Efeitos de glicosídeos de cistanche na plasticidade morfológica sináptica em camundongos acelerados por senescência
Mar 11, 2022
Contato: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
LIAN Juanqi1, WANG Lu2, ZHAO Fujun3, LIN Shuai3, YAN Xusheng4, JIA Jianxin4, CAI Zhiping4
(1. Série 2014 da Escola de Pós-Graduação da Faculdade de Medicina Baotou, Baotou 014060, China)
(2. Turma 12 da Classe 2015 de Medicina Clínica na Baotou Medical College)
(3. Classe 1 do Grau 2013 Medicina Forense na Baotou Medical College)
(4. Departamento de Anatomia Humana da Baotou Medical College)
ABSTRATO
Objetivo: Para investigar o efeito deglicosídeos decistache (GCs) na plasticidade sináptica de neurônios do hipocampo em camundongos propensos a senescência acelerados 8 (SAMP8).Métodos: 40 camundongos foram divididos aleatoriamente em grupo controle, grupo veículo, grupo de baixa dose (GCs administrados 2,5 mg / kg ·d), grupo de dose média (GCs administrados 5.0 mg / kg d) e grupo de alta dose (GCs administrados 10,0 mg/kg · d). Os camundongos do grupo controle não receberam nenhuma intervenção; aqueles em grupos administrados e o grupo veículo foram submetidos à administração intraperitoneal (GCs/solução salina) ou solução salina por 30 d. O número de neurônios piramidais normais na região CA1 do hipocampo foi contado por coloração de Nissl; o número de espinhos dendríticos nas sinapses foi contado por coloração de Golgi, e a expressão proteica de PSD-95 foi quantificada por imuno-histoquímica．Resultados: Em comparação com os do grupo controle, os GCs aumentaram significativamente o número de neurônios piramidais normais na região CA1 do hipocampo (P<0.05) and="" increased="" the="" number="" of="" dendritic="" spines="" in="" synapses="" (p=""><0.05). the="" expression="" levels="" of="" psd-95="" in="" administered="" groups="" were="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" control="" group="" (p=""><0.05), and="" the="" effect="" in="" the="" middle="" dose="" group="" was="" the="" most="" significant.="">Conclusão: GCs podem melhorar a taxa de sobrevivência das células piramidais do hipocampo e melhorar a plasticidade sináptica．
PALAVRAS-CHAVE: Glicosídeos de cistanche (GCs); Camundongo acelerado por senescência; Espinha dendrítica; PSD－95
Com o envelhecimento da população social cada vez mais grave, a prevalência dedoença de Alzheimer(AD) tem aumentado gradativamente, o que trouxe um pesado fardo para as famílias dos pacientes e para a sociedade
[1]. As principais manifestações clínicas da DA são o comprometimento cognitivo e o comprometimento da memória, e as principais características do caso são as placas senis formadas por depósitos amiloides extracelulares e emaranhados neurofibrilares intracelulares[2]. A patogênese da DA ainda é inconclusiva. As alterações patológicas das sinapses são consideradas a base neurobiológica da memória da DA e da disfunção cognitiva. Alterações anormais nas sinapses podem ser o elo central na patogênese da DA. O camundongo acelerado por senescência (SAM) é um camundongo modelo de envelhecimento consanguíneo. Sua sublinha P8 possui características patológicas de envelhecimento uniformes e estáveis, que se manifestam por um declínio progressivo na aprendizagem e memória e reconhecimento com o aumento dos meses. A disfunção conhecida e as manifestações patológicas são semelhantes aos pacientes com DA, portanto, os camundongos SAMP8 são um modelo animal ideal para estudar o mecanismo de aprendizado relacionado ao envelhecimento e comprometimento da memória.
Este artigo pretende analisar a taxa de sobrevivência celular, medir a densidade de espinhas dendríticas e detectar compactos pós-sinápticos para explorar o possível mecanismo de GCs(glicosídeos decistache)afetando a plasticidade morfológica sináptica dos neurônios do hipocampo em camundongos que envelhecem rapidamente, com vistas ao tratamento da DAcistacheglicosídeos(GCs) A aprendizagem espacial e o comprometimento da memória fornecem embasamento teórico e experimental.
1 Material e métodos
1.1 Animais experimentais e agrupamento de 40 camundongos SAMP8 machos 10- meses de idade (adquiridos da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Tianjin), criados em ambiente limpo, temperatura ambiente (24.0 ± 1.0) grau , umidade (50,0 ± 5,0) por cento , comida e água grátis. Os animais foram criados até 11 meses de idade para iniciar o experimento. Os animais foram divididos aleatoriamente em 5 grupos (8 animais/grupo): grupo controle em branco (controle), grupo controle solvente (veículo),glicosídeos totais cistanche(GCs) grupo de baixa dose [2,5 mg / (kg ·d)], grupo de média dose [5. 0 mg / (kg · d)], grupo de alta dose [10.0 mg / (kg · d)]. Os animais do grupo controle não receberam nenhuma intervenção. Os animais do grupo de baixa dose receberam GCs 2,5 mg / (kg ·d), os animais do grupo de dose média receberam GCs 5,0 mg / (kg ·d), e os animais em o grupo de alta dose recebeu GCs. 0 mg / (kg ·d), os animais do grupo do veículo receberam a mesma quantidade de solução salina normal. Injeção intraperitoneal contínua de drogas ou soro fisiológico por 30 dias, 0,5 mL/d.
1.2 Preparação e processamento das amostras Os animais foram sacrificados 24 horas após a última administração, anestesiados e o pescoço sacrificado. Corte a cavidade torácica para expor o coração, corte o apêndice atrial direito para deixar o sangue sair e insira a agulha de perfusão no ventrículo esquerdo. Após a infusão de 100 mL de solução salina normal, 4% de paraformaldeído continuou a ser infundido até que os membros dos camundongos ficassem rígidos. Pegue o cérebro e coloque-o em paraformaldeído a 4% por mais de 24 horas.
1.3 Medicamentos e reagentes GCs(glicosídeos decistache) foram adquiridos da Academia Chinesa de Medicina Tradicional Chinesa, densidade pós-sináptica －95, PSD －95 foram adquiridos da Epitomic, o kit Coomassie Brilliant Blue CBBG 250 foi adquirido da Nanjing Jiancheng Biotechnology Co., Ltd. Instituto de Engenharia, kit de imuno-histoquímica DAB foi adquirido da Empresa de biotecnologia de Pequim Zhongshan Jinqiao.
1.4 Coloração de Nissl e contagem de células Fixação de tecido cerebral com paraformaldeído a 4 por cento por mais de 24 horas, corte e desidratação com álcool gradiente, xileno transparente, imersão em cera, inclusão em parafina convencional, corte seriado de 5 μm de espessura. Corte as fatias e desparafinar para água, tingir com 1 por cento de azul de toluidina a 37 graus por 60 min, lavar por 5 min × 3 vezes, diferenciar com 95 por cento de álcool, 100 por cento de álcool Desidratar, xileno transparente, montar com goma neutra, observar sob o microscópio. A área CA1 da mesma seção hipocampal de cada grupo foi selecionada aleatoriamente a partir de 3 campos de observação (×100), o número de células piramidais normais dentro de 1 mm foi contado e a média foi tomada para análise.
1.5 Coloração de Golgi modificada Colocar o tecido cerebral reparado em solução de coloração de Golgi-Cox, proteger da luz por 14 dias e trocar a solução a cada 2 dias; coloque o tecido cerebral em 30 por cento de sacarose e coloque-o em uma geladeira a 4 graus. O tecido pode ser seccionado após afundar até o fundo; micrótomo vibratório para corte e coloração; solução fixadora para desenvolvimento; a secagem da placa de montagem, observação e contagem ao microscópio. Observe as alterações na espinha dendrítica do ápice neuronal do hipocampo CA1 e CA3 de cada grupo de camundongos e calcule a densidade da espinha dendrítica.
1.6 Os cortes imuno-histoquímicos foram desparafinizados para água, incubados com 3% de H2O2 por 10 minutos para eliminar a atividade da peroxidase endógena, lavados com água destilada por 5 minutos × 3 vezes, reparados por micro-ondas de alta pressão, lavados com PBS por 5 minutos × 3 vezes, soro de cabra foi bloqueado por 30 min em temperatura ambiente, anticorpo primário de coelho anti-rato-95 foi adicionado gota a gota, durante a noite a 4 graus, lavado com PBS por 5 min × 3 vezes, anticorpo secundário marcado com biotina foi adicionado gota a gota, incubado a 37 graus por 2 h, lavado com PBS por 5 min × 3 vezes, soltar a estreptavidina marcada com peroxidase de rábano, lavar com PBS por 5 min × 3 vezes, lavar com DAB por 2 min, contracoloração com hematoxilina, desidratado com álcool gradiente, transparente com xileno e montar. 1.7 Processamento de imagens e análise estatística. Os mesmos cortes transversais do hipocampo de cada grupo foram selecionados para observação. Três campos de visão (×100) foram selecionados aleatoriamente na área CA1 para contar o número de células piramidais normais dentro de 1 mm, e a média foi analisada. Os resultados da imunohistoquímica foram medidos pelo software de análise de imagens IPP 7.0. Os dados experimentais foram analisados pelo software SPSS 17.0, e ANOVA de uma via foi usada para comparação de médias multiamostras pareadas. P<0.05 was="" considered="" statistically="">
Doença anti-Alzheimer
2 resultados
2.1 O efeito dos glicosídeos totais decistachena contagem de células piramidais normais no hipocampo de camundongos SAMP8 Coloração de Nissl Os resultados da coloração de Nissl mostraram que o número de neurônios na área CA1 do grupo controle diminuiu, o arranjo foi desordenado e a maioria das células apresentou morfologia anormal e lise e necrose. A morfologia das células nos GCs(glicosídeos decistache)o grupo estava relativamente claro e completo, com grande número de saliências visíveis, o corpo de Nissl estava roxo, os nucléolos estavam profundamente corados, claros e centrados, e os núcleos não estavam corados. A morfologia celular do grupo veículo é semelhante à do grupo controle. A contagem de células mostrou que o número de neurônios piramidais normais na área CA1 do grupo de administração aumentou (P<0.05); the="" difference="" between="" the="" medium="" and="" high="" dose="" groups="" was="" not="" statistically="" significant="" (p="">0.05), the number of normal pyramidal neurons To a certain extent, it shows an upward trend with increasing dose. There was no significant difference in the number of normal pyramidal cells between the vehicle group and the control group (P>0.05). Consulte a Tabela 1.
Tabela 1 Efeito dos glicosídeos de Cistanche na coloração de Nis do hipocampo de camundongo SAMP8, contagem de células piramidais normais e número de espinhas dendríticas (pcs)
a é comparado com o grupo controle t=0.193, P=0.582; b é comparado com o grupo controle t=13.621, P=0.008; c é comparado com o grupo de controle t=21.798 , P=0.005; d é comparado com o grupo controle t=18.326, P=0.006; e é comparado com o grupo controle t=0.244, P=0.463; f é comparado com o grupo controle Comparado com t=10.903, P=0.010; g é comparado com o grupo controle t=21.817, P=0.005; h é comparado com o grupo controle t=15.572, P=0. 007.
2.2 Oefeito dos glicosídeos totais decistache sobre a densidade de espinhos dendríticos em camundongos SAMP8 A coloração de Golgi mostrou que o número de espinhos dendríticos no grupo controle diminuiu e a densidade diminuiu. Após a administração de GCs aos animais, o número e a densidade de espinhos dendríticos aumentaram, e um grande número de saliências foi visto (P=0.048). Não houve diferença estatisticamente significativa entre o grupo de dose média e o grupo de alta dose (P=0.853). O número e densidade da espinha dendrítica O grau mostra uma tendência ascendente com o aumento da dose. grupo de veículos e controle
O número e densidade de espinhos dendríticos no grupo não têm significância estatística (P=0.764). Consulte a Tabela 1.
2.3 O efeito deCistancheglicosídeos na expressão de PSD-95 em camundongos SAMP8 A detecção qualitativa imuno-histoquímica de PSD-95 mostrou que o grupo controle apresentou menor expressão de PSD-95, a coloração do corpo celular foi mais clara e o taxa de expressão positiva foi menor. Após a suplementação de GCs in vitro, o corpo celular corou mais profundamente, e a expressão e a taxa positiva de PSD-95 aumentaram (t=5,751, P<0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" the="" middle-dose="" group="" and="" the="" high-dose="" group="" (t="1.077," p="">0.05). Em certa medida, a expressão de PSD-95 mostrou uma tendência ascendente com o aumento das doses. veículo
There was no statistically significant difference in PSD-95 expression between the control group and the control group (t = 0.585, P>0.05).
3 Discussão
PSD-95 é o principal componente pós-sináptico e está relacionado a uma variedade de funções sinápticas, envolvendo canais iônicos, atividade sináptica, vias de transdução de sinal intracelular, etc. [3]. PSD-95 agrupa proteínas relacionadas na via de sinalização do receptor NMDA para formar um complexo molécula-alvo molécula reguladora de sinalização receptora [4], que desempenha um papel fundamental na via de transdução de sinal. Os receptores NMDA estão envolvidos na indução da potenciação de longo prazo (LTP) na região CA1 do hipocampo e no processo de aprendizagem e memória [5]. A PSD{10}} desempenha um papel regulador fundamental nesse processo, e seu conteúdo de proteína pode ser usado como outro marcador molecular para medir a plasticidade sináptica. Em nossos estudos anteriores, provamos que os GCs(glicosídeos decistache)pode melhorar o aprendizado e o comprometimento cognitivo em camundongos SAMP8, mas não esclarecemos seu possível mecanismo morfológico celular. Este experimento visa estudar seu possível mecanismo morfológico celular.
Neste experimento, a melhora da taxa de sobrevivência das células piramidais e plasticidade sináptica nos GCs(glicosídeos decistache)foi melhor que o grupo veículo e o grupo controle. Pode-se observar que os GCs melhoraram a morfologia das células piramidais de forma mais significativa. Os resultados experimentais mostram que doses mais altas de GCs podem exercer um melhor efeito. A partir da comparação entre o grupo de dose média e o grupo de dose alta, pode-se observar que o efeito não muda significativamente quando a dose atinge uma determinada concentração. Portanto, para evitar desperdício e efeitos colaterais dos GCs ao usar GCs, a concentração mais adequada deve ser selecionada [6].
Estudos anteriores mostraram que os GCs(glicosídeos decistache)pode melhorar o aprendizado e o comprometimento cognitivo de camundongos SAMP8, melhorando a taxa de sobrevivência das células piramidais [7]. Há também dados que indicam que os GCs podem melhorar as doenças neurodegenerativas, promovendo a proliferação e diferenciação de células-tronco neurais [8-10]. O autor acredita que o mecanismo dos GCs para melhorar a DA pode ser alcançado melhorando a plasticidade da morfologia sináptica e mantendo o número de células piramidais, o que estabelece as bases para o uso final dos GCs na prevenção e tratamento da DA clínica.
Referências
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