Abstrato:O objetivo principal do presente estudo é estimar, por meio de análise diferencial, várias atividades biológicas do teor de fenólicos totais em extratos alcoólicos de três variedades de tamareiras sensíveis ou resistentes a Fusarium oxysporum. sp Albidinis. Aqui, produtos de estilbeno com capacidades antioxidantes e bioativas foram evidenciados na variedade resistente Taabdount (TAAR). Além disso, a fração metanólica da variedade de tamareira resistente a TAAR contém um produto significativo, determinado por LCMS/MS e 1H, 13C NMR, pertencente à família dos hidroxiestilbenos, que exibe capacidades antioxidantes, inibe a atividade da tirosinase de cogumelos e ativa e exerce um efeito protetor sobre o dano induzido por hipoclorito no proteassoma 20S de células envelhecidas de fibroblastos dérmicos humanos. Em conjunto, os presentes resultados indicam que o hidroxitolueno presente em Phoenix dactylifera L. resistente deve ser estudado para entender a maneira como o estilbeno pode exercer a capacidade antienvelhecimento.

O glicosídeo de cistanche também pode aumentar a atividade de SOD nos tecidos do coração e do fígado e reduzir significativamente o conteúdo de lipofuscina e MDA em cada tecido, eliminando efetivamente vários radicais reativos de oxigênio (OH-, H₂O₂, etc.) e protegendo contra danos ao DNA causados por radicais OH. Os glicosídeos feniletanóides cistanche têm uma forte capacidade de eliminação de radicais livres, uma capacidade redutora maior do que a vitamina C, melhoram a atividade de SOD na suspensão de esperma, reduzem o conteúdo de MDA e têm um certo efeito protetor na função da membrana espermática. Os polissacarídeos Cistanche podem aumentar a atividade de SOD e GSH-Px em eritrócitos e tecidos pulmonares de camundongos experimentalmente senescentes causados ​​por D-galactose, bem como reduzir o conteúdo de MDA e colágeno no pulmão e no plasma e aumentar o conteúdo de elastina, têm um bom efeito de eliminação no DPPH, prolongar o tempo de hipóxia em camundongos senescentes, melhorar a atividade de SOD no soro e retardar a degeneração fisiológica do pulmão em camundongos experimentalmente senescentes Com degeneração morfológica celular, experimentos mostraram que Cistanche tem boa capacidade antioxidante e tem potencial para ser um medicamento para prevenir e tratar doenças de envelhecimento da pele. Ao mesmo tempo, o echinacoside em Cistanche tem uma capacidade significativa de eliminar os radicais livres DPPH e tem a capacidade de eliminar espécies reativas de oxigênio e prevenir a degradação do colágeno induzida por radicais livres, e também tem um bom efeito de reparo nos danos causados ​​pelos radicais livres da timina.

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Palavras-chave:Phoenix dactylifera L.; Fusarium oxysporum. sp Albidinis (FoA); atividades antioxidantes; atividade antitirosinase; ativação do proteassoma; análise LC-MS/MS; derivados de estilbeno

1. Introdução

A tamareira (Phoenix dactylifera L.) é uma monocotiledônea perene da família Arecaceae. Esta árvore é de extrema importância na vida das populações saarianas do Sul e Sudeste de Marrocos, tanto económica como socialmente. A doença de Bayoud, causada pelo fungo de solo Fusarium oxysporum f. sp Albidinis (FoA) [1], reduziu significativamente a produção de tamareiras marroquinas nos últimos anos [2]. Estima-se que o FoA tenha desaparecido de dois terços da herança fenícia marroquina, mas continua a destruir entre 4,5% e 12% das cultivares comerciais de tamareiras de alta qualidade [2]. Muitos esforços têm sido feitos para combater esta doença e expor alguns mecanismos de defesa da tamareira [3]. Os primeiros estudos sobre os possíveis mecanismos de defesa da tamareira destacaram o papel dos compostos fenólicos e da capacidade antioxidante na tolerância ao FoA [4,5]. A análise bioquímica de cultivares de compostos fenólicos de raízes resistentes e sensíveis foi o primeiro estudo bioquímico que elucidou o benefício dos mecanismos de defesa da tamareira. De fato, a literatura indica que as cultivares de raízes resistentes são mais ricas em 5-ácido cafeoil-chiquímico e seus isômeros de posição do que as cultivares de raízes sensíveis [5]. Esses compostos mostraram efetivamente uma potencial atividade antifúngica in vitro contra FoA [6].

A grande capacidade dos antioxidantes naturais de eliminar os radicais livres é o que está impulsionando sua crescente popularidade em estudos médicos e de alimentos [7-10].

Por exemplo, espécies reativas de oxigênio são fatores agravantes em lesões celulares e processos de envelhecimento [11] e, portanto, estão ligados a muitas doenças. Como resultado, as moléculas antioxidantes podem ajudar a saúde humana, prevenindo doenças degenerativas e retardando as consequências do envelhecimento [12]. Neste estudo, estamos interessados ​​na capacidade dos antioxidantes de promover a ativação do 20S-proteassoma e proteger contra o dano oxidativo do mesmo. O proteassoma, de fato, contribui para a manutenção da homeostase celular, permitindo o processo de depuração da célula de proteínas danificadas e a destruição controlada de proteínas de vida curta [13]. Portanto, ativar o proteassoma com antioxidantes pode ser uma nova estratégia antienvelhecimento [14]. Além disso, este trabalho pretende explorar o potencial do conteúdo fenólico de raízes resistentes a FoA como compostos biológicos ativos.

2. Materiais e métodos

2.1. Amostra de planta

O estudo foi conduzido para cada amostra com material de 10 cultivares de tamareiras adultas (Phoenix dactylifera L.) cultivadas em parcelas contaminadas ou não contaminadas localizadas em Palmaria Figuig, sudeste do Marrocos. As raízes principais (incluindo as raízes respiratórias) têm diâmetro de 0,5 a 2 cm de variedades suscetíveis, como charas Bouffegous infectadas (BI) ou não infectadas (BNI). Além disso, o cultivar de Taabdount resistente a FoA (TAAR) foi coletado, e as folhas de duas plantas medicinais foram usadas localmente como um tratamento filático contra FoA. Além disso, alecrim (R, Rosmarinus officinalis) e romã (G, Punica granatum L.) [15] também foram coletados na mesma parcela não contaminada em que foram analisados ​​e usados ​​como controle. As coletas foram realizadas em dois períodos do ano, em setembro e final de janeiro (entre 2013 e 2015), e armazenadas hermeticamente em temperatura ambiente. Como as amostras foram adquiridas a um palmeiro, encontram-se devidamente certificadas (identificação e classificação) pelo Ministro da Agricultura de Marrocos [16].

2.2. Preparação dos Extratos

Após uma extensa lavagem com água, as raízes ou folhas eram secas à sombra e trituradas no liquidificador. Para cada amostra (BI, BNI, TAAR, R e G), 10 mL de metanol foram adicionados a 1 g de material seco e depois deixados em agitação por 4 h à temperatura ambiente. Em seguida, foram filtradas e evaporadas a 37 ◦C por rotary-vap. O extrato seco foi colocado em solução de metanol na concentração final de 10 mg/mL ou 50 mg/mL (posteriormente utilizado para avaliar atividades biológicas in vitro). Três extrações independentes para cada amostra foram realizadas para os ensaios de atividade biológica.

2.3. Atividades Biológicas

2.3.1. Conteúdo fenólico e atividades antioxidantes

O procedimento descrito por Nacoulma et al. foi aplicado para avaliar o teor de fenólicos totais e flavonoides totais de cada extrato [17], com uma adaptação final de volumes em 200 µL para serem usados ​​em um leitor de microplacas. A absorbância em 760 nm e 510 nm, respectivamente, foi determinada contra um branco de metanol. Curvas de calibração padrão de ácido gálico (0–300 mg/L) (y=0.0083x mais 0,9106, r2=0.978) e quercetina (0–100 mg/L) (y {{14 }},0008x mais 0,0597, r2=0,994), respectivamente, foram usados.

Utilizando o radical livre 1,1-difenil-2-picrilhidrazil, a atividade de eliminação de antioxidantes foi investigada (DPPH). Utilizando uma adaptação final de volumes de 300 µL e 275 µL, respectivamente, para empregar um leitor de microplacas, avaliou-se a capacidade dos extratos em diminuir o ferro (III), conforme descrito por Nacoulma et al. [17]. Em comparação com um branco de metanol, a absorbância foi medida em 517 nm e 700 nm, respectivamente. Então, usando a seguinte equação, a atividade de eliminação de radicais livres de cada solução foi estimada como uma porcentagem de inibição:

Uma curva de calibração padrão foi obtida usando ácido ascórbico ({{0}}–100 mg/L) como padrão antioxidante (y=0.0014x mais 0,0875, r2=0.998).

2.3.2. Ensaio de Inibição do Crescimento de FoAMyc hélio

Com uma pequena modificação, o método descrito por Neri et al. [18] foi usado para determinar o grau em que os produtos químicos puros inibiram o crescimento do micélio FoA. Uma cultura de FoA com 7-dia tinha cinco milímetros de discos de micélio colocados em placas de Petri com meio BDA suplementado com os produtos químicos puros listados acima em 50, 75 e 100 µg/mL. As placas foram incubadas por 5 dias a 28 ◦C. O diâmetro médio da colônia medido em dois ângulos retos foi usado para avaliar a inibição do crescimento do micélio FoA. Cada tratamento consistiu em três testes usando três cepas diferentes de FoA: FoA 41818, FoA 41814 (BCCM, Bélgica) e FoA Local (Palemeraie de Figuig, Marrocos), além de um controle negativo usando um meio que não foi adicionado.

2.3.3. Viabilidade celular e atividade de proteassoma 20S

Fibroblastos dérmicos humanos normais de um homem de {{0}}anos de idade (NHDF) (Promocell, Heidelberg, Alemanha) foram usados ​​em que as células foram colocadas em uma densidade de 100,{{3 }} células/mL em RPMI 10 por cento suplementado com 10 por cento (p/v) de FBS, 1 por cento (p/v) de L-glutamina, 100 unidades/mL de penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina. Eles foram mantidos em placas de 96-micropoços brancos ou transparentes por 24 h a 37 ◦C em uma incubadora com um ambiente umidificado de 5 por cento de CO2. Para o ensaio da atividade do proteassoma, bem como para a avaliação dos efeitos protetores sobre os danos induzidos pelo hipoclorito, as células foram então tratadas com materiais de teste (um composto puro de 5 a 50 µg/mL, controle positivo a 0,5 e/ou 1 µM, e extratos vegetais metanólicos de 15 a 50 µg/mL) por 24 h com no máximo 0,3 por cento de DMSO na concentração final, simultaneamente, sem alterações, em relação ao controle negativo. Investigar os efeitos protetores do extrato de TAAR ou compostos puros na atividade do proteassoma significou que as células fibroblásticas foram posteriormente submetidas a 50 µM de OCl- por 35 min (selecionado como ideal, sem toxicidade celular, oxidante-inibidor da condição de proteassoma 20S) [19]. As seguintes etapas experimentais foram concluídas pela metodologia do fornecedor (Proteasome-Glo Chymotrypsin-Like Cell-Based Assay, Promega Corporation, EUA): Primeiro, um experimento de viabilidade celular concorrente empregando ensaios colorimétricos de cristal violeta ou MTT que foram realizados em condições absolutamente semelhantes foi usado para normalizar este ensaio de bioluminescência de células. Os desvios padrão e a fluorescência média em amostras triplicadas de dois testes separados (n=6) são exibidos. Todas as medições e experimentos independentes (n=2) foram realizados duas vezes.

2.3.4. Efeito inibitório na tirosinase de cogumelo livre de células

Para investigar o efeito sobre a atividade enzimática, os materiais de teste (antioxidantes puros ou extratos vegetais metanólicos) foram pré-incubados com enzimas em tampão fosfato à temperatura ambiente. Em poucas palavras, 300 mL de uma solução de L-DOPA 5 mM em tampão fosfato 50 mM (pH 6,5) com ou sem materiais de teste em várias concentrações foram adicionados a um 96-Poço microplaca juntamente com 100 mL de uma solução aquosa de tirosinase de cogumelo (20 unidades). Por 40 min, a mistura de ensaio foi incubada a 25 ◦C. Após a incubação, o nível de produção de dopacromo da mistura de reação foi medido espectrofotometricamente a 492 nm [20]. Uma curva de calibração padrão foi traçada usando ácido gálico (0–1000 µg/mL) (y=−0,087 × mais 0,45; r2=0,97). Cada medição e experimento independente (n=2) foi realizado duas vezes.

2.4. Análises, Isolamento e Procedimentos de Elucidação Estrutural

A raiz moída (20 g) foi extraída com 200 mL de metanol, agitada por 24 h à temperatura ambiente, filtrada, centrifugada a 10,000 × g por 15 min e, em seguida, evaporada a 35 ◦C usando um rotatório aparelho de evaporação a vácuo. O extrato bruto foi diluído com 20 mL de água destilada, reextraído por 2 × 20 mL de acetato de etila e, em seguida, concentrado usando um sistema de evaporação rotativa a vácuo a 35 ◦C. O produto principal foi purificado por HPLC preparativa usando uma coluna Waters C18 (SymmetryPrep 150 × 19 mm, tamanho de partícula de 7 µm) com as mesmas condições de gradiente de LC usadas acima e uma taxa de fluxo de 5 mL/min. O pico em RT foi entre 38,8 e 40,8 min, coletado entre 39,2 e 40,2 min; a coleção de volume total foi liofilizada para dar 27 mg do composto. MS e NMR 1H e 13C então o identificaram.

As análises foram realizadas com um sistema LC 1200 de resolução rápida usando um detector de matriz de diodos (DAD) usado para monitorar espectros UV em 320 nm (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA). A separação do composto foi realizada em uma coluna Beckman C18 (ULTRASPHERE 250 mm × 4,6 mm, tamanho de partícula de 5 µm) usando um gradiente de 47 min de acetato de amônio 10 mM/0,2 por cento de ácido fórmico em água (v/v), pH 2,9 ({{ 13}}solvente A) e 30/70 mistura de acetonitrila/metanol (=solvente B). A taxa de fluxo foi de 0,8 mL/min, e o solvente B foi aumentado de 5 para 35% em 45 min e reequilibrado por 2 min. Em uma série com DAD, uma série ESI-QTOF 6520 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA) foi usada para análises de MS de alta resolução e MS tandem direcionado (MS/MS). Os espectros foram adquiridos nos modos de aquisição negativo e de alta resolução (4 GHz).

Os espectros de 1H NMR e 13C NMR foram registrados em um espectrômetro Bruker Avance 300 operando a 300 MHz. Os decaimentos de indução livre foram processados ​​com o conjunto MestreNova 5.3.2 NMR da MestreLab Research SL.

2.5. Análise Estatística

Todas as experiências independentes foram realizadas em triplicado. Todos os dados foram apresentados como valores médios ± DP. Usando a versão 6 do programa GraphPad Prism, os resultados foram analisados ​​usando o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis junto com o teste de comparações múltiplas de Dunn. Valores de p 00,05 e inferiores são considerados significativos.

3 Resultados e discussão

3.1. Teor total de fenólicos e flavonoides de extratos metanólicos

Devido às suas propriedades redox, os compostos fenólicos das plantas têm uma variedade de impactos biológicos, incluindo atividade antioxidante [21]. A Tabela 1 mostra o conteúdo fenólico total de extratos de raiz de metanol (500 µg/mL) de variedades suscetíveis de ghagras Bouffegous infectadas (BI) e não infectadas (BNI) pelo FoA ou resistentes como Taabdount (TAAR). Sua concentração variou de 171 ± 14 a 253 ± 47 mg de ácido gálico eq./g. A maior quantidade desses compostos foi encontrada na variedade BNI, enquanto a menor concentração veio do extrato metanólico da raiz de BI. O número de flavonoides nesses mesmos extratos (Tabela 1) variou de 240 ± 25 a 406 ± 66 mg de quercetina eq./ge, novamente, a maior quantidade foi atribuída à variedade BNI. Há uma perda de aproximadamente 1/3 da quantidade de um número total de polifenóis e flavonóides entre variedades não infectadas (BNI) e variedades infectadas (BI) ou resistentes (TAAR) ao FoA. Portanto, é importante verificar como a perda de compostos, descritos como críticos para a capacidade antioxidante da planta, pode afetar as atividades biológicas em que estamos interessados.

3.2. Potencial Antioxidante de Extratos Metanólicos

A atividade de eliminação do radical DPPH é um método amplamente utilizado para rastrear a atividade antioxidante de extratos de plantas [22]. Este teste determina se as substâncias químicas antioxidantes encontradas nos extratos são capazes de eliminar as espécies radicais estáveis ​​DPPH. Os dados experimentais (Figura 1) revelam que todos os extratos metanólicos (a 100 ou 500 µg/mL) provavelmente têm o efeito de eliminar radicais livres com as maiores atividades de eliminação de DPPH observadas em raízes TAAR (87,0 por cento de inibição de DPPH). A atividade antioxidante parece não depender da presença da quantidade total de compostos polifenólicos ou flavonoides. No entanto, a melhor atividade dos extratos metanólicos da raiz TAAR pode ser devido a mais componentes doadores de hidrogênio contidos no extrato.

O poder redutor é avaliado pela capacidade do extrato metanólico em transformar o Fe (III) em Fe (II). Essa capacidade de reduzir o Fe (III) pode ser atribuída ao número e posição dos grupos hidroxila presentes nos compostos fenólicos e sua capacidade de doar hidrogênio [23]. A Tabela 2 mostra as atividades redutoras dos extratos metanólicos de nossas amostras de plantas em comparação com o ácido ascórbico como padrão. Os extratos metanólicos das raízes TAAR contêm altas reduções (95 ± 1 mg de ácido ascórbico eq./g), enquanto o menor teor foi obtido dos extratos de raiz BNI (27 ± 2 mg de ácido ascórbico eq./g).

Uma análise de regressão foi realizada para correlacionar os resultados obtidos (coeficiente de correlação (R)). Correlações lineares significativas foram encontradas entre o conteúdo de fenólicos totais e flavonoides (R {{0}},849, p < 0,05) e entre DPPH e ensaio de poder redutor (R=0. 816, p < 0,05), mas não houve diferença entre os teores de fenólicos ou flavonoides dos extratos metanólicos e suas atividades antioxidantes. Finalmente, todos os extratos metanólicos exibiram atividades antioxidantes significativas contra a atividade de eliminação do radical DPPH e ensaio de poder redutor, mas essas atividades antioxidantes parecem não estar relacionadas ao conteúdo total de fenólicos ou flavonoides. Portanto, essas descobertas implicam que um determinado tipo de produto químico, em vez da quantidade de compostos fenólicos ou flavonoides encontrados em nossos diversos extratos, é provavelmente responsável pela atividade antioxidante dos extratos vegetais em análise. Alguns componentes fenólicos previamente descritos e indivíduos altamente ativos também podem ter impacto na atividade antioxidante de extratos vegetais: Independentemente da sua concentração, os compostos fenólicos encontrados no vinho tinto envelhecido podem exibir várias propriedades antirradicais ligadas aos seus aspectos estruturais [ 24].

A variedade resistente a TAAR FoA mostra a maior atividade antioxidante entre as diferentes variedades de tamareiras. Referindo-se à literatura, o desenvolvimento de resistência nessas tamareiras em particular pode ser atribuído a um aumento na quantidade de diferentes isômeros posicionais do ácido cafeoil-chiquímico [5].

3.3. Atividade da Tirosinase de Cogumelo

A atividade da tirosinase difenolase do cogumelo catalisa a oxidação de dois derivados da dopaquinona levando à síntese de melanina. Os resultados apresentados na Tabela 3 mostram a capacidade dos compostos presentes nos extratos metanólicos de TAAR, BI e BNI de interferir na hidroxilação da l-DOPA através da inibição da atividade da tirosinase do cogumelo. Além disso, esses resultados mostram que o extrato metanólico de TAAR é estatisticamente mais ativo que os extratos de BI (p < 0.05) e BNI (p < 0,05) na atividade da tirosinase de cogumelo. Assim, a capacidade dos extratos de raiz de tamareira em inibir a atividade da tirosinase parece seguir a mesma tendência que as habilidades antioxidantes.

As tirosinases estão principalmente associadas à pigmentação da pele, dos olhos e do cabelo. De fato, as tirosinases são enzimas de melanogênese envolvidas nas primeiras etapas da biossíntese de melanina, e a melanina está associada à proteção contra radiação ultravioleta (UV), solar ou gama, suscetibilidade celular reduzida e resistência da parede celular contra enzimas hidrolíticas [20]. Por outro lado, uma superprodução de melanina pode desempenhar um papel em anomalias da pele ou doenças mais graves, como câncer (por exemplo, melanoma), e um excesso de dopaquinona pode levar a doenças neurodegenerativas (por exemplo, doença de Parkinson) [20,25]. Além disso, foi relatado que a melanogênese produz peróxido de hidrogênio e outras ROS, expondo os melanócitos humanos a altos níveis de estresse oxidativo [26]. Vários compostos antioxidantes naturais (fenólicos, flavonóides e outros) obtidos de plantas inibiram a atividade da tirosinase fenolase [27,28]. Aqui, o extrato de TAAR parece conter um(s) composto(s) suscetível(is) de inibir o envelhecimento da pele e a melanogênese.

3.4. Atividade proteassômica de extratos metanólicos de tamareira

Foi relatado que níveis elevados do proteassoma 20S levam ao aumento da tolerância ao estresse oxidativo [13]. Portanto, a regulação da atividade do proteassoma por extratos de raízes das cultivares BI, BNI e TAAR foi investigada. A atividade medida do proteassoma 20S está relacionada à atividade do tipo quimotripsina (CT-L) em células envelhecidas com NHDF (consulte Materiais e métodos). Conforme ilustrado na Figura 2A, as células tratadas com 50 µg/mL de extratos metanólicos por 24 h exibiram uma ativação significativa do CT-L para extratos de BI e TAAR e uma inibição para BNI sem gerar mais de 30 por cento de toxicidade celular. O extrato de raiz TAAR mostrou ativação de proteassoma envolvente em comparação com 1µM de ácido lipóico (Ct plus) (212 por cento e 248 por cento, respectivamente). O proteassoma é um complexo de proteinase cilíndrico contendo um núcleo de quatro anéis empilhados responsáveis ​​pela remoção de proteassoma anormalmente degradado (26S) e proteínas danificadas oxidativamente (complexo central proteolítico 20S) (Ciechanover, 1998). Conforme apresentado no trabalho de Hwang [29], a disfunção do proteassoma pode contribuir para o envelhecimento da pele humana. De fato, o envelhecimento e as células senescentes replicativas demonstraram ter diminuído a atividade do proteassoma, bem como os níveis de proteína das subunidades do proteassoma. O fato de que ambas as proteínas celulares oxidadas e/ou danificadas se acumulam mais frequentemente nessas células sugere que a via ubiquitina-proteassoma de degradação de proteínas está implicada em processos intrínsecos de envelhecimento. As Figuras 2B e C mostram a capacidade do extrato metanólico TAAR de proteger as células envelhecidas com NHDF da inibição da atividade do proteassoma 20S pelo oxidante OCl−. De fato, o oxidante OCl− inibe em 50 por cento a atividade de proteassoma das células de controle (Ct), enquanto o ativador de proteassoma 20S mais alto (ácido lipóico a 1 µM, Ct plus ) com mais de 50 por cento de atividade de inibição falha em reverter a inibição da atividade do proteassoma 20S pelo OCl−, enquanto todas as outras concentrações testadas (15, 50 e 75 µg/mL) do extrato metanólico TAAR parecem reverter essa inibição (0 a 19 por cento de inibição). Esses resultados sugerem que os extratos de raiz TAAR podem conter moléculas que podem retardar o envelhecimento da pele, não apenas aumentando a atividade do proteassoma, mas também neutralizando os efeitos inibidores dos agentes oxidantes. Entre essas moléculas, o ácido cafeoil-chiquímico é o mais provável de estar presente, assim como outros compostos. Além disso, análises de LC-DAD-MS (MS) e NMR foram realizadas para identificar os principais compostos dos extratos e são discutidas na próxima seção.

3.5. Análises Espectrométricas

3.5.1. Análise LC-DAD-MS de Extratos Metanólicos

O estudo comparativo das raízes da tamareira não revelou diferenças qualitativas, mas, em vez disso, diferenças semi-quantitativas (nos cromatogramas DAD e MS) entre as cultivares (Figura 3A, D) foram observadas em algum grau. De fato, os presentes resultados não permitem uma ligação entre a resistência das tamareiras a um aumento na quantidade de diferentes isômeros posicionais do ácido cafeoil-chiquímico porque a cultivar resistente (TAAR) apresenta a menor abundância relativa desses compostos (Figura 3C). Todos os três isômeros posicionais do ácido cafeoil-chiquímico (m/z=335.0768 com um erro de 1,2 ppm) foram identificados por seus espectros MS/MS (Figura S6) com um fragmento em m/z 179,0340, correspondendo a um fragmento A de ácido cafeico (C9H7O4) e um fragmento em m/z 135,0443, correspondendo à descarboxilação de ácido cafeico (C8H7O2). No entanto, outro composto que não corresponde aos ácidos cafeoil-chiquímicos (Figura 3C) e cujo tempo de retenção é de 29 min com m/z=259.0607 (ou 373,0543 para o aduto de TFA), parece ser claramente diferenciado entre diferentes cultivares (Figura 3D). A diferença no acúmulo desse composto nas raízes de cultivares sensíveis e resistentes (0,135 por cento ), com uma proporção em torno de 1:35 (de m/z=259.06, dados do MS), poderia explicar o destaque biológico atividades observadas para o extrato metanólico desta raiz.

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