O caminho para o progresso dos estudos pré-clínicos de doenças neurodegenerativas relacionadas à idade: uma perspectiva sobre modelos derivados de roedores e HiPSC, parte 4

Modelos in vitro de DP derivados de hiPSC também têm sido altamente informativos na elucidação da progressão fisiopatológica ligada a mutações familiares de DP em modelos neuronais hiPSC DA derivados de pacientes.

A DP é uma doença neurodegenerativa que geralmente tem certo impacto na memória e na capacidade cognitiva do paciente. No entanto, com o avanço contínuo da medicina moderna, podemos adotar vários métodos para ajudar os pacientes a manter uma boa memória.

Primeiro, o exercício regular pode melhorar a capacidade cognitiva e a memória dos pacientes com DP. O exercício pode promover a circulação sanguínea e a nutrição cerebral das células nervosas do cérebro, o que ajuda a manter a conexão e a coordenação entre várias partes do cérebro, melhorando assim o nível cognitivo geral.

Em segundo lugar, a dieta também é a chave para melhorar a memória dos pacientes com DP. Uma dieta rica em fibras, pobre em gorduras e com baixo teor de colesterol é a chave para manter a saúde do cérebro. Esta dieta pode promover a circulação sanguínea no cérebro e fornecer nutrientes saudáveis, que podem proteger os neurônios e retardar a progressão da DP.

Finalmente, uma atitude positiva e um descanso adequado também são a chave para melhorar a memória dos pacientes com DP. Embora a DP traga um certo golpe para o corpo e a mente, se você conseguir manter uma atitude otimista e descansar um pouco, poderá aliviar o estresse mental e psicológico e manter melhor sua memória.

Em suma, embora a DP tenha impacto na memória, isso não significa que não possamos fazer alterações. Através de exercícios adequados, dieta alimentar e manejo psicológico, os pacientes com DP podem manter um certo nível de capacidade cognitiva e memória. Percebe-se que precisamos melhorar a memória, e Cistanche pode melhorar significativamente a memória, porque Cistanche é um material medicinal tradicional chinês com muitos efeitos únicos, um dos quais é melhorar a memória. O efeito do Cistanche vem dos vários ingredientes ativos que contém, incluindo ácido tânico, polissacarídeos, glicosídeos flavonóides, etc.

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Por exemplo, neurônios derivados de hiPSC de um paciente com a mutação LRRK2 GS2019S exibiram fenótipos celulares relacionados à doença, incluindo maior vulnerabilidade ao estresse oxidativo170 e diminuição do comprimento e número de neuritos.171

Outros exemplos incluem neurônios DA derivados de hiPSC obtidos de pacientes que possuem a mutação PARK2 que exibiam disfunção mitocondrial e morfologia de estresse oxidativo172 e neurônios derivados de hiPSC com a mutação A53T e a triplicação SNCA que exibem elevação marcante e acúmulo de agregados a-syn.173

Além disso, vários estudos melhoraram esses fenótipos de doenças por meio de intervenções destinadas a corrigir o gene mutado, incluindo LRRK2, 174 PINK1, 175 SNCA, 140, 176 e GBA1.177 Esses modelos demonstram a utilidade da tecnologia hiPSC na identificação e validação de novos alvos de medicamentos e fornecem prova de conceito para abordagens de terapia genética.

Desde então, modelos derivados de hiPSC para diferentes NDDs foram expandidos para uma variedade de diferentes configurações 2D e 3D de co-cultura, ampliando a modularidade e o potencial de pesquisa básica e aplicações pré-clínicas.

Configurações atuais de modelos NDD derivados de hiPSC2D modelos de células únicas e de co-cultura

Uma quantidade significativa de trabalho utilizando culturas 2D compostas por tipos de células singulares derivadas de hiPSC foi publicada na última década. Esses modelos de tipo de célula única foram informativos na descoberta do papel de populações de células individuais em NDDs, como atrofia muscular espinhal,178.179 DA, DP e esclerose amiolateral (ELA)180 (Figura 1) e, além disso, permitiram uma maior compreensão de como os genes associados a doenças atuam no nível biológico para afetar perturbações celulares.

Modelos celulares hiPSC foram recrutados na pesquisa da DA para compreender melhor o papel dos polimorfismos e mutações genéticas em populações de células individuais e como estes podem contribuir ou impactar a doença. Em um modelo AD baseado em hiPSC, Kondo et al.181

observaram aumento do acúmulo de oligômeros Ab ligado ao aumento da disfunção do retículo endoplasmático e estresse oxidativo em neurônios e astrócitos derivados de hiPSC obtidos de pacientes com sAD e fAD contendo a mutação APP E693D. Modelos individuais 2D derivados de hiPSC também demonstraram grande valor no estudo das contribuições genéticas do APOEε4, o maior e mais replicável fator de risco genético da DA, em uma variedade de modelos de células neurais.182

Lin e colegas usaram culturas 2D para descobrir que astrócitos APOEε4 isogênicos derivados de hiPSC exibem mudanças em grande escala na expressão gênica relativas ao acúmulo de colesterol e internalização de Ab42, sendo que ambas são funções homeostáticas críticas dos astrócitos, em relação às células APOEε3 isogênicas. Além disso, os astrócitos ε4 isogênicos mostraram uma capacidade reduzida de expressar e secretar APOE, resultando em diminuição da lipídios.

O aumento do crescimento de neurites em comprimento e número de neurônios, além da secreção aumentada de Ab, neurônios APOEε4 inisogênicos também foram considerados uma contribuição patogênica nesses modelos.183

Ao gerar culturas de astrócitos obtidas de indivíduos neurotípicos isogênicos para os alelos APOEε3 e APOEε4, Zhao et al.161 descobriram que os astrócitos APOEε4 exibiam um status de lipidação APOE mais baixo em comparação com os controles APOEε3 saudáveis, destacando ainda mais o conhecimento obtido com tais modelos.

O uso de coculturas 2D também permitiu o estudo da APOEε4 no contexto de populações celulares individuais e interações célula-célula e como estas podem contribuir para a patogênese da DA.

Estendendo-se ao experimento acima, ao co-cultivar astrócitos APOEε4 derivados de hiPSC com neurônios, a integridade morfológica e funcional dos neurônios foi comprometida e demonstrou inibição da maturação em comparação com seus controles isogênicos ε3.161

A interação entre diferentes células neuronais e gliais desempenha um papel crítico no desenvolvimento e progressão da DA e DP, aproveitando assim a tecnologia hiPSC para estabelecer modelos in vitro que imitam as interações célula-célula, e o microambiente celular provou ser altamente informativo.

O benefício dos modelos 2D singulares e de co-cultura foi igualmente realizado no estudo da contribuição de várias mutações causadoras de DP para fenótipos celulares relacionados a doenças, como diminuição da viabilidade celular e disfunção mitocondrial.

Isso foi demonstrado pela primeira vez em um estudo de Nguyen et al.,170 que mostrou que modelos neuronais hiPSC derivados de pacientes com DP com a mutação LRRK2 G2019S mostraram níveis aumentados de a-syn, regulação positiva de genes envolvidos na resposta ao estresse oxidativo, bem como aumento da suscetibilidade ao H2O{{ 6}}induziu estresse oxidativo e morte celular.

Da mesma forma, Sánchez-Danés et al.171 avaliaram alterações na autofagia em neurônios DA derivados de hiPSCs de pacientes com DP sem a mutação LRRK2 G2019S e observaram elevação de a-syn e disfunção autofágica.

Uma maior compreensão de como as interações celulares sustentam a fisiopatologia foi alcançada com sistemas modelo de cocultura derivados de hiPSC. Por exemplo, foi demonstrado que astrócitos derivados de hiPSC exercem um benefício protetor em células progenitoras neurais (NPCs) cocultivadas obtidas de pacientes com DP após exposição às toxinas mitocondriais, rotenona e cianeto de potássio, demonstrado pelo resgate de déficits de diferenciação e disfunção mitocondrial.184

Outro estudo utilizou coculturas de neurônios-astrócitos para investigar o impacto da mutação LRRK2G2019S causadora de PD na diafonia entre neurônios-astrócitos. Os autores relataram que a cocultura de neurônios DA derivados de hiPSC de controle com astrócitos derivados de pacientes portadores da mutação G2019S induziu neurodegeneração e acúmulo de a-syn nos neurônios DA.185

Este estudo exemplificou a utilidade de co-culturas no exame de diferentes combinações da variante/mutação genética por tipos de células para descobrir a interação célula-célula e o(s) tipo(s) de células que exercem o efeito patogênico de variantes associadas à doença.

No entanto, as co-culturas 2D formam um microambiente para interações entre diferentes tipos de células cerebrais e ainda são inatamente limitadas na sua capacidade de modelar a complexidade do cérebro como um tecido tridimensional e, como tal, possuem obstruções inerentes na relevância da tradução.

Modelos 3D derivados de hiPSC

As tecnologias emergentes permitiram que os pesquisadores começassem a gerar e avaliar modelos 3D de NDDs derivados de hiPSC, incluindo coculturas e organoides, que são bioquímica e fisiologicamente robustos. Os modelos organoides do cérebro humano em 3D têm como objetivo capturar a complexa organização espacial do cérebro humano o mais próximo possível em um modelo in vitro.

Obtidos de hiPSCs, esses organoides cerebrais são auto-organizados e autopadronizados em 3D. Além de suas assinaturas epigenômicas e transcricionais gerais,186.187 as propriedades fisiológicas dos modelos organoides 3D, como a resposta neuronal ao glutamato, a sinalização instintiva de Ca2+ e o desenvolvimento de fenótipos de maturação celular, também demonstraram espelhar de perto o tecido cerebral humano .188–190

Estudos recentes geraram e caracterizaram modelos derivados de hiPSC 3D de AD e PD, que demonstraram exibir características patológicas de maneira altamente reprodutível.

Por exemplo, Gonzalez et al.191 desenvolveram um modelo organoide ADbrain que exibia acúmulo progressivo do peptídeo Ab com estruturas semelhantes a placas e propriedades amiloidogênicas, bem como o aparecimento de tau e NFTs fosforilados.

Linet al.183 expandiu essas descobertas através da introdução de APOEε isogênico 3- ou APOEε 4- transportando células semelhantes a microglia em organoides cerebrais previamente estabelecidos cultivados a partir de hiPSCs contendo a mutação de duplicação de APP associada a AD e observou um processo de formação significativamente longo nas células semelhantes à microglia APOEε4 em comparação com os controles APOEε3, sugerindo uma capacidade limitada nas capacidades sensoriais e responsivas ao Ab extracelular.

Mais recentemente, Zhao et al.192 geraram modelos organoides cerebrais usando hiPSCs derivados de pacientes com DA e controles saudáveis ​​portadores de diferentes genótipos de APOE. O modelo organoide APOEε4 exibiu fenótipos relacionados à doença em comparação com o organoide APOEε3 derivado de um doador diferente e o modelo organoide isogênico APOEε3 criado pela edição do genoma da linha APOEε4.

O efeito adverso do genótipo APOEε4 no modelo organoide recapitulou as principais características patológicas da DA, incluindo perda na integridade sináptica, morte celular apoptótica, acúmulo de Ab e tau fosforilada e níveis elevados de APOE solúvel, demonstrando assim a adequação do sistema para modelar não-fAD.

Além disso, esses resultados fornecem suporte adicional para o papel patogênico do APOEε4 na DA e seu potencial como um alvo drogado para a DA.192 Da mesma forma, Smitset al.193 gerou um modelo organoide DA funcional do mesencéfalo de PD derivado de tecido de paciente com DP contendo a mutação LRRK GS2019.

Este modelo organoide produziu e secretou DA e exibiu com sucesso patologias características associadas em organoides, como diminuição da quantidade e complexidade dos neurônios DA do mesencéfalo. No entanto, uma abordagem GT corrigindo a mutação LRRK foi insuficiente para a melhoria dos fenótipos da doença neste modelo.

Bologninet al.194 também estabeleceu um modelo neuronal 3D DA derivado de um paciente com DP com a mutação LRRK2 G2019S, que exibiu sinais de disfunção mitocondrial e morfologia alterada, diminuição da diferenciação DA e complexidade de ramificação e elevação da morte celular prematura em neurônios jovens quando comparados com linhas de controle isogênicas; algumas dessas perturbações foram resgatadas pela administração do inibidor LRRK2 2 (Inh2).

No entanto, é importante observar as diversas limitações que foram relatadas no uso de modelos organoides 3D, particularmente no que diz respeito à forma espontânea e descontrolada de crescimento e diferenciação celular que contribui para a variabilidade interexperimental.

A dependência da automontagem espontânea em modelos organoides pode levar à variação de modelo para modelo, incluindo proporções celulares heterogêneas, orientação espacial e fenótipo de doença, tornando a reprodutibilidade uma preocupação proeminente em cocultura 3D e modelos organoides.195

Avanços recentes estão, no entanto, mostrando melhorias na reprodutibilidade em modelos organoides 3D,196 a variabilidade nas identidades das células terminais permanece,195 e prevê-se um progresso contínuo.

Sistemas de Cocultura. Avanços biotecnológicos recentes permitiram a geração de estruturas tridimensionais sofisticadas que permitem que células derivadas de hiPSC cresçam em modelos baseados em co-cultura, o que facilita uma abordagem mais controlada em comparação com os organoides discutidos acima, particularmente no que diz respeito ao tipo de célula, maturação, composição e exposição homogênea das células.197

Os modelos existentes baseados em cocultura incluem modelos de neurônios motores e junção neuromuscular derivados de pacientes com ELA; 180 neurônios DA de pacientes com DP com mutações conhecidas (por exemplo, LRRK2194); modelos tricelulares de neurônios, astrócitos e micróglia modelando o ambiente neuroinflamatório da DA;198 e tecido muscular esquelético.199

Esses modelos fornecem aos pesquisadores ferramentas aprimoradas para investigar o papel da organização espacial do tecido - conexões célula-célula e célula-matriz, que desempenham um papel importante na patogênese do NDD. Um estudo recente de Blanchard et al.200 construiu um modelo de cocultura 3D derivado de hiPSC do BBB composto por células endoteliais cerebrais, astrócitos e pericitos para modelar patologias relacionadas à doença vascular com alta fidelidade.

Este modelo 3D revelou um papel fundamental dos pericitos nas células derivadas de APOEε4-, que exibiram elevado acúmulo de BBB de peptídeos Ab e fibrila amilóide como resultado do aumento da sinalização de pericitos NFAT-calcineurina.

200 Park et al.198 também desenvolveram um modelo de tricultura AD hiPSC 3D composto por neurônios, astrócitos e microglia em uma plataforma microfluídica, que recapitula com sucesso características marcantes da AD, incluindo acúmulo de tau fosforilado de agregados Ab, bem como características neuroinflamatórias, como recrutamento microglial, liberação de óxido nítrico e subsequente estresse oxidativo.

Embora os sistemas de co-cultura 3D visem superar as limitações acima mencionadas observadas nos modelos organoides, eles também apresentam retrocessos. Os modelos atuais derivados de hiPSC geram redes neuronais que carecem de características críticas do tecido cerebral que pretendem representar, incluindo a falta de vascularização e circulação necessária de nutrientes e remoção de resíduos metabólicos,201 e uma variabilidade na geração de proporções biologicamente representativas de células neuronais e gliais. populações, características que são pontos fortes discutíveis no uso de culturas organoides 3D.

Além disso, os modelos de cocultura 3D requerem estruturas artificiais e semeadura sequencial de células, enquanto os modelos organoides se desenvolvem de forma mais “natural”. No entanto, o uso de coculturas derivadas de hiPSC não só permite aos pesquisadores investigar o papel ativo de cada tipo de célula na geração de características da doença de DA e DP, mas também a interação de células derivadas de diferentes genótipos, destacando o kit de ferramentas revolucionário que as hiPSCs representam em estudo molecular de NDDs.

As vantagens e limitações dos modelos in vitro baseados em hiPSC são exploradas com mais detalhes na seção seguinte.

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