Abstrato:A quercetina tem sido estudada extensivamente por seus efeitos anti-Alzheimer (AD) e antienvelhecimento. Nossos estudos anteriores descobriram que a quercetina e em sua forma de glicosídeo, a rutina, podem modular a função do proteassoma em células de neuroblastoma. Nosso objetivo foi explorar os efeitos da quercetina e da rutina na homeostase redox intracelular do cérebro (glutationa reduzida/glutationa oxidada, GSH/GSSG), sua correlação com a atividade da enzima 1 de clivagem de APP -site (BACE1) e proteína precursora amilóide (APP) expressão em camundongos TgAPP transgênicos (portando transgene APP de mutação sueca humana, APPswe). Com base no fato de que a proteína BACE1 e o processamento de APP são regulados pela via ubiquitina-proteassoma e que a suplementação com GSH protege os neurônios da inibição do proteassoma, investigamos se uma dieta contendo quercetina ou rutina (30 mg/kg/dia, 4 semanas) diminui vários primeiros sinais de DA. As análises de genotipagem dos animais foram realizadas por PCR. Para determinar a homeostase redox intracelular, métodos espectrofluormétricos foram adotados para quantificar os níveis de GSH e GSSG usando o-ftalaldeído, e a relação GSH/GSSG foi verificada. Os níveis de TBARS foram determinados como um marcador de peroxidação lipídica. As atividades enzimáticas de SOD, CAT, GR e GPx foram determinadas no córtex e no hipocampo. A atividade de BACE1 foi medida por um substrato específico de secretase conjugado a duas moléculas repórteres (EDANS e DABCYL). A expressão gênica das principais enzimas antioxidantes: APP, BACE1, uma proteína 10 contendo domínio de desintegrina e metaloproteinase (ADAM10), caspase-3, caspase-6 e citocinas inflamatórias foram determinadas por RT-PCR. Primeiro, a superexpressão de APPswe em camundongos TgAPP diminuiu a razão GSH/GSSG, aumentou os níveis de malonaldeído (MDA) e, em geral, diminuiu as principais atividades das enzimas antioxidantes em comparação com camundongos selvagens (WT). O tratamento de camundongos TgAPP com quercetina ou rutina aumentou GSH/GSSG, diminuiu os níveis de MDA e favoreceu a capacidade antioxidante da enzima, particularmente com rutina. Em segundo lugar, tanto a expressão de APP quanto a atividade de BACE1 foram diminuídas com quercetina ou rutina em camundongos TgAPP. Em relação ao ADAM10, ele tendeu a aumentar em camundongos TgAPP com tratamento com rutina. Quanto à expressão da caspase-3, TgAPP apresentou um aumento que foi o oposto da rutina. Por fim, o aumento na expressão dos marcadores inflamatórios IL-1 e IFN- em camundongos TgAPP foi reduzido tanto pela quercetina quanto pela rutina. Coletivamente, esses achados sugerem que, dos dois flavonoides, a rutina pode ser incluída na dieta diária como uma forma de terapia adjuvante na DA.

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Palavras-chave:quercetina; rutina; glutationa; APPswe; BACE1; doença de Alzheimer

1. Introdução

O declínio da função cognitiva é um sintoma clínico fundamental da neurodegeneração estritamente relacionado à idade [1]. O impacto da nutrição no declínio cognitivo associado à idade é um tema cada vez mais crescente, pois é um fator vital que pode ser facilmente modificado. As alterações patológicas no cérebro observadas durante o declínio cognitivo ocorrem bem antes de qualquer manifestação clínica, que ocorre principalmente na velhice. Isso fornece um período mais longo para estabelecer estratégias de prevenção relacionadas ao declínio cognitivo relacionado à idade e à demência, que é uma grande preocupação de saúde pública [2]. Por muitos anos, pesquisas intensivas sobre compostos de origem natural, encontrados nas dietas do dia-a-dia, foram realizadas na terapia de aprimoramento cognitivo [3].

Uma das doenças neurodegenerativas relacionadas à idade mais comuns é a doença de Alzheimer (AD), que é caracterizada por duas características neuropatológicas: placas amilóides (A) e emaranhados neurofibrilares. Em termos de pesquisa em animais, modelos animais podem simular a fase assintomática da DA, modificando a proteína precursora A (APP), por exemplo [4,5].

Notavelmente, vários fitoquímicos bioativos derivados de plantas associados a vários benefícios à saúde e diminuição do risco de muitas doenças foram rastreados para formar complexos não covalentes com o peptídeo amiloide (A) [3].

Embora numerosos medicamentos tradicionais e produtos dietéticos naturais tenham mostrado grande progresso na mitigação da patologia da DA, estamos plenamente conscientes das limitações dos modelos animais de DA, uma vez que os efeitos promissores dessas substâncias nem sempre são replicáveis ​​em estudos humanos [6]. No entanto, devido à dificuldade de analisar o tecido cerebral em humanos, especialmente em estágios muito iniciais de progressão, estudos em modelos de roedores são necessários. Como resultado, esses modelos experimentais podem apoiar o desenvolvimento de agentes usuários de medicamentos tradicionais e compostos naturais seguros para retardar a progressão de doenças neurodegenerativas. Assim, testar compostos naturais, encontrados na alimentação do dia-a-dia, para prevenção de doenças e proteção contra o risco de DA, deve ser uma prioridade.

Entre esses importantes agentes naturais da dieta está a quercetina, que é o principal flavonoide polifenólico presente em diversas frutas e vegetais. A quercetina está presente principalmente em sua forma glicosídica, ou seja, rutina. Por seu lado, a rutina (quercetina-3-O-rutinoside) tem mostrado efeitos profundos nas várias funções celulares que sustentam várias condições patológicas, nomeadamente antimicrobiana, anticancerígena, antitrombótica, cardioprotetora e neuroprotetora. Esses efeitos farmacológicos estão associados principalmente às atividades anti-inflamatória e antioxidante da rutina. Devido à sua capacidade de atravessar a barreira hematoencefálica e/ou seus metabólitos, foi demonstrado que a rutina pode alterar os sintomas cognitivos e comportamentais de doenças neurodegenerativas [8].

Nossos estudos anteriores descobriram que ambos os flavonóides, quercetina e rutina, afetam várias vias de sinalização e redes moleculares associadas à modulação das funções do proteassoma em células de neuroblastoma [9]. Além disso, foi demonstrado que a expressão de BACE1 e o processamento de APP são regulados pela via ubiquitina-proteassoma [10] e que a suplementação com glutationa reduzida (GSH) protegeu os neurônios da inibição do proteassoma [11]. A depleção de GSH no cérebro é um achado comum em pacientes com doenças neurodegenerativas, como a DA, e pode causar neurodegeneração antes do início da doença [12]. A ubiquitinação de BACE1 e o bloqueio da via ubiquitina-proteassoma inibe a degradação de BACE1 e, consequentemente, leva ao aumento da produção da atividade enzimática de BACE1 [10].

Com base nesses achados, e que os hábitos alimentares e a suplementação podem afetar o estado redox celular, pretendemos explorar os efeitos de uma dieta contendo quercetina ou rutina na homeostase redox intracelular do cérebro (GSH/GSSG), sua correlação com a atividade BACE1, e expressão de APP em modelos de camundongos de AD (portando transgene de APP de proteína precursora amiloide sueca humana, APPswe).

Finalmente, como há evidências convincentes do efeito de suplementos de flavonoides na melhoria de domínios cognitivos específicos e/ou achados de ressonância magnética [13], tentamos imitar, em animais, uma intervenção fornecendo uma dieta saudável contendo quantidades moderadas de um determinado potencial ativo ingrediente (quercetina ou rutina) como uma estratégia eficaz para prevenir a expressão de marcadores de DA.

2. Resultados

2.1. Genotipagem de Camundongos

A colônia de camundongos TgAPP foi desenvolvida em nosso laboratório a partir de machos heterozigotos Tg2576 e fêmeas selvagens. A genotipagem de camundongos foi realizada para detectar indivíduos transgênicos. De todos os camundongos testados, aproximadamente 40% foram considerados transgênicos (TgAPP).

Os produtos de PCR obtidos foram separados por eletroforese em géis de agarose a 1,5 por cento em tampão 0.5X TBE (Tris-Borate-EDTA) a 70 V (voltagem constante) e, em seguida, visualizados por coloração com GelRed (Millipore). O perfil de amplificação para camundongos transgênicos e WT é mostrado na Figura 1.

2.2. Glutationa

Para avaliar a homeostase redox intracelular em neurônios em camundongos TgAPP, os níveis de GSH e GSSG foram quantificados, e a razão GSH/GSSG foi determinada como um marcador do poder redutor celular em machos e fêmeas (Figura 2).

Na avaliação do efeito do transgene no sistema da glutationa, foi observado um declínio no poder redutor celular (GSH/GSSG) nos camundongos TgAPP em relação aos animais WT, tanto em machos quanto em fêmeas e em ambas as áreas do cérebro (Figura 2C3, H3), especialmente no hipocampo. Em camundongos WT e TgAPP, a razão GSH/GSSG foi significativamente menor em machos do que em fêmeas (Figura 2C3, H3; p <0,05). Enquanto em mulheres TgAPP esse declínio é resultado de níveis mais baixos de GSH (Figura 2C1, H1), em homens TgAPP é atribuído principalmente a um aumento nos níveis de GSSG (Figura 2C2, H2).

Alterações nos níveis de GSH e GSSG de camundongos TgAPP, respectivamente, após tratamento com quercetina ou rutina, são mais proeminentes em machos do que em fêmeas. Parece que a quercetina tende a aumentar os níveis de GSH (Figura 2C1, H1; p < 0.05) e a rutina a diminuir os níveis de GSSG (Figura 2C2, H2; p < 0,05).

Os tratamentos com quercetina e rutina, tanto em machos quanto em fêmeas, foram capazes de reverter a queda na razão GSH/GSSG no hipocampo (Figura 2H3), onde a recuperação do poder redox foi significativa em relação aos camundongos TgAPP não tratados. Nos machos, esse índice alcançou valores semelhantes aos de camundongos WT no hipocampo (H3). Nas fêmeas, embora essa proporção não seja elevada à dos camundongos WT, o tratamento com quercetina e rutina aumentou significativamente em comparação com a dos camundongos TgAPP em seus hipocampos (H3: quercetina, p < 0.{{ 6}}01; rutina, p < 0,05).

2.3. Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARs)

Os níveis de TBARs foram determinados como um marcador de peroxidação lipídica. Usando curvas de calibração, os resultados foram expressos como concentração de malondialdeído (MDA) (Figura 3).

Após a superexpressão de APP, um aumento significativo nos níveis de MDA quando comparados aos camundongos WT foi observado tanto no córtex (Figura 3C) quanto no hipocampo (Figura 3H), e em machos e fêmeas (p <00,001) .

Em fêmeas TgAPP, os tratamentos com quercetina e rutina quase restauraram os níveis de MDA para os mesmos dos camundongos WT (Figura 3C, H). Da mesma forma, em machos TgAPP, os tratamentos com quercetina e rutina restabelecem os níveis de MDA iguais aos dos camundongos WT no córtex (Figura 3C) e diminuem ainda mais no hipocampo (Figura 3H). Em camundongos WT e TgAPP, não tratados e tratados com flavonoides, os níveis de MDA eram dependentes do sexo (Figura 3C, H; p <0,05), exceto para os camundongos TgAPP tratados com quercetina no hipocampo.

2.4. Atividade Enzimática e Expressão de Enzimas Antioxidantes

Para determinar se a regulação da atividade enzimática ou a expressão gênica das principais enzimas antioxidantes, ou ambas, ocorre em uma dieta com quercetina ou rutina, foi realizada a determinação da atividade enzimática e dos níveis de mRNA.

A Figura 4 mostra as atividades enzimáticas de SOD, CAT, GR e GPx, determinadas em camundongos fêmeas e machos, no córtex cerebral (Figura 4a) e no hipocampo (Figura 4b).

Como consequência da superexpressão de APP, apenas uma diminuição significativa na atividade de CAT foi observada em camundongos TgAPP em comparação com camundongos WT em ambos os córtex (Figura 4a(C2); p <0.05) e o hipocampo (Figura 4b(H2); p < 0,05).

O tratamento com quercetina não produziu nenhuma variação significativa nas atividades enzimáticas em comparação com camundongos TgAPP, em machos ou fêmeas, nas áreas cerebrais estudadas. Em contraste, os animais tratados com rutina experimentaram um aumento na atividade de CAT no córtex (Figura 4a(C2)) e na atividade de GR no hipocampo (Figura 4b(H3)) em machos e fêmeas (p <0 .05). Além disso, a rutina aumentou a atividade hipocampal de CAT em machos TgAPP (Figura 4b(H2)) e a atividade GPx em fêmeas (Figura 4b(H4)).

A Figura 5 mostra a expressão gênica das principais enzimas antioxidantes, SOD, CAT, GR e GPx, determinada em camundongos fêmeas e machos, no córtex cerebral (Figura 5a) e no hipocampo (Figura 5b).

Não foram observadas diferenças na expressão gênica entre camundongos TgAPP e WT para as principais enzimas antioxidantes (Figura 5a,b). Machos TgAPP tratados com rutina mostraram um aumento significativo na expressão de CAT no hipocampo (Figura 5b(H2)). Quanto ao GPx hipocampal, observou-se um padrão semelhante ao CAT, embora o aumento não tenha sido significativo (Figura 5b(H4)).

2.5. Processamento de aplicativos: BACE1 e ADAM10

Os resultados da atividade da enzima BACE1 no córtex cerebral e no hipocampo em machos e fêmeas são mostrados na Figura 6, expressos como porcentagens de atividade em camundongos TgAPP não tratados.

Na Figura 6, descobriu-se que a atividade da enzima BACE1 em camundongos TgAPP aumentou cerca de 10 por cento quando comparada a camundongos WT, em ambas as áreas do cérebro sob investigação e em ambos os sexos, e foi considerada estatisticamente significativa (p < 0,05).

O aumento da atividade observado nos camundongos transgênicos foi reduzido pelos tratamentos com quercetina e rutina, tanto no córtex quanto no hipocampo. No entanto, ainda pode ser notado que o efeito da rutina foi ligeiramente maior do que o da quercetina nos machos.

Uma vez conhecida a atividade de BACE1, decidimos realizar o estudo da expressão gênica da APP, principal característica do modelo animal transgênico, e de suas principais enzimas processadoras: BACE1 e ADAM10. A Figura 7 mostra os resultados obtidos em camundongos fêmeas e machos, tanto no córtex quanto no hipocampo.

Em ambos os sexos, um aumento significativo na expressão de APP superior a 85% foi observado em camundongos WT, demonstrando a superexpressão do gene no córtex cerebral (Figura 7C1; p <0.05) e no hipocampo (Figura 7H1; p < 0,05). Os tratamentos com quercetina e rutina foram capazes de reduzir essa expressão em mais de 45% (p < 0,05) para camundongos machos e fêmeas em ambas as áreas do cérebro sob investigação (Figura 7C1, H1), com os efeitos sendo mais proeminentes no hipocampo ( Figura 7H1).

Quanto à expressão da proteína BACE1, embora a atividade de BACE1 tenha sido alterada, não houve diferenças significativas entre camundongos transgênicos e não transgênicos, independentemente do sexo e do tratamento com flavonoides examinados.

Assim, avaliamos a expressão de ADAM10 envolvida no processamento não amiloidogênico da APP. Embora as alterações na expressão de ADAM10 em camundongos TgAPP em comparação com camundongos WT não tenham sido estatisticamente significativas, uma ligeira diminuição foi observada. Em relação aos tratamentos com flavonóides, a rutina apresentou uma tendência crescente na expressão de ADAM10, tanto em machos quanto em fêmeas e em ambas as áreas do cérebro (Figura 7C3, H3).

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