O estudo sobre o mecanismo neuroprotetor de Cistanche e Fomitopsis Pinicola em neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo induzidos por MPP plus

O estudo do mecanismo neuroprotetor de Cistanche e Fomitopsis Pinicola em neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo induzidos por MPP plus

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Destaques

Fomitopsis Pinicola é caracterizada por propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias e imunoestimulantes. No presente estudo, culturas de células dopaminérgicas primárias preparadas a partir de mesencéfalo embrionário de camundongo foram usadas para determinar aneuroprotetorefeitos e os mecanismos potenciais do extrato aquoso de Fomitopsis Pinicola na degeneração de neurônios dopaminérgicos induzida por MPP plus. Os resultados demonstraram que o extrato aquoso de Fomitopsis Pinicola protegeu os neurônios dopaminérgicos contra MPP plus. O extrato aquoso de Fomitopsis Pinicola apresentou atividades antioxidante e anti-inflamatória. O mecanismo doneuroprotetorO efeito do extrato aquoso de Fomitopsis Pinicola pode estar relacionado à inibição do estresse oxidativo mitocondrial. Estudos recentes mostraram que aneuroprotetorefeito deCistanchetorna um "candidato ideal" para melhorar as doenças neurológicas.Cistancheé rico em echinacosides. O extrato decistachedemonstrou induzir a síntese do fator de crescimento nervoso em experimentos in vivo e in vitro, promover a secreção de fatores relacionados no cérebro e melhorar uma série de funções cerebrais relacionadas à memória.

Cistanchetemneuroprotetorefeitos

Abstrato

Objetivo: Observar aneuroprotetormecanismo do extrato aquoso de Fomitopsis Pinicola na apoptose induzida por MPP de células dopaminérgicas mesencefálicas in vitro.Métodos: A atividade antioxidante de fungos foi determinada pelo método FRAP. A atividade anti-inflamatória dos fungos foi detectada pelo método de liberação de NO induzida por LPS. Dopaminérgico mesencefáliconeurôniosforam marcados por coloração TH para observar a sobrevivência de THirneurôniosResultados: No ensaio de atividade antioxidante, a capacidade antioxidante equivalente de Trolox (TEAC) do extrato aquoso de Fomitonsis Pinicola foi determinada como sendo (165,80±7,13) umol Trolox/g extrato Extratos aquosos do tratamento Fomitopsis Pimicola(100,50,25 ,12,5 ug/ml) diminuiu significativamente a formação de NO. MPP* induziu condensação de cromatina significativa nos núcleos de células dopaminérgicas mesencefálicasneurônioscom a lise nuclear, o potencial de membrana mitocondrial diminuiu notavelmente, e a produção de ROS aumentou significativamente. Comparado com o grupo controle MPPt, as alterações morfológicas dos núcleos celulares após a apoptose foram revertidas pelo extrato aquoso de Fomtitonsis Pinicola. O extrato de água do tratamento com Fomitopsis Pinicola (50,25,12,5ug/ml) aumentou dramaticamente o potencial relativo da membrana mitocondrial em comparação com o controle MPP', respectivamente. Comparado com o controle MPPt, o extrato aquoso do tratamento Fomitonsis Pimicola (50, 25ug/ml) diminuiu significativamente a formação relativa de ROS, respectivamente.neuroprotetorefeito em células dopaminérgicas mesencefálicas induzidas por MPpt, O extrato aquoso de Fomitopsis Pinicola apresentou atividades antioxidante e anti-inflamatória. O mecanismo doneuroprotetorO efeito do extrato aquoso de Fomitopsis Pimicola pode estar relacionado à inibição do estresse oxidativo mitocondrial.Cistancheglicosídeos podem melhorar o nível de aprendizado e memória de pacientes com doença de Alzheimer, reduzir o conteúdo de malondialdeído (MDA) no tecido cerebral e aumentar a glutationa peroxidase (GSH). -Px), a atividade da superóxido dismutase (superóxido dismutase, SOD), reduz a atividade da acetilcolina esterase (acetilcolina esterase, TChE), a taxa de apoptose das células cerebrais e reduz o acúmulo de cálcio no tecido cerebral.

Palavras-chave: Fomitopsis Pimicola, dopaminérgiconeurôniosapoptose, antioxidante, potencial de membrana mitocondrial, formação de ROS,Cistanche, Neuroprotetor

Fundo

Mal de Parkinsoné uma doença neurodegenerativa em seres humanos, que afeta seriamente a saúde de mais de 6,5 milhões de pessoas em todo o mundo. A prevalência de idosos com mais de 65 anos é de cerca de 1 2 por cento [1, 2]. Embora a exata etiologia e patogênese daMal de Parkinsonainda não está claro, o estresse oxidativo tem se mostrado um fator chave na degeneração seletiva de doenças dopaminérgicas.neurôniosno estriado nigroestriatal [3, 4]. Estudos mostraram que a produção excessiva de Espécies Reativas de Oxigênio (ROS) induz a disfunção mitocondrial, incluindo diminuição do potencial de membrana mitocondrial (△Ψm) e a atividade de enzimas do complexo da cadeia respiratória Ⅰ, bem como DNA mitocondrial anormal [5, 6]. Além disso, a sensibilidade e a seletividade da via nigroestriatal ao estresse oxidativo também podem levar a danos no DNA de células dopaminérgicas.neurôniosem pacientes comMal de Parkinson [7].

Extrato de glicosídeo feniletanoide emCistanchedeserticola pode melhorar significativamente a composição de 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina, MPTP) induzidas por PD modelo C57 características comportamentais, aumentar a substância nigra tirosina hidroxilase (tirosina hidroxilase, TH) até e conteúdo de DA no corpo estriado de pacientes comMal de Parkinson.Além disso, ocistacheextrato de fenil etanol glicosídeo tem um bom efeito inibitório no declínio da viabilidade das células granulares cerebelares em pacientes comMal de Parkinsone previne a apoptose celular induzida por MPP plus do grânulo cerebelarneurôniosinibindo a ativação de caspase-3 e caspase-8. Morte, exercem seu efeito anti-apoptótico.

Fomitopsis Pinicola é um fungo medicinal que pertence às Polyporaceae e Pseudomonas. Tem um sabor plano e levemente amargo e tem efeitos farmacológicos, como anti-oxidação, antibacteriano, antitumoral e aprimoramento imunológico [8, 9]. Nossos estudos anteriores confirmaram que os extratos aquosos de Fomitopsis Pinicola têm um efeito protetor na apoptose induzida por MPP plus de células dopaminérgicas do mesencéfalo fetal, o que pode aumentar significativamente o número de células dopaminérgicas.neurôniose comprimento axonal, e Aumentar a atividade da enzima I do complexo da cadeia respiratória mitocondrial [10].

Neste estudo, utilizaremos o método do poder antioxidante redutor férrico (FRAP) para observar a capacidade antioxidante de extratos aquosos de Fomitopsis Pinicola, e observar o efeito anti-inflamatório da liberação de NO induzida por lipopolissacarídeo (LPS) na microglia BV2. Os efeitos do mesencéfalo dopaminérgico cultivadoneurôniossobre a morfologia nuclear, potencial de membrana mitocondrial e produção de ROS foram observados in vitro, de modo a revelar o mecanismo de proteção dos endomicetos sobre a dopaminérgicaneurônios.

Material

Animal

Os 14-camundongos de gravidez diurna, OF1/SPF, do Instituto Austríaco de Animais de Laboratório e Genética Veterinária, realizaram experimentos com animais de acordo com a Diretiva da Comissão Europeia 86/609/EU.

Amostra de teste

A Fomitopsis Pinicola foi produzida na Áustria e foi identificada pelo Professor Wolf-Dieter Rausch como Footmitopsis Pinicola. Após a pulverização da Fomitopsis Pinicola, o extrato aquoso foi obtido por extração com água quente, e o teor de polissacarídeo bruto foi de 8,95 por cento.

linha celular

Linha celular de microglioma de camundongo BV2, do Departamento de Bioquímica da Universidade Veterinária de Viena, em meio DMEM (Sigma) contendo 10 por cento de soro fetal bovino, 2 por cento de B27 (Gibco), 2 por cento de glutamina, 37 graus e 5 por cento de cultura de CO2.

meio de cultura celular

Meio BM (meio básico) ao qual o meio DMEM foi suplementado com 10 por cento de soro fetal bovino, 30 mM de glicose, 2 mM de glutamina, 1 por cento de estreptomicina e 0,5 por cento de anfotericina.

principais reagentes e instrumentos

MPP plus é um produto sigma, pureza maior ou igual a 98 por cento; anticorpos primários e secundários anti-tirosina hidroxilase (TH) são todos produtos da American Vectastain. TPTZ(2.4.6-terpiridina triazina), FeCl3·6H2O, FeSO4·7H2O são produtos da solução de secagem americana sigma-Aldrich.DAPI. A solução de tingimento JC-1 e a solução de tingimento C-DCDHF-DA são produtos da Invitrogen Molecular Probes. A concentração original da solução foi de 1mg/ml,Img/ml e 1M, respectivamente. Microscópio de fluorescência, fabricado pela empresa Nikon no Japão, modelo TS-100-F. Espectrofotômetro para produtos Germany Pharmacia Biotech, modelos para Novaspec ⅡI.

Cistanchepode previnirMal de Parkinson

método

Determinação da capacidade antioxidante de extratos pelo método FRAP

Após a preparação de 30 ml de fluido de trabalho FRAP (300 mmol/L de tampão de acetato, 10 mmol/L de solução de TPTZ, 20 mmol/L de soluções de FeCly misturadas uniformemente em uma proporção de volume de 10:1:1), 450 mu L de FRAP de trabalho líquido foi adicionado com diferentes concentrações de 60 ul de extratos aquosos de Fomitopsis Pinicola e 45 ul de água de evaporação dupla. A mistura a 37 graus C evita a reação da luz após 30 min, então determina seus valores de absorbância em 593 nm. A capacidade antioxidante total de cada extrato foi quantificada usando Trolox como padrão. Três ensaios paralelos foram realizados para cada amostra. Os resultados foram expressos como equivalente de Trolox (TEAC)(mol TEAC/g) por grama de extrato.

O ensaio de liberação de NO foi usado para detectar o efeito anti-inflamatório do extrato

As células BV2 em fase logarítmica foram inoculadas em 48-placas de poços na concentração de 1 x 10 grau de células/ml. Após incubação a 37 graus e 5 por cento de CO2, o lipopolissacarídeo (LPS) foi adicionado para estimulação, a concentração final foi de 1 ug/ml. Em seguida, diferentes concentrações do extrato foram adicionadas, e as células foram cultivadas a 37 graus sob 5 por cento de CO, por 48 h, após o que a concentração de NO foi medida. Antes do julgamento. Os reagentes de Griess A e B foram retirados do refrigerador a 4 graus C e deixados equilibrar a temperatura ambiente por 30 min. Os padrões de nitrito foram diluídos em série (20,10, 5,2,1 e 0,5uM) para produzir curvas padrão. Adicione 50 μL do padrão diluído e o sobrenadante da amostra a ser testada (4 réplicas para cada concentração), adicione à placa do poço 96-e adicione 50

uL da solução A, incubar à temperatura ambiente por 10 min no escuro e adicionar 50 uL da solução B. Após incubação por 10 min à temperatura ambiente no escuro, a absorbância foi medida em 550 nm com leitor de microplacas em 30 min, e a liberação de NO no sobrenadante foi calculada de acordo com a curva padrão [11]. Ao mesmo tempo, 10 ul de MTT (5 mg/mL em solução de PBS) foram adicionados a cada poço da placa de células e cultivados a 37 graus para 5 por cento de CO, por 4 h. Depois que o sobrenadante foi descartado, 100 µL de DMSO foram adicionados a cada poço e a absorbância foi medida a 570 nm após totalmente dissolvido, para observar a taxa de sobrevivência das células.

Cultura e identificação de células dopaminérgicas primárias do mesencéfalo e tratamento medicamentoso

Os camundongos prenhes foram sacrificados e transferidos para uma placa de Petri contendo tampão DPBS, os embriões de camundongo foram dissecados, o mesencéfalo foi isolado, cortado em pequenos pedaços e coletado em tampão DPBS contendo 2ml de 0 1 por cento de tripsina e 2ml de {{ 3}}.02 por cento de DNase L Incubar por 7 min em banho-maria a 37 graus e, em seguida, adicionar 2 ml de inibidor de tripsina a uma concentração de 0.125 mg/ml, centrifugar o tecido a 100 xg por 4 min e descarte o sobrenadante. Então, meio DMEM contendo 0,02 por cento de DNase I foi adicionado e as células separadas foram ressuspensas em meio de cultura de células BM, semeadas em placas de células tratadas com polilisina e cultivadas a 37 graus, 5 por cento de CO. No 10º dia de cultura, 10 μM MPP* foi adicionado às células de neurônios primários cultivadas para tratamento e, em seguida, 50,25.12,5 ug/ml de extrato aquoso de Fomitopsis Pinicola foi adicionado para tratamento a 37 graus, 5% de CO, foi cultivado por 48 horas. No 12º dia de cultivo, algumas células foram utilizadas para identificação de neurônios dopaminérgicos, e as células foram fixadas com paraformaldeído a 4 por cento a 4 graus por 30 min, e então permeáveis ​​por 30 min em temperatura ambiente com 0,4 por cento de Triton X{{ 33}}. Após lavagem com tampão PBS por 3 vezes, foi bloqueado com solução de bloqueio de soro de cavalo por 90 min, então o anticorpo primário anti-TH foi adicionado durante a noite, então o anticorpo secundário biotinilado foi adicionado à temperatura ambiente por 90 min e, finalmente, 3,3 '-diaminobenzidina (DAB, 5 mg/ml) foi desenvolvida. As células positivas para a cor TH foram observadas ao microscópio como neurônios dopaminérgicos.

Observação da morfologia nuclear

As células MPP plus e tratadas com drogas foram fixadas com 4 por cento de paraformaldeído por 30 min, depois rompidas com 0,4 por cento de Triton X-100 por 30 min e, em seguida, adicionadas com solução de coloração DAPI em uma concentração final de 1 ug/ml durante 5 min à temperatura ambiente. A morfologia do núcleo foi observada sob um microscópio de fluorescência. O comprimento de onda de excitação foi de 340 nm e 4 campos foram selecionados aleatoriamente para cada poço.

Detecção do potencial de membrana mitocondrial

As células MPP plus e tratadas com drogas foram adicionadas a JC-1 dve a uma concentração final de 10 ug/ml e incubadas a 37 graus por 15 min. As mudanças de intensidade de fluorescência foram observadas por microscopia de fluorescência a 488 nm e 568 nm de luz de excitação, respectivamente. A mudança no potencial de membrana mitocondrial foi medida pela razão entre a intensidade de fluorescência em 568 nm e a intensidade de fluorescência em 488 nm.

Teste de produção de ROS

As células MPP plus e tratadas com drogas foram adicionadas a C-DCDHF-DA dve em uma concentração final de 10 mM e após incubação a 37 graus por 30 min, a solução de cultura foi descartada e as células foram lavadas duas vezes com um meio DMEM incolor . A microscopia de fluorescência foi usada para observar a mudança da intensidade de fluorescência. O comprimento de onda de excitação foi de 488 nm e 4 campos de visão foram selecionados aleatoriamente para cada poço. O tempo de exposição das células à luz de excitação não foi superior a 5s.

Resultados

Capacidade antioxidante de Fomitopsis Pinicola

Fomitopsis Pinicola tem um efeito antioxidante óbvio, e seu extrato aquoso tem uma capacidade antioxidante de （165,80±7,13）μmol TEACh extrato.

Efeito anti-inflamatório de Fomitopsis Pinicola

Após as células BV2 induzidas por LPS, a liberação de NO aumentou significativamente, o que foi significativamente diferente do grupo controle normal. Após o extrato aquoso de Fomitopsis Pinicola, a liberação de NO foi significativamente reduzida, dentre os quais 100,50, 25, houve diferença significativa entre o grupo dose de 12,5 ug/ml e o grupo LPS (Fig. 1). Após células BV2 induzidas por LPS, a taxa de sobrevivência celular foi significativamente menor do que a do grupo controle normal. Após a ação do extrato aquoso de Fomitopsis Pimicola, o grupo dose 100ug/ml teve redução significativa na viabilidade celular, e houve diferença significativa em relação ao grupo LPS. O grupo de dose de 50,25,12,5 ug/ml não teve efeito significativo na viabilidade celular (Figura 1, Figura 2).

Identificação de neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo em ratos fetais

Após a coloração específica de TH dos neurônios do mesencéfalo fetal de rato cultivados, os neurônios dopaminérgicos mostraram uma cor amarelo-acastanhada clara, e a coloração dos corpos celulares e axônios era claramente visível, o que provou que os neurônios dopaminérgicos foram cultivados com sucesso (Figura 3) .

Figura 1 Efeitos de extratos aquosos de Fomitopsis Pinicola na liberação de NO em células BV2

induzida por LPS

Nota: comparado com o grupo controle normal, **p < {{0}}.01;="" comparado="" com="" o="" grupo="" lps,="" ##p="">< 0,01,="" #p=""><>

Figura 2 influência do extrato aquoso de Fomitopsis Pinicola na taxa de sobrevivência de células BV2

Nota: comparado com o grupo controle normal, **p < 0.01;="" comparado="" com="" o="" grupo="" lps,=""><>

Figura 3 TH - coloração do neurônio DA do mesencéfalo marcado

Efeito da Fomitopsis Pinicola na morfologia nuclear DAPI,4',6-diamidino-2-fenilindol, é um mergulho fluorescente que penetra na membrana celular e se liga estranhamente ao DNA. Os resultados deste experimento mostraram que os núcleos dos neurônios dopaminérgicos no grupo controle normal permaneceram quase intactos e a cromatina era uniforme. O grupo MPP mais controle apresentou condensação de cromatina significativa, lise de membrana nuclear e lise nuclear. Após a ação do extrato aquoso de Fomitopsis Pinicola, a morfologia do núcleo ficou relativamente intacta e as características de apoptose foram reduzidas (Figura 4).

Efeito da Fomitopsis Pinicola no Potencial da Membrana Mitocondrial

Após MPP mais indução, o potencial de membrana mitocondrial dos neurônios dopaminérgicos diminuiu significativamente, o que foi significativamente diferente do grupo controle normal (P<0.01). after="" the="" action="" of="" the="" aqueous="" extract="" of="" fomitopsis="" pinicola,="" the="" mitochondrial="" membrane="" potential="" decreased="" after="" mpp+="" induction.="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" mitochondrial="" membrane="" potential="" in="" the="" 50,="" 25,="" and="" 12.5ug/ml="" dose="" groups="" compared="" with="" the="" mpp+="" control="" group=""><0.01,><0.05)(figure>

Efeito de Pseudomonas Sinensis na produção de ROS

Após a indução de MPP mais, a produção de ROS de neurônios dopaminérgicos foi significativamente aumentada. que foi significativamente diferente do grupo controle normal (P<0.01). after="" the="" action="" of="" the="" aqueous="" extract="" of="" fomitopsis="" pinicola,="" the="" ros="" increased="" after="" mpp+induction.="" the="" reduction="" of="" ros="" production="" in="" the="" 50="" and="" 25="" ug/ml="" dose="" groups="" was="" significantly="" different="" from="" the="" mpp+control="" group=""><0.01)(figure 6,="" figure="">

Figura 4. Imagem de coloração de fluorescência DAPI de neurônios DA no mesencefálico

Figura 5 O efeito do extrato aquoso de Fomitopsis Pinicola em MPP plus induzida por mitocondrial

o potencial de membrana dos neurônios DA mesencefálicos

Nota: Comparado com o grupo controle normal, **P < {{0}}.01;="" comparado="" com="" mpp="" mais="" grupo="" controle,="" #="" #="" p="">< 0,01,="" #="">

0.05.

Figura 6. Coloração de fluorescência C-DCDHF-DA de neurônios DA no mesencefálico

Figura 7 efeitos de extratos aquosos de Fomitopsis Pinicola em MPP plus induzida mesencefálica DA

neurônio produção de ROS

Nota: comparado com o grupo controle normal, **P < {{0}}.01;="" comparado="" com="" mpp="" mais="" grupo="" controle,="" #="" #="" p=""><>

Conclusão

A degeneração dos neurônios dopaminérgicos (neurônios DA) no mesencéfalo é perdida e o corpo de Lewy no citoplasma dos neurônios residuais é a principal característica daMal de Parkinson.Os sintomas clínicos incluem principalmente tremor estático, bradicinesia, hipermiotonia, instabilidade postural, et al. Atualmente, o tratamento deMal de Parkinsonainda é dominado pela terapia de reposição de dopamina. Embora possa melhorar os sintomas dos pacientes, não impede o desenvolvimento da doença. A aplicação a longo prazo irá causar muitas reações adversas [12], pelo que o estudo de novas abordagens terapêuticas é imperativo. Estudos mostraram que o estresse oxidativo e os níveis de dopamina oxidada são causas importantes de danos seletivos de neurônios dopaminérgicos [13], e alguns antioxidantes naturais, como quercetina, curcumina, polifenóis do chá e outros, foram confirmados como sendo a dopamina causada por agentes nervosos. O dano neuronal tem efeitos protetores óbvios [14-16], por isso é promissor rastrear drogas para o tratamento deMal de Parkinsonde medicamentos tradicionais chineses com efeitos farmacológicos antioxidantes.

Neste estudo, o FRAP foi usado para detectar a capacidade antioxidante de extratos aquosos de Fomitopsis Trolox Pinicola, usando (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman)2- ácido carboxílico) foi encontrado para ter efeitos antioxidantes significativos. O efeito anti-inflamatório dos extratos aquosos detectados é o método Pinicolawas Fomitopsis dby BV2 microglia release NO, e não houve efeito significativo sobre a viabilidade celular em concentrações abaixo de 100 ug/ml, indicando que foi nas células gliais efeitos inflamatórios e não têm efeito significativo na sobrevivência das células.

O estresse oxidativo refere-se ao desequilíbrio entre a produção e a eliminação de radicais livres de oxigênio no corpo. É um evento precoce no processo de degeneração neuronal-apoptose. Estudos mostraram que o tecido cerebral é rico em fosfolipídios e ácidos graxos insaturados, ambos suscetíveis ao estresse oxidativo. Em pacientes comMal de Parkinson, Malondialdeído, o índice de peroxidação lipídica, no corpo estriado é significativamente aumentado, enquanto a concentração de poliinsaturados. os ácidos graxos diminuíram significativamente [17], o conteúdo de glutationa (GSH) diminuiu e a função da enzima I do complexo da cadeia respiratória mitocondrial foi prejudicada [18,19]. MPP plus é um metabólito do agente neurotóxico MPTP no corpo, que pode gerar radicais livres no corpo, inibir a função mitocondrial, destruir neurônios DA na substância negra e desenvolver sintomas deMal de Parkinsonem modelos animais. O NO também está envolvido no mecanismo de dano do MPP plus. O excesso de NO se difunde nos neurônios DA, que pode nitrosar com o sítio sulfidrila da enzima e inibir a atividade da enzima I do complexo da cadeia respiratória mitocondrial [20,21].

Os resultados deste estudo mostraram que após MPP plus induzir neurônios DA cultivados primários, o núcleo mostrou apoptose óbvia, potencial de membrana mitocondrial diminuído e a produção de ROS aumentou significativamente, indicando que MPP plus pode induzir a apoptose de neurônios DA inibindo o estresse oxidativo mitocondrial. extrato aquoso de Fomitopsis Pinicola a pode melhorar a morfologia dos neurônios dopaminérgicos após MPP mais indução, aumentar o potencial de membrana mitocondrial e reduzir a produção de ROS, indicando que o extrato aquoso de Fomitopsis Pinicola inibe o dano dos neurônios DA do mesencéfalo danificados por agentes nervosos, o que pode ser relacionados com a sua anti-oxidação e inibição da produção de NO, e protegem os neurónios através da inibição do stress oxidativo mitocondrial.

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