O leitor RNA M6 A YTHDF2 controla a imunidade antitumoral e antiviral de células NK, parte 4

É bem conhecido que o YTHDF2 atua como um leitor de m6A, que reconhece e se liga a RNAs contendo m6A e regula a degradação dos transcritos de m6A.
Em seguida, realizamos imunoprecipitação de RNA (RIP) –seq usando o anticorpo YTHDF2 para mapear os transcritos alvo ligados por YTHDF2 em células NK. Os locais de ligação YTHDF 2- foram enriquecidos na região da sequência codificadora da proteína e 39UTR (Fig. S5, E e F).

A ligação entre leitores e memória é muito estreita. Ler é uma das melhores maneiras de melhorar nossas habilidades de memória.

Quando lemos, nosso cérebro passa por um processo complexo. À medida que digitalizamos as palavras e as transformamos em significado, nossos cérebros criam constantemente novas conexões neuronais. Essas conexões neuronais constituem nosso sistema de memória e nos ajudam a armazenar informações na memória de longo prazo.

Além disso, a leitura estimula a imaginação e a criatividade, o que também ajuda a melhorar a memória. Quando construímos imagens e cenas em nossas mentes, nossos cérebros estão ativamente envolvidos, formando mais conexões neuronais, o que fortalece nossas habilidades de memória.

Por fim, a leitura também melhora nosso foco e concentração. Quando nos concentramos na leitura, nosso cérebro se exercita constantemente, o que fortalece nossa memória.

No geral, a leitura pode ter um impacto extremamente positivo na nossa memória. Ao cultivar o hábito de ler e estimular o nosso cérebro através da leitura, podemos melhorar as nossas capacidades de memória e desfrutar de uma vida mais rica e interessante. Percebe-se que precisamos melhorar a memória, e a Cistanche deserticola pode melhorar significativamente a memória porque a Cistanche deserticola é um material medicinal tradicional chinês que tem muitos efeitos únicos, um dos quais é melhorar a memória. A eficácia da Cistanche deserticola vem dos múltiplos ingredientes ativos que contém, incluindo ácido tânico, polissacarídeos, glicosídeos flavonóides, etc.

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Identificamos 3.951 picos potenciais de ligação ao YTHDF2 de 1.290 transcritos, 426 (33%) dos quais foram detectados com enriquecimento significativo de m6A. A análise de enriquecimento GO mostrou que os 1.290 transcritos alvo de YTHDF2 foram enriquecidos em tradução de proteínas, ligação de RNA e splicing de RNA (Fig. S5 G).

Em seguida, identificamos os potenciais transcritos alvo de transcritos sobrepostos através de RNA-seq, m6A-seq e RIP-seq e descobrimos que um conjunto de 29 transcritos ligados por YTHDF2 e marcados com m6A (em células NK Ythdf2WT e Ythdf2ΔNK) foram expressos diferencialmente entre células NK de camundongos Ythdf2WT e Ythdf2ΔNK (Fig. 7 G). Entre eles, 12 transcritos foram regulados positivamente e 17 transcritos foram regulados negativamente em células NK de camundongos Ythdf2ΔNK em comparação com aqueles de células NK Ythdf2WT (Fig. 7 G).

Com base em nossa caracterização funcional de YTHDF2 e na análise GO dos dados de RNA-seq, a deficiência de Ythdf2 afeta a divisão e proliferação de células NK, possivelmente facilitando a degradação de mRNA de pontos de verificação do ciclo celular ou reguladores negativos durante a divisão celular.

Entre as 12 transcrições reguladas positivamente, foi relatado que três regulam negativamente a divisão ou proliferação celular, incluindo Mdm2 (murino duplo minuto 2 [MDM2]; Frum et al., 2009; Giono e Manfredi, 2007; Giono et al., 2017), Tardbp ( Proteína 43 de ligação ao DNA TAR [TDP43]; Ayala et al., 2008; Sanna et al., 2020) e Crebzf (fator de transcrição CREB/ATFBZIP; Hu et al., 2020; López-Mateo et al., 2012) , sugerindo que eles são os alvos potenciais das células NK do YTHDF2.

É digno de nota que os picos m6A se ajustam bem aos locais de ligação YTHDF 2- no 39UTR de Mdm2 e Tardbp e com o 59UTR dos genes Crebzf, como mostrado pelo Integrative Genomics Viewer (Fig. 7 H).

RIP usando anticorpo m6A ou YTHDF2 após qPCR confirmou que Mdm2, Tardbp e Crebzf foram de fato m6Ametilados e enriquecidos predominantemente por YTHDF2 em células NK (Fig. 7, I e J), ​​apoiando dados de m6A-seq e RIP-seq, que indicam que estes três genes são alvos potenciais de células YTHDF2 em NK.

Para investigar se o YTHDF2 regula a expressão de Mdm2, Tardbp e Crebzf através da modulação da estabilidade do mRNA, medimos a degradação do mRNA dos três alvos pela inibição da transcrição com actinomicina D em células NK de camundongos Ythdf2ΔNK e Ythdf2WT.

Os resultados mostraram que Mdm2 e Tardbp, mas não Crebzf, tiveram meias-vidas mais longas em células NK de camundongos Ythdf2ΔNK em comparação com aquelas de camundongos Ythdf2WT (Fig. 7, K-M), sugerindo que Mdm2 e Tardbparem diretamente regulados por YTHDF2 em células NK.

Usando imunotransferência, confirmamos que os níveis de proteína de MDM2 e TDP43 foram regulados positivamente em células NK de camundongos Ythdf2ΔNK (Fig. S5 H). Para confirmar ainda mais que esses dois genes são alvos funcionais de YTHDF2, usamos Mdm 2- ou Tardbp -siRNA específico para derrubar a expressão dos dois genes in vitro (Fig. S5, I e J).

Em seguida, comparamos a proliferação celular e a sobrevivência de células Ythdf2ΔNKNK com e sem knockdown de Mdm2 ou Tardbp na presença de IL -15. Os resultados mostraram que o knockdown do Tardbp poderia resgatar pelo menos parcialmente o defeito na proliferação celular e sobrevivência celular em células NK de camundongos Ythdf2ΔNK (Fig. 7, N e O).

No entanto, o knockdown do Mdm2 não teve efeitos de resgate (Fig. S5, K e L). Estes resultados indicam que o YTHDF2 regula a proliferação e divisão de células NK, pelo menos parcialmente, inibindo a estabilidade do mRNA do Tardbp.

Discussão

Neste estudo, relatamos os papéis multifacetados da metilação de m6A mediada por YTHDF2-na imunidade de células NK. Descobrimos que o YTHDF2, um dos leitores mais importantes das modificações do m6A, é crítico para manter a homeostase das células NK, a maturação, a sobrevivência mediada pela IL-15 e a atividade antitumoral e antiviral.

Também identificamos um novo ciclo de feedback positivo entre STAT5 e YTHDF2, a jusante de IL-15, que contribui para funções efetoras e sobrevivência em células NK de camundongos. Nosso estudo elucida os papéis biológicos da metilação de YTHDF2 ou m6A em geral na imunidade inata das células NK. Ele preenche a lacuna de conhecimento sobre como o YTHDF2 regula a resposta imunológica inata à transformação maligna e à infecção viral.

Nossas descobertas fornecem uma nova direção para aproveitar a imunidade antitumoral das células NK e, simultaneamente, avançar nossa compreensão das modificações do m6A na formação da imunidade inata. A proteína leitora m6A YTHDF2 regula a estabilidade dos mRNAs alvo (Du et al., 2016; Wang et al., 2014). Numerosos estudos apoiaram o amplo impacto do YTHDF2 em vários processos biológicos.

YTHDF2 suprime a expansão normal das células-tronco hematopoiéticas e a auto-renovação, mas também é necessária para a manutenção das células-tronco hematopoiéticas a longo prazo (Li et al., 2018; Mapperley et al., 2021 Paris et al., 2019; Wang et al., 2018a). Recentemente, este gene está envolvido na contenção da inflamação durante a infecção bacteriana (Wu et al., 2020a). O papel e o mecanismo do YTHDF2 no desenvolvimento do tumor foram bem estudados.

YTHDF2 promove o desenvolvimento de células-tronco leucêmicas e o início da leucemia mieloide aguda (Paris et al., 2019). Além da leucemia, foi demonstrado que o YTHDF2 promove o desenvolvimento de tumores sólidos, incluindo câncer de próstata (Liet al., 2020), glioblastoma (Dixit et al., 2021) e carcinoma hepatocelular (Chen et al., 2018; Hou et al., 2019; Zhang et al., 2020), visando diversos transcritos modificados por m6A, como supressores de tumor LHPP e NKX3-1 (Li et al., 2020), IGFBP3 (Dixit et al., 2021), OCT4 ( Zhang et al., 2020) e SOCS2 (Chenet al., 2018).

Embora o YTHDF2 desempenhe um papel promotor na progressão do tumor, nosso estudo revela um papel benéfico do YTHDF2 na resposta imunológica às células tumorais, particularmente nas células NK, que é um componente chave da imunidade inata contra infecções virais e transformação maligna.

Portanto, o desenvolvimento futuro de inibidores de YTHDF2 para atingir células tumorais para terapia de câncer deve ser realizado com cautela, pois a inibição de YTHDF2 pode prejudicar a resposta antitumoral do hospedeiro pelas células NK. Por outro lado, o aproveitamento da atividade antitumoral do YTHDF2 em células NK ou outras células do sistema imunológico deve considerar seu efeito potencial atuando diretamente nas células tumorais. O direcionamento diferencial de YTHDF2 em células tumorais e células imunes deve maximizar a atividade antitumoral.

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