O leitor RNA M6 A YTHDF2 controla a imunidade antitumoral e antiviral de células NK, parte 3

YTHDF2 é necessário para sobrevivência, proliferação e funções efetoras de células NK mediadas por IL-15

IL-15 é uma das, senão a mais importante citocina para as funções pleiotrópicas das células NK. Nós e outros descobrimos anteriormente que IL-15 desempenha papéis importantes na regulação da homeostase, sobrevivência e funções efetoras das células NK (Becknell e Caligiuri, 2005; Carsonet al., 1997; Carson et al., 1994; Wang et al., 2019b; Yu et al., 2013).

A pleiotropia das células refere-se à sua capacidade de desempenhar diferentes funções em diferentes ambientes. A pleiotropia celular está intimamente relacionada à imunidade porque muitas células do sistema imunológico podem desempenhar uma variedade de funções diferentes.

No sistema imunológico, as células T são um tipo de célula muito crítico. Eles reconhecem e atacam patógenos, ao mesmo tempo que regulam a atividade de outras células do sistema imunológico. A pleiotropia das células T é muito importante porque quando o sistema imunológico encontra um novo patógeno, as células T precisam desempenhar papéis diferentes em um curto período para responder de forma eficaz. Por exemplo, quando o sistema imunológico encontra uma infecção bacteriana, as células T precisam desempenhar o papel de matar bactérias, e quando o sistema imunológico encontra uma infecção viral, as células T precisam desempenhar o papel de regular outras células imunológicas.

Além disso, no sistema imunológico, uma classe de células chamadas macrófagos também apresenta efeitos pleiotrópicos. Eles podem fagocitar e decompor patógenos estranhos e também podem ativar outras células do sistema imunológico para atacar patógenos. A pleiotropia dos macrófagos é importante porque eles precisam desempenhar diferentes funções em diferentes ambientes. Por exemplo, nas infecções virais, os macrófagos precisam secretar algumas substâncias para combater o vírus, enquanto nas infecções bacterianas, os macrófagos precisam engolir e digerir as bactérias para eliminar o patógeno.

Em resumo, existe uma estreita relação entre pleiotropia celular e imunidade. As células pleiotrópicas podem desempenhar diferentes papéis em ambientes infectados por diferentes patógenos, aumentando assim a capacidade do sistema imunológico de responder e melhorando a imunidade do corpo a vários patógenos. Portanto, devemos estar atentos à pleiotropia das células e também fortalecer o cultivo da imunidade para manter a saúde humana. Percebe-se que precisamos melhorar a memória, e a Cistanche deserticola pode melhorar significativamente a memória, pois a Cistanche deserticola também pode regular o equilíbrio dos neurotransmissores, como aumentar os níveis de acetilcolina e fatores de crescimento. Estas substâncias são muito importantes para a memória e a aprendizagem. Além disso, a Cistanche deserticola também pode melhorar o fluxo sanguíneo e promover o fornecimento de oxigênio, o que pode garantir que o cérebro receba nutrientes e energia suficientes, melhorando assim a vitalidade e a resistência do cérebro.

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No presente estudo, mostramos que IL -15 regulou positivamente os níveis de mRNA e proteína de YTHDF2 em células NK (Fig. 6 A; e Fig. 1, D – F). Portanto, especulamos que o YTHDF2 é necessário para a sobrevivência mediada por IL-15 e funções efetoras das células NK.

Primeiro tentamos identificar potenciais fatores de transcrição a jusante da sinalização IL-15 que regulam diretamente a expressão de YTHDF2. Analisamos a Enciclopédia de Elementos de DNA usando o Genome BrowserDatabase da Universidade da Califórnia, Santa Cruz (//genome.ucsc.edu), que fornece previsões de locais de ligação em todo o genoma, em combinação com JASPAR (//jaspar.genereg .líquido).

Descobrimos que STAT5, que é um fator chave a jusante de IL-15 em células NK, tem quatro locais de ligação dentro de 2 kb a montante do local de início da transcrição (TSS) de Ythdf2, indicando que IL-15 pode positivamente regular a transcrição de Ythdf2 em células NK de camundongo através de STAT5.

Ao usar o inibidor STAT5 STAT5-IN-1 (Müller et al., 2008), mostramos que a inibição de STAT5 resultou em uma diminuição de Ythdf2 em ambos os níveis de mRNA e proteína em células NK murinas (Fig. S4, A e B). Para confirmar ainda que YTHDF2 é um fator downstream regulado por STAT5, usamos camundongos Stat5fl/fl Ncr1-iCre (doravante denominados camundongos Stat5ΔNK), onde STAT5 é especificamente deletado em células NK de camundongo (Wiedemann et al., 2020).

Tratamos células NK esplênicas de camundongos Stat5WT e Stat5ΔNK com IL-15. Descobrimos que o YTHDF2 diminuiu substancialmente nas células NK de camundongos Stat5ΔNK em comparação com células NK de camundongos Stat5WT tanto nos níveis de RNA quanto nos níveis de proteína (Fig. 6, B e C; e Fig. S4, C e D).

O ensaio repórter da luciferase mostrou que tanto STAT5a quanto STAT5b ativaram diretamente a transcrição do gene Ythdf2 (Fig. 6, D e E). Os resultados de imunoprecipitação da cromatina (ChIP) –qPCR mostraram que o STAT5 tem um enriquecimento significativo em quatro locais acima do controle normal de IgG, indicando ligação direta em células NK de camundongo (Fig. 6 F). Juntos, nossos resultados demonstram que a expressão de YTHDF2 é regulada por STAT5 a jusante da sinalização de IL-15 em células NK.

Em seguida, nos perguntamos se as células NK deficientes em Ythdf eram deficientes em sua resposta à IL-15. Isolamos células NK esplênicas de camundongos Ythdf2ΔNK e camundongos Ythdf2WT e as cultivamos in vitro na presença de IL -15. Descobrimos que o crescimento de células NK foi significativamente diminuído em camundongos Ythdf2ΔNK em comparação com camundongos Ythdf2WT (Fig. 6 G). O ensaio de marcação CellTrace Violet (CTV) mostrou que a proliferação de células NK foi prejudicada pela deficiência de Ythdf2 (Fig. 6 H).

 A análise de distribuição do ciclo celular revelou uma fração significativamente aumentada de células NK de camundongos Ythdf2ΔNK na fase G0/G1, mas uma fração significativamente diminuída de células NK de camundongos Ythdf2ΔNK na fase S (Fig. 6 I), sugerindo que a deficiência de Ythdf2 resulta na parada da fase G0/G1 em células NK.

Além disso, houve um aumento de duas a três vezes nas células NK apoptóticas (anexina V + Sytox-Blue +/−) de camundongos Ythdf2ΔNK em comparação com aquelas de camundongos Ythdf2WT (Fig. 6 J), indicando a sobrevivência defeituosa das células NK após a perda de Ythdf2. Estes resultados sugerem que o YTHDF2 regula a capacidade de resposta das células NK à IL-15 in vitro. Como a IL-15 é mal traduzida e secretada in vivo em um estado estacionário (Corbel et al., 1996; Fehniger et al., 2001), para explorar se as células NK deficientes em Ythdf2-são defeituosas em sua resposta para IL-15 in vivo, tratamos camundongos com IL-15.

Descobrimos que células NK deficientes em Ythdf versus WT mostraram proliferação celular significativamente reduzida e aumento da apoptose celular quando camundongos foram tratados com IL -15 (Fig. 6 K; e Fig. S4, E – J). sugerem que o YTHDF2 regula a capacidade de resposta das células NK à IL-15, especialmente sob algumas condições com alto nível de IL-15. Descobrimos também que os níveis de mRNA e proteína de IFN-, granzima B e perforina foram significativamente reduzidos nas células NK Ythdf2ΔNK em comparação com as células NK Ythdf2WT em resposta a IL -15 (Fig. 6, L – N), indicando que YTHDF2 também contribui para as funções efetoras das células NK mediadas por IL-15 in vitro.

Coletivamente, nossos dados demonstram que o YTHDF2 é necessário para a sobrevivência, proliferação e funções efetoras de células NK mediadas por IL-15. Em seguida, investigamos os mecanismos a jusante pelos quais o YTHDF2 regula a sobrevivência, proliferação e função efetora de NK mediadas por IL-15. Descobrimos que as células NK de camundongos Ythdf2ΔNK e Ythdf2WT tinham níveis semelhantes dos receptores IL-15 CD122 (IL-15R ) e CD132 (IL-15R c; Fig. S4 K). A sinalização de IL-15 é mediada por pelo menos três vias de sinalização a jusante em células NK: Ras – Raf – MEK – ERK, PI3K – AKT – mTOR e JAK1/3 – STAT3/5 (Mishra et al., 2014).

Para investigar qual via de sinalização é regulada por YTHDF2 em células NK, examinamos os níveis de fosforilação de ERK, AKT, S6, STAT3 e STAT5 em células NK de camundongos Ythdf2ΔNK ou camundongos Ythdf2WT após estimulação com IL -15.

Os resultados mostraram que a deficiência de Ythdf2 não afetou a fosforilação de ERK, AKT, S6 e STAT3 após estimulação de IL-15 (Fig. S4, L e M), mas inibiu significativamente a ativação de STAT5, como evidenciado pelos níveis reduzidos de fosforilação de STAT5 em Ythdf{{ 7}}células NK deficientes do que nas células NK de camundongos Ythdf2WT (Fig. 6 O), indicando que YTHDF2 é necessário para sinalização ideal de IL-15/STAT5 em células NK ativadas.

Como mostramos que STAT5 fosforilado a jusante de IL-15 se liga ao promotor de Ythdf2 (Fig. 6, D-F), e aqui demonstramos que YTHDF2 é necessário para a fosforilação ideal de STAT5, nossos dados sugerem um ciclo de feedback positivo de STAT5-YTHDF2 a jusante de IL-15 que pode controlar a sobrevivência, proliferação e funções efetoras das células NK.

A análise de todo o transcriptoma identifica Tardbp como um alvo YTHDF2 em células NK

Para abordar o mecanismo molecular pelo qual o YTHDF2 regula as células NK, primeiro realizamos o sequenciamento de RNA (seq) em células NK Ythdf2WT e Ythdf2ΔNK expandidas por IL-2. A deleção de Ythdf2 em células NK resultou em 617 genes expressos diferencialmente, incluindo 252 genes regulados positivamente e 365 genes regulados negativamente (Fig. S5 A).

A análise da ontologia genética (GO) mostrou que os genes diferencialmente expressos foram significativamente enriquecidos no ciclo celular, na divisão celular e nos processos relacionados à divisão celular, incluindo citocinese mitótica, segregação cromossômica, fuso, nucleossomo, meio do corpo e cromossomo (Fig. 7 A).

A análise de enriquecimento de conjunto de genes (GSEA) demonstrou enriquecimento significativo de alvos E2F, ponto de verificação G2 / M e conjuntos de genes característicos do fuso mitótico em células Ythdf2ΔNKNK (Fig. S5 B). Genes relacionados ao ciclo celular e à divisão celular, incluindo Aurka, Aurkb, Cdc20, Cdc25b, Cdc25c, Cdk1, E2f2 e Plk1 (Bertoli et al., 2013), foram significativamente diminuídos em células NK de camundongos Ythdf2ΔNK (Fig. 7 B ).

Genes de segregação de fusos e cromossomos, como Anln, Aspm, Birc5, Bublb, Cenpe, Esco2, Ska1, Ska3 e Tpx2 (Gorbsky, 2015) também foram significativamente regulados negativamente em células NK de camundongos Ythdf2ΔNK em comparação com células NK de camundongos Ythdf2WT (Fig. 7 C).

Além disso, genes de sobrevivência celular, incluindo Birc5 (Niu et al., 2010), Septin4 (Larisch et al., 2000) e Rffl (Yanget al., 2007), foram significativamente diminuídos em células NK de camundongos Ythdf2ΔNK (Fig. 7D). Os genes de função efetora de células NK, incluindo Klrk1, Ncr1, CD226 e Gzma (Bezman et al., 2012), também foram significativamente regulados negativamente em células NK de camundongos Ythdf2ΔNK (Fig. 7 D).

Esses dados apoiam nossos papéis caracterizados de YTHDF2 na regulação da proliferação, sobrevivência e funções efetoras de células NK. Em seguida, realizamos m6A-seq em células NK expandidas com IL-2 de camundongos Ythdf2WT e Ythdf2ΔNK. A análise de componentes principais mostrou que três réplicas biológicas de cada genótipo se agruparam (dados não mostrados), sugerindo boa repetibilidade das amostras m6A-seq.

A otimização hipergeométrica da análise de enriquecimento de motivos (HOMER) identificou o motivo de consenso m6A (GGAC), indicando o enriquecimento bem-sucedido de transcrições modificadas por m6A (Fig. 7 E). As modificações de m6A foram predominantemente localizadas em transcritos codificadores de proteínas, e os picos foram enriquecidos nas 59 regiões não traduzidas (UTR) e 39UTR, especialmente em torno dos códons de início e parada (Fig. 7 F e Fig. S5 C).

A análise de enriquecimento GO de genes com picos de m6A revelou que a maioria dos transcritos marcados com m6A em células NK foram enriquecidos em vias envolvidas no ciclo celular e na proliferação celular (Fig. S5 D).

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