidrolisado foi concentrado por sopro de nitrogênio e redissolvido em 20 mL de tampão de ácido cítrico. Após a microfiltração com uma membrana microporosa de 0,22 um, 20 μL de hidrolisado foram retirados para análise de espectro de aminoácidos. O teor de aminoácidos na amostra foi expresso em porcentagem.

2.3. Preparação e Distribuição de Peso Molecular de Peptídeos de Colágeno (CPs)

De acordo com os resultados do nosso processo de otimização anterior, os CPs foram preparados usando papaína em uma proporção enzima-substrato de 1:40 (razão de massa). Após ajuste do pH para 7 e hidrólise enzimática a 63 graus por 5 h, a enzima foi inativada em banho-maria fervente por 15 min. O hidrolisado da enzima foi dessalinizado e liofilizado, redissolvido em solução de ácido fórmico a 0,1 por cento e centrifugado para obter o sobrenadante. AQ Exactive HF Orbitrap High-Resolution Mass Spectrometer-QE-HF (Thermo Fisher, Waltham, MA, EUA), equipado com ionização por eletrospray (ESI, foi usado para analisar o hidrolisado de colágeno no modo de varredura completa de 350-1800 m /z, e os resultados foram recuperados e analisados ​​usando o software Proteome Discoverer 2.1.

2.4. Teste em Animais

Camundongos BALB/C sem pelos (n{0}}) foram mantidos em uma sala sob condições controladas de temperatura (24±1 graus), umidade (60 ±5 por cento) e um Ciclo dia-noite de 12 horas durante uma semana. Eles tiveram acesso ad libitum a comida e água. Após uma semana de adaptação, os camundongos foram divididos aleatoriamente nos cinco grupos a seguir (n=11 por grupo):(i). Grupo normal (N): não exposto à UV; administração oral de 0,4 mL de solução salina diariamente. (ii). Grupo modelo (M): exposto a UV mais D-galactose (0,2 mL); administração oral de 0,4 mL de solução salina diariamente.

(eu). Grupo de peptídeos de colágeno de baixa dose (LCPs): expostos a UV mais D-galactose (0,2 mL); oral

administração de 0,4 mL CPs (dose: 200mg:kg-1 peso corporal) diariamente.

(4). Grupo de peptídeos de colágeno de dose média (MCPs): expostos a UV mais D-galactose; oral

administração de 0,4 mL de CPs (dose: 500 mg·kg-1 de peso corporal) diariamente.

(v). Grupo de peptídeos de colágeno de alta dose (HCPs): expostos a UV mais D-galactose; administração oral-

ração de 0,4 mL CPs (dose: 1000 mg kg-1 de peso corporal) diariamente.

O tratamento com D-galactose foi realizado pela injeção subcutânea de 0,2 mL de solução de D-galactose a 10 por cento na parte de trás do pescoço do camundongo (dose:1.0g/ kg-1peso corporal) diariamente. A irradiação UV foi realizada com um LAMIP de 40 W UVA-340 (O-panel, Cleveland, EUA, comprimento de onda de pico: 340 nm), a distância entre a lâmpada e a parte traseira dos camundongos foi de 30 cm (230 m J/cm -), e a irradiação durou 30 minutos todos os dias durante sete semanas (49 dias). A intensidade da radiação foi medida por um radiômetro 365-UVA (Xinbao Keyi Electronic Technology Co., Ltd., Xi'an, China). Uma hora após o tratamento com D-galactose e UV, os camundongos receberam 0,4 mL de CPs por via oral todos os dias. Após a última irradiação, os camundongos foram anestesiados, pesados ​​e os tecidos foram amostrados para análise posterior.

2.5. Umidade da pele, índice visceral e ganho de peso corporal

A umidade da pele foi determinada pela ISO 1442, e o índice visceral foi calculado usando a seguinte equação: índice visceral(g/kg)= peso visceral/peso corporal.

2.6. Oxidatioe Stress, HA e HYP Conteúdo da Pele

As amostras de pele foram homogeneizadas com nove vezes a quantidade de solução salina normal (p/p) em um banho de gelo com um homogeneizador de tecidos (TGrender OSE-Y30, Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Pequim, China) e depois centrifugadas a 2000 ×g e 4 graus por 10 min. As atividades de superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GSH-PX), e os teores de ácido hialurônico (HA) e hidroxiprolina (HYP) no sobrenadante coletado foram determinados de acordo com o método descrito no instruções correspondentes aos respectivos kits.

2.7. Histológico da Pele

Amostras de pele de camundongo foram fixadas em solução de paraformaldeído a 4% por 24 h, desidratadas, embebidas em parafina e fatiadas. Os cortes de pele foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e observados com um microscópio de fluorescência direta ECLIPSE CI-E (Nikon, Japão). A espessura da epiderme e da derme da pele foi avaliada usando o software Halcon 13.0.1.1 (MVTec, Munique, Alemanha).

2.8. Sequenciamento do transcriptoma da pele

2.8.1. Extração de RNA, construção de biblioteca e sequenciamento de transcriptoma

O RNA total foi extraído da pele de camundongos usando o RNeasy Mini Kit (Tiangen Bio-chemical Technology Co., Ltd., Pequim, China) de acordo com as instruções do fabricante. A pureza e concentração do RNA foram verificadas usando o espectrofotômetro kaiaoK5500(Kaiao, Pequim, China); A integridade do RNA foi avaliada usando o RNA Nano 6000 Assay Kit e o sistema Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA). A análise de sequenciamento transcricional de cada amostra foi realizada pela Biolinker Technology Company Limited (Kunming, China). Resumidamente, o agrupamento das amostras codificadas por índice foi realizado em um sistema de geração de agrupamento cBot usando HiSeq PE Cluster Kit v4-cBot-HS(llu-mina) de acordo com as instruções do fabricante. Após a geração do cluster, as bibliotecas foram sequenciadas em uma plataforma Ilumina e foram geradas leituras pareadas de 150 bp.

2.8.2. Análises de bioinformática de dados de sequenciamento de RNA

Gene Ontology (GO) e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) enriquecimento análise de genes diferencialmente expressos (DEGs) foi realizada usando o pacote R language cluster analyzer. Quando o valor de p foi menor que 0,05, os itens e vias enriquecidos por GO e KEGG foram considerados significativos.

2.8.3. Reação em Cadeia de Transcriptase-Polimerase Reversa (qRT-PCR)

O QRT-PCR foi realizado conforme descrito anteriormente [19].

2.9. Mancha de Wester

De acordo com o método descrito por Park et al. [20], a análise de Western blot (WB) foi realizada para quantificar a expressão de proteínas relacionadas ao envelhecimento da pele em camundongos. A concentração de proteína do lisado da pele em cada grupo de tratamento foi quantificada usando o kit BCA, separado por SDS-PAGE (gel de acrilamida a 10 por cento), transferido para uma membrana de PVDF, bloqueado com leite desnatado a 5 por cento e incubado com uma quantidade adequada de anticorpos (TGF-b1, c-Fos, c-Jun, Samd2/3 e -actina) a 4 graus durante a noite. Após a lavagem com TBST, as amostras foram misturadas com anticorpos secundários e incubadas à temperatura ambiente por 1 h.comentários de cistanche tubulosaO gerador de imagens em gel ChemiDoc XRS plus quimioluminescência (BioRAD, Hercules, CA, EUA) foi usado para detectar proteínas específicas. Image] foi usado para quantificar a expressão da proteína alvo em cada grupo de tratamento, e os resultados foram representados pelos valores de densidade normalizados para a proteína -actina.

2.10.ELISA

Os níveis de expressão de MMP-1, MMP-3, pró-colágeno tipo I e IL-1& no fluido de lise da pele foram determinados por imunoensaio enzimático. O ensaio foi realizado de acordo com as instruções fornecidas com o kit.

2.11.Análises Estatísticas

Todos os resultados foram analisados ​​no software SPSS 21 (IBM Inc., Armonk, NY, EUA) por meio de análise de variância unidirecional (ANOVA) e teste de múltiplos intervalos de Duncan, com nível de significância definido como p<0.05. originpro="" 2017(originlab,="" northampton,="" ma,="" usa)was="" used="" to="" plot="" the="" data.="" all="" data="" were="" expressed="" as="" the="" mean="" ±="" standard="" deviation="">

3 Resultados e discussão

3.1. Composição de Aminoácidos do Colágeno

A composição de aminoácidos do colágeno de osso de galinha é mostrada na Tabela 1. Gly foi o principal aminoácido nas amostras, representando quase um terço (27.86 por cento) do total de aminoácidos, e Hyp foi o aminoácido especial no colágeno, respondendo por 9,83 por cento. As principais características das moléculas de colágeno foram as sequências Gly-XY repetidas e a estrutura helicoidal tripla única composta por três cadeias. Gly representava cerca de um terço do total de aminoácidos, X e Y eram frequentemente prolina e hidroxiprolina, ou poderia ser qualquer resíduo [21]. A composição de aminoácidos da amostra foi semelhante ao colágeno de osso de galinha relatado em estudos anteriores e tinha as características típicas do colágeno [22].

3.2. Distribuição de peso molecular de CPs

Molecular weight distribution reflects the degree of collagen hydrolysis. The molecular weight of the CPs was mainly below 3000 Da (Figure 1), accounting for about 87.61%of all collagen hydrolysates, indicating that almost all of the CPs were small peptides. Many studies claim that collagen peptides with a lower molecular weight have better biological activity [23]. For example, Song et al. [24]. reported that lower molecular weight (200-1000 Da, 65%)silver carp skin collagen peptides repaired UV-induced aging skin in mice more effectively than similar peptides with a higher molecular weight(>1000 Da, 72 por cento). No entanto, a empresa alemã Gelita mostrou através de vários estudos clínicos que o efeito dos peptídeos de colágeno é determinado principalmente pelo seu grau de correspondência com as propriedades dos peptídeos de colágeno após a degradação do colágeno humano, em vez do peso molecular dos peptídeos de colágeno. Eles descobriram que o produto VERISOL③ com peso molecular médio de 2000 Da tem o efeito mais estimulante sobre os fibroblastos da pele, enquanto o produto FortigelTM com peso molecular médio de 3000 Da tem um efeito especial no reparo da cartilagem [25-27].

3.3. Efeito dos CPs orais no alívio do envelhecimento da pele

3.3.1. Peso Corporal e Índice de Órgãos

O índice de peso corporal e o índice de órgãos são importantes e refletem o estado de saúde dos camundongos. O peso dos camundongos em cada grupo aumentou normalmente durante o período de teste (Tabela 2). O ganho de peso médio do grupo M foi menor do que o do grupo N, e o dos grupos de tratamento com CP foi maior do que o do grupo M, sugerindo que os CPs não tiveram efeitos colaterais em camundongos. Em relatórios anteriores, a dose de camundongos tratados com peptídeo de colágeno estava principalmente entre 100-1000 mg/kg.bw·d, e a dose segura de peptídeos de colágeno de tilápia atingiu 4,07 g/kg.bw·d [{{6} }]. Da mesma forma, o crescimento de camundongos envelhecidos pela pele após gavagem com peptídeos de colágeno de escama de tilápia (dose: 500 e 1000 mg/kg·bw·d) também foi semelhante aos nossos resultados [29]. O baço desempenha um papel importante na imunidade humoral e celular, assim, o índice do baço é frequentemente usado para avaliar a função do sistema imunológico.cistache Reino UnidoThe liver index was used to evaluate the toxicity of the tested sample. In these tests, the liver and spleen indices in the M group were lower than those in the N group, and both recovered after treatment with CPs, but there was no significant difference across the treatment groups (p >0.05). Os resultados foram semelhantes aos de estudos anteriores [30], indicando que os CPs são seguros e podem melhorar ligeiramente a imunidade dos camundongos.

3.3.2. Composição da Pele

O tratamento com UV e D-galactose (grupo M) reduziu significativamente o teor de umidade, HA e Hyp na pele, em comparação com os do grupo N, em 13,36%, 24,08% e 15,83%, respectivamente (p<0.05)(table 2).="" the="" contents="" of="" moisture,="" ha,="" and="" hyp="" in="" the="" skin="" were="" significantly="" higher="" in="" mice="" after="" the="" oral="" administration="" of="" cps="" compared="" to="" the="" contents="" of="" those="" in="" the="" mice="" of="" the="" m="" group=""><0.05). among="" the="" dose="" groups,="" the="" contents="" of="" the="" three="" skin="" components="" were="" significantly="" different="" between="" the="" lcp="" and="" hcp="" groups="" and="" were="" dependent="" on="" the="" dose="" of="" intake="" of="" cps.="" the="" hcp="" group="" had="" even="" higher="" contents="" than="" the="" n="" group,="" and="" ha="" and="" hyp="" were="" significantly="" different="" between="" the="" two="" groups="" (p=""><>

Mudanças no teor de umidade da pele causam rugas e flacidez da pele e são afetadas por componentes da matriz, como colágeno da pele e AH[31]. A hidroxiprolina é um aminoácido estável, rico e especial em colágeno, e seu conteúdo pode refletir indiretamente o conteúdo de colágeno na pele, bem como o envelhecimento da pele. no controle do equilíbrio hídrico da pele, pressão osmótica, retenção de umidade e elasticidade como sistema de armazenamento de água e componente estrutural da pele [32]. Neste estudo, o teor de umidade, HYP e HA na pele aumentou significativamente após a ingestão de CP, o que pode estar relacionado à promoção da síntese de colágeno e AH pelos CPs. Além disso, o aumento de HYP e HA aumentou o teor de umidade.

3.3.3. Alterações histológicas da pele

As alterações histológicas da pele do dorso dos camundongos após sete semanas de tratamento contínuo são mostradas na Figura 2. A pele envelhecida do grupo M apresentou as características de superfície áspera, epiderme espessada, derme afinada e células esparsas, em comparação com a pele de o grupo N. No entanto, a condição de envelhecimento da pele em camundongos melhorou após a administração oral de CPs, mantendo uma estrutura lisa, ordenada e completa semelhante à dos camundongos do grupo N. Assim, a derme da pele foi significativamente mais fina e a epiderme foi significativamente mais espessa no grupo M do que no grupo N (p<0.05). the="" change="" in="" skin="" dermis="" and="" epidermal="" thickness="" was="" significantly="" better="" after="" treatment="" with=""><0.05), and="" the="" effect="" was="" more="" obvious="" with="" the="" increase="" in="" the="" dose="" of="" cps="" (figure="" 2).the="" effect="" of="" oral="" cps="" on="" the="" histological="" structure="" of="" aging="" skin="" was="" similar="" to="" that="" reported="" previously="" [4,28,31].="" the="" increase="" in="" the="" thickness="" of="" the="" epidermis="" might="" be="" an="" adaptive="" change="" to="" protect="" the="" skin="" from="" external="" stimuli,loss="" of="" skin="" moisture,="" and="" uv="" damage,="" possibly="" due="" to="" the="" increase="" in="" uv-activated="" epidermal="" growth="" factor="" receptor="" (egfr)="" that="" induces="" keratinocyte="" proliferation="" and="" epidermal="" hyperplasia[4].="" however,="" the="" mechanism="" by="" which="" oral="" cps="" alleviate="" the="" increase="" in="" epidermal="" thickness="" remains="" unclear.="" the="" dermis="" imparts="" elasticity="" and="" strength="" to="" the="" skin,="" and="" the="" degradation="" of="" ecm="" and="" the="" reduction="" in="" the="" ability="" to="" repair="" fibroblasts="" are="" the="" main="" causes="" of="" dermal="" thinning="" in="" aging="" skin.="" dermal="" thickness="" increased="" after="" the="" treatment="" with="" cps,="" which="" might="" be="" due="" to="" the="" removal="" of="" ros="" from="" the="" skin="" and="" inhibition="" of="" the="" increase="" of="" mmps="" by="" cps.="" this,="" in="" turn,="" inhibited="" the="" degradation="" of="" skin="" collagen="" and="" elastin="" (figure="" 3),="" the="" entry="" of="" cps="" in="" the="" skin,="" and="" their="" participation="" in="" the="" synthesis="" of="" collagen="" and="" ha="" [6],="" which="" was="" confirmed="" by="" the="" increase="" in="" the="" content="" of="" hyp="" and="" ha="" in="" the="" skin="" (table="">

3.3.4. Níveis antioxidantes e inflamatórios da pele

Determinar a atividade de enzimas antioxidantes é o método mais comumente usado para avaliar o nível de antioxidantes no corpo [28]. Conforme mostrado na Figura 3, as atividades do conteúdo de CAT, SOD, GSH-Px e MDA no grupo M foram significativamente menores do que as do grupo N (p<0.05). administering="" cps="" effectively="" inhibited="" the="" decrease="" of="" cat,="" sod,="" gsh-pxactivities,and="" the="" mda="" content="" in="" the="" skin="" of="" mice,="" compared="" to="" those="" in="" the="" mice="" skin="" of="" the="" m="" group,="" and="" was="" positively="" correlated="" with="" the="" dose="" of="" cps;="" there="" were="" significant="" differences="" among="" the="" different="" dose="" groups=""><0.05). when="" ros,="" accumulated="" by="" skin="" oxidative="" stress,="" exceed="" the="" antioxidant="" defense="" ability="" of="" the="" body,="" they="" destroy="" the="" ecm,="" which="" is="" the="" key="" cause="" of="" skin="" aging.="" ros="" can="" cause="" the="" oxidation="" of="" lipids="" and="" proteins="" in="" the="" skin,="" resulting="" in="" fibroblast="" degeneration="" and="" changes="" in="" the="" skin.="" ros="" activate="" the="" mapk="" signaling="" pathway="" and="" the="" ap-1="" protein="" to="" upregulate="" the="" expression="" of="" mmps="" and="" promote="" the="" degradation="" of="" matrixcollagen="" [21].="" although="" the="" antioxidant="" enzymes="" and="" antioxidants="" in="" the="" body="" can="" remove="" ros="" to="" protect="" the="" skin="" from="" damage,="" when="" the="" content="" of="" rosexceeds="" the="" defense="" (antioxidant)="" ability="" of="" the="" body="" or="" the="" body's="" defense="" ability="" declines,="" it="" causes="" oxidative="" stress="" and="" skin="">

Além disso, a resposta inflamatória celular causada por ROS também contribui para o envelhecimento da pele. Após o tratamento com UV e D-galactose (grupo M), o conteúdo de IL-lo na pele dos camundongos aumentou significativamente em comparação ao grupo N (Figura 3D ), indicando que a pele apresentou uma resposta inflamatória significativa (p<0.05). the="" cps="" significantly="" reduced="" the="" content="" of="" il-1α="" in="" the="" skin="" in="" a="" dose-dependent="" manner,="" compared="" to="" that="" in="" the="" skin="" of="" mice="" in="" the="" m="" group.="" there="" was="" a="" significant="" difference="" between="" hcps="" and="" lcps=""><0.05),indicating that="" cps="" alleviated="" skin="" inflammation.="" the'o,="" produced="" by="" ultraviolet="" irradiation="" stimulated="" the="" expression="" of="" mmp-1="" in="" dermal="" fibroblasts="" through="" the="" secretion="" of="" il-1α="" and="" il-6,="" thereby="" disrupting="" the="" ecm="" [33].="" therefore,="" this="" study="" suggested="" that="" cps="" significantly="" increased="" the="" activity="" of="" skin="" antioxidant="" enzymes="" and="" inhibited="" inflammatory="" responses,="" which="" might="" be="" important="" in="" delaying="" skin="" aging="" in="">

3.4. Mecanismo de ação dos CPs dietéticos no alívio do envelhecimento da pele

3.4.1. Análise e Validação de Dados de RNA-Seq

Analysis techniques, such as PCA, HCA, gene GOenrichment, and KEGG pathway enrichment were used to analyze the transcriptome data. Based on the PCA analysis (Figure 4A) and hierarchical clustering analysis (heat map)of 4303 differential genes with average channel strength greater than 100, the relative expression levels of total DEGs between the two treatment groups are shown to provide an overview of the changes in gene expression(Figure 4B). The M group and the HCP group were significantly separated, and the expression patterns of most DEGs in the M and HCP groups were opposite, indicating that there were significant differences between the mouse skin after HCP treatment and the M group (Figure 4A,B). Pairwise comparisons showed that after feeding HCPs,4303 genes were significantly expressed in the mice skin, including 1790 upregulated genes and 2513 downregulated genes(Foldchange>2,p<0.05)(figure 4c).among="" the="" sixgenes="" associated="" with="" skin="" aging="" quantified="" by="" qrt-pcr,="" five="" genes="" (including="" fos,="" jun,="" cxcll,and="" egr1)were="" downregulated,="" and="" one="" gene="" was="" upregulated="" (figure="" 4d),="" which="" was="" consistent="" with="" the="" overall="" trend="" of="" transcriptomic="" data.="" the="" rna="" expression="" levels="" of="" fos,="" jun,="" and="" cxcll="" were="" significantly="" upregulated="" in="" damaged="" skin="" compared="" to="" that="" in="" intact="" skin="" [34],="" and="" inhibition="" of="" egr1="" expression="" alleviated="" skin="" inflammation="" [35].="" these="" results="" reflected="" the="" reliability="" of="" transcriptome="" sequencing="" data,="" and="" oral="" cps="" effectively="" alleviated="" skin="">

A análise GOenrichment e a análise de enriquecimento do banco de dados KEGG forneceram suporte para uma investigação mais aprofundada das funções biológicas dos DEGs. A análise GO mostrou que os DEGs foram significativamente enriquecidos em processos biológicos como replicação de DNA, regulação da hemopoiese, regulação da atividade da hidrolase e produção de citocinas; em componentes celulares, que incluíam vacúolo lítico e lisossomo, genes contendo colágeno e outros relacionados foram significativamente enriquecidos; em termos de função molecular, atividade receptor-ligante, atividade de citocinas e outros genes relacionados foram significativamente enriquecidos (Figura 5). A análise de enriquecimento KEGG das primeiras 20 vias de sinal alteradas significativamente por DEGs é mostrada na Figura 5. Interação citocina-receptor, lisossomo, interação ligante-receptor neuroativo, ciclo celular, lúpus eritematoso sistêmico e via TGF (p<05) were="" closely="" related="" to="" aging,="" especially="" cytokine-receptor="" interactions,="" lysosomes,="" and="" tgf-βsignaling.="" an="" important="" feature="" of="" cellular="" senescence="" is="" the="" accumulation="" of="" damaged="" or-ganelles="" and="" protein="" aggregates.="" lysosomes="" play="" an="" important="" role="" in="" degrading="" damaged="" organelles="" and="" protein="" aggregates="" in="" senescent="" cells="" [36].="" cytokine-receptor="" interaction="" is="" the="" main="" pathway="" of="" enrichment="" in="" the="" skin="" after="" being="" affected="" by="" various="" factors="" such="" as="" inflammation="" [37],="" sulfur="" mustard="" exposure="" [38],="" and="" terahertz="" pulse="" [39].="" cytokines,="" as="" small="" molecular="" proteins="" synthesized="" and="" secreted="" by="" various="" tissue="" cells,="" maintain="" skin="" homeostasis="" by="" controlling="" the="" balance="" between="" keratinocyte="" proliferation,="" diferentiation,="" and="" apoptosis="" through="" complex="" interactions="" with="" growth="" factors[40].="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway="" is="" also="" important="" for="" regulating="" skin="" aging[14].="" gene="" functional="" enrichment="" anal-ysis="" showed="" that="" tgf-β="" was="" highly="" expressed="" during="" cytokine-receptor="" interaction="" and="" in="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway.="" tgf-β="" is="" a="" major="" pro-fibrotic="" cytokine="" that="" regulates="" cell="" differentiation="" and="" proliferation="" while="" inducing="" extracellular="" matrix="" protein="" synthesis="" [41].="" therefore,="" we="" verified="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway="" and="" some="">

3.4.2. Verificação do Mecanismo de Ação dos CPs no Alívio do Envelhecimento da Pele

Para verificar o papel da via de sinalização de TGF- e da interação citocina-receptor no alívio do envelhecimento da pele por CPs orais, foi realizada análise de WB para verificar o TGF- e o fator de transcrição Smad2/3 na via de sinalização de TGF-, bem como a chave fator de transcrição AP-1 (c-Fos e c-Jun) que regula as citocinas. O conteúdo de MMP-1, MMP-3, pró-colágeno tipo I e IL-1 foi determinado por ELISA. Os resultados da análise WB mostraram que a expressão de TGF-, Smad2 e Smad3 no grupo M foi significativamente menor do que no grupo N(p<0.05). the="" expression="" levels="" of="" tgf-β="" and="" smad3="" were="" significantly="" higher="" in="" mice="" after="" the="" oral="" administration="" of="" cps="" compared="" to="" their="" levels="" in="" group="" m="" mice;="" additionally,="" smad2="" also="" increased=""><0.05), except="" for="" in="" the="" lcps="" in="" a="" dose-dependent="" manner(figure="" 6).="" on="" the="" contrary,="" the="" expression="" of="" c-fos="" and="" c-jun="" in="" the="" mgroup="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" n="" group.="" the="" expression="" of="" c-fos="" and="" c-jun="" in="" the="" cp="" group="" was="" significantly="" lower="" than="" that="" in="" the="" m="" group,="" except="" for="" the="" expression="" of="" c-jun="" in="" the="" lcp="" group=""><0.05), and="" the="" change="" was="" dose-dependent.="" these="" results="" indicated="" that="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway="" was="" activated="" and="" ap-1="" was="" inhibited="" after="" feeding="">

A proteína AP-1 é um complexo dimérico de proteínas da família Jun e Fos e é um importante regulador da inflamação da pele e da expressão de citocinas. Geralmente, o complexo composto por c-Jun e c-Fos apresenta a maior atividade transcricional na pele [41,A42]. As ROS produzidas em células da pele envelhecidas primeiro ativam a proteína AP-1 e, em seguida, regulam as citocinas a jusante (como IL-1), MMPs e a via de sinalização de TGF por meio da transcrição e tradução, facilitando assim o envelhecimento da pele[43 ,44]. A reação de sinalização TGF-/Smad é uma via clássica de síntese de colágeno, e o fator de transcrição Smad está no centro dessa via de transdução de sinal. TGF- desencadeia a fosforilação e ativação de Smad2 e Smad3 a jusante por ligação ao receptor, aumentando assim a síntese de COLI [14].

Além disso, os resultados do ELISA mostraram que o conteúdo de MP-1,MMP-3 e IL-1a na pele do grupo M foi significativamente maior do que no grupo N, e o conteúdo de pró-colágeno Typel foi significativamente menor (p<0.05). however,="" the="" contents="" of="" mmp-1,mmp-3,and="" il-1α(figure="" 3d)in="" the="" skin="" after="" oral="" administration="" of="" cps="" were="" significantly="" lower="" than="" those="" in="" the="" m="" group=""><0.05); type="" i="" pro-collagen="" increased="" significantly,="" and="" all="" the="" changes="" were="" dose-dependent="" with="" cps="" (figure="" 7).="" mps="" are="" involved="" in="" the="" decomposition="" of="" skin="" collagen,="" il-1o="" shows="" the="" level="" of="" inflammation="" of="" the="" skin,="" and="" type="" i="" pro-collagen="" reflects="" the="" synthesis="" of="" skin="" collagen.="" accumulating="" evidence="" suggests="" that="" the="" role="" of="" the="" jun/ap-1="" protein="" pathway="" has="" also="" been="" proposed="" to="" regulate="" skin="" inflammation="" [40].="" the="" elisa="" results="" showed="" that="" the="" combined="" treatment="" of="" uv="" and="" d-galactose="" caused="" skin="" collagen="" degradation,="" decreased="" collagen="" synthesis,="" and="" caused="" skin="" inflammation,="" leading="" to="" skin="" aging.="" however,="" these="" changes="" were="" reversed="" after="" the="" oral="" administration="" of="">

Além das vias acima, neste estudo, os genes regulados positivamente após o tratamento com CP foram significativamente enriquecidos na via do lisossomo, indicando que o tratamento com CP ativou o lisossomo na pele (Figura 5). Estudos anteriores indicam que lisossomos ativados limpam agregados e elevam a ativação de células-tronco neurais senescentes durante o envelhecimento [45]. Além destes, a função de aumento do lisossomo pode reduzir a concentração de ROS intracelulares para prevenir a dormência celular. Da mesma forma, qualquer diminuição na função do lisossomo pode aumentar a concentração de ROS intracelular que acaba por promover a dormência da célula [46] CPs para aliviar o envelhecimento da pele, e continuaremos a tentar verificá-lo.

Portanto, este estudo mostrou que os CPs dietéticos podem aliviar o envelhecimento da pele induzido por UV e D-galactose de maneira dose-dependente. Os CPs aliviam o envelhecimento da pele diminuindo o nível de oxidação da pele, inibindo a expressão dos principais fatores de transcrição AP-1(c-Jun e c-Fos), ativando a via de sinalização TGF-/Smad para promover a síntese de colágeno, inibindo a expressão de MMP-1 e MMP-3 (que inibem a degradação do colágeno) e inibem a inflamação da pele para aliviar o envelhecimento da pele (Figura 8). Além disso, nossos achados no estudo atual também sugerem que o lisossomo ativado pode ser um importante via para os CPs regularem o envelhecimento da pele, o que merece atenção especial.

4. Conclusões

Em resumo, este estudo confirmou que a suplementação dietética de peptídeos de colágeno de osso de galinha pode aliviar significativamente o envelhecimento da pele induzido pela radiação ultravioleta e D-galactose através de múltiplas vias, que incluem a promoção da síntese de pró-colágeno, inibindo a degradação do colágeno, melhorando o nível antioxidante da pele, e inibindo a inflamação; o alívio foi dependente da dose com CPs. Uma investigação detalhada mostrou que os CPs primeiro reduzem o nível de oxidação da pele, inibem a expressão do fator de transcrição chave AP-1(c-Jun e c-Fos) e então ativam a via de sinalização TGF-/Smad para promover síntese de colágeno, inibem a expressão de MMP-1 e MMP-3 para inibir a degradação do colágeno e inibem a inflamação da pele para aliviar o envelhecimento da pele em camundongos. Além disso, a ativação de lisossomos também pode ser o principal caminho para os CPs aliviarem o envelhecimento da pele, o que é digno de pesquisa e verificação de acompanhamento. Esses resultados fornecem uma base teórica para a implementação de peptídeos de colágeno para aliviar o envelhecimento da pele e ampliar o escopo para a utilização abrangente de subprodutos animais em alimentos funcionais.

Este artigo foi extraído de Nutrients 2022, 14, 1622. https://doi.org/10.3390/nu14081622 https://www.mdpi.com/journal/nutrients