Supressão de Danos Renais Associados à Inflamação Pós-Transplante Usando o Novo Eliminador de Radicais Livres PrC-210 em Ratos
Mar 18, 2022
Torsten R. Goesch 1, Nancy A. Wilson2, Weifeng Zeng2, Bret M. Verhoven2, Weixiong Zhong2, Maya M. Coumbe Gitter3e William E. Fahl1,3,*
Abstrato:
Aloenxertorimtransplante, que desencadeia a rejeição mediada por células e anticorpos do hospedeiro dorim, é um dos principais contribuintes para danos nos rins durante o transplante. Aqui, perguntamos se o PRC-210 suprimiria os danos observados em transplantes de rim de aloenxerto. Rins de rato Brown Norway (BN) foram perfundidos in situ (solução UW) com ou sem adição de 30 mM de PrC-210 e então imediatamente transplantados em ratos Lewis (LEW). 20 h depois, os rins BN transplantados e o plasma LEWrat foram analisados.Rimhistologia e níveis renais/séricos de várias citocinas associadas à inflamação foram medidos para avaliar a patologia renal relacionada à incompatibilidade e a eficácia protetora da PrC-210. Vinte horas após os transplantes de aloenxerto: (i) foram observados danos histológicos significativos nos túbulos renais e infiltração de células inflamatórias mononucleares nos rins do aloenxerto; (ii)rimas métricas de função (creatinina e BUN) foram significativamente elevadas; (iii) foram observadas alterações significativas em citocinas-chave, ou seja, TIMP-1, TNF-alfa e MIP-3A/CCL20, e níveis de caspase ativada por rim. Em rins tratados com PRC-210-e ratos receptores, (i) dano histológico renal (Pontuações de Banff) e infiltração mononuclear foram reduzidos a níveis de fundo não tratados; (ii) creatinina e BUN foram significativamente reduzidos; e (iii) as alterações de caspase e citocina ativadas foram significativamente reduzidas, algumas em segundo plano. Em conclusão, os resultados sugerem que PrC-210 poderia fornecer proteção de órgãos amplamente aplicável para muitas condições de transplante de aloenxerto; poderia proteger os rins transplantados durante e após todas as etapas do processo de transplante – desde a doação de órgãos, passando pelo transporte, reimplante e inflamação pós-operatória – para minimizar a rejeição aguda e crônica.
Keiwords: rimaloenxerto; rejeição renal; isquemia
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1. Introdução
A insuficiência renal terminal causa mais de 1,2 milhão de mortes anualmente em todo o mundo [1].Rimo transplante é o tratamento preferencial para pacientes com doença renal em estágio terminal. Mais de 90,000 transplantes de rim são realizados a cada ano em todo o mundo.
O processo de transplante, por si só, induz significativa lesão celular e orgânica aorim, o que reduz a sobrevivência a longo prazo do órgão. Os três insultos primários a um rim durante um transplante de aloenxerto são (i) danos induzidos por espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (ROS e RNS) durante a isquemia fria ('armazenamento a frio) [2], (ii) danos induzidos por ROS após o implante ('lesão de reperfusão') [3], e (iii) inflamação pós-transplante de aloenxerto, que desencadeia a resposta imune inata e rejeição mediada por anticorpos (ABMR) [4].
Neutrófilos e macrófagos migram para o transplante danificado dentro de 6 h após a reperfusão e estimulam a síntese de quimiocinas em células dendríticas residentes que então ativam linfócitos T e recrutam células imunes adaptativas. Uma vez que essas células imunes se infiltram nas células epiteliais do túbulo proximal, elas produzem mieloperoxidase nos neutrófilos e nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) oxidase nos macrófagos, os quais contribuem para a produção local de radicais livres. Esses processos inflamatórios levam a uma ativação da via do complemento e posterior remodelação e lise celular norimaloenxerto [5].ABMR pode ocorrer como resultado de um, ou ambos, aloanticorpo pré-formado contra o enxerto ou através do desenvolvimento de novo de anticorpo específico do doador (dnDSA) [5–7]. A resposta inflamatória aguda (min/dias), em transição para crônica (dias/semanas), no rim do aloenxerto, com produção contínua de EROs e citocinas inflamatórias, pode estabelecer uma resposta grave e autoperpetuante que causarimfalência do órgão.
Para entender melhor as vias celulares e moleculares envolvidas na patogênese dariminflamação e rejeição do aloenxerto, desenvolvemos e caracterizamos um modelo de rato que replica a maioria dos critérios clínicos da resposta imune inata, ABMR e perda de órgãos renais [8]. Este modelo tem sido usado para avaliar uma série de novas estratégias de transplante pós-aloenxerto.
As duas abordagens atualmente reconhecidas para reduzir a resposta imune aguda e de longo prazo contra orimaloenxerto são: (i) aumentar a chance de encontrar um doador compatível, e (ii) remover anticorpos pré-existentes contra orimaloenxerto usando protocolos de dessensibilização [9,10].
No trabalho descrito neste manuscrito, perguntamos se uma terceira abordagem para suprimir a gravidade da inflamação aguda e de longo prazo seria benéfica. Administramos o sequestrador de radicais livres de ação imediata, PRC-210, tanto no aloenxerto implantadorime para o rato receptor, para determinar se o dano de ROS associado à inflamação pode ser suprimido. Embora o conceito de suprimir ROSin associado à inflamaçãorimtransplante não é novo, o uso aqui do novo PRC de ação imediata-210 ROSscavenger é. Eliminação imediata e crônica e inativação da inflamação gerando e gerando radicais livres dentro do aloenxerto recém-transplantadorimwould significantly enhance the existing strategies to suppress allograft rejection and would provide another pathway to reduce post-transplant kidney cell damage, and with it, suppress Delayed Graft Function to improve survival of the kidney allograft.PRC-210 is a new small-molecule, aminothiol, free radical scavenger [11]; it has no measurable nausea/emesis nor hypotension side effects [12]. Unlike traditional antioxidants that act indirectly over hours to days via NrF-2 to activate the expression of protective genes [13], PRC-210 directly scavenges ROS to confer 100% protection in seconds [11]. PRC- 210 was the most potent of the 13 commonly studied "antioxidants" screened in an assay that scored the ability of molecules to prevent x-ray-induced damage to naked DNA; the majority of the tested "antioxidants" showed no protection [14,15]. In a related essay, the addition of PrC-210 30 s before a 60 s pulse of •OH to naked DNA provided complete protection against the •OH insult that induced >95 por cento de danos ao DNA em controles desprotegidos [16]. Em dois estudos anteriores de transplante de rim em roedores [16,17], o PRC-210 demonstrou suprimir o dano renal induzido por ROS induzido durante (i) 30 h de armazenamento a frio [17] e (ii) lesão de reperfusão após o implante [16 ] aos níveis de fundo, removendo assim duas fontes substanciais de lesão nos rins transplantados. A molécula PRC-210 também demonstrou suprimir a lesão induzida por radicais livres em várias outras configurações de órgãos [15,18]. Assim, nós hipotetizamos que PrC-210 também deve ser capaz de proteger um aloenxerto contra o estresse oxidativo que é gerado por AMBOS (i) processos de rejeição mediados por anticorpos que produzem radicais livres como um subproduto.
Para explorar essa hipótese, desenvolvemos um novo modelo de rato que evitou a indução de grandes eventos isquêmicos e de reperfusão e administramos PrC-210 tanto pré como pós-implantação. Os rins de ratos marrons foram lavados com solução UW contendo PrC-210 e imediatamente transplantados em receptores de ratos Lewis singênicos. O tempo de isquemia fria foi praticamente eliminado. Imediatamente após o implante e por 8 h apósrimimplante, os ratos receptores receberam injeções sistêmicas de PrC-210 em doses que permitiriam a eliminação contínua de radicais livres dentro do transplanterim. Os rins transplantados e o plasma sanguíneo foram então colhidos 20 h após o transplante para permitir a medição de PrC-210-conferido (i) supressão de subprodutos inflamatórios e (ii)rimproteção.
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2. Materiais e métodos
2.1. Animais
Ratos Lewis e BN machos adultos (200-250 g) foram adquiridos da Envigo (Indian-napolis, IN, EUA) e alojados no centro de cuidados de animais da Universidade de Wisconsin em Madison, WI, EUA. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as Políticas de Uso e Cuidados com Animais da Universidade de Wisconsin. A manutenção da saúde dos animais, incluindo mortes de animais, temperatura ambiente, ciclos de 12 h de luz/escuro e limpeza das gaiolas, entre outras tarefas sanitárias, foram realizadas diariamente pela equipe de cuidados com os animais. Comida e água estavam disponíveis ad libitum. Esta pesquisa foi aprovada prospectivamente pela Escola de Medicina e Saúde Pública Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Wisconsin (Protocolo Animal # M005204). Todos os grupos continham 4-6 animais.
2.2. Materiais
A síntese do PrC-210 HCl aminotiol, uma molécula pré-clínica, foi descrita separadamente [19,20]. Cristais de PrC-210 HCl (3-(metilamino)-2-(metil monometil)propano-1- tiol) são armazenados sob uma atmosfera de nitrogênio a -20 ◦C, e mesmo com rotina descongelamento, uso e armazenamento, o PrC cristalino-210 é completamente estável por mais de 4 anos por análise de espectrometria de massa. Outros reagentes químicos foram obtidos da Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EUA). A UW Organ Preservation Solution foi adquirida da Bridge to Life, Columbia, SC, EUA.
2.3. Procedimento Cirúrgico e Experimental
O procedimento de transplante utilizado nestes experimentos é mostrado na Figura 1. No rato doador BN, após dupla ligadura da aorta, ligadura da artéria e veia renal direita e secção cirúrgica da veia renal esquerda, o rato esquerdorimfoi perfundido in situ usando 5 mL de solução UW à temperatura ambiente (durante um período de 15 s). O perfusato era solução UW sozinha (para os grupos "0 h" e "20 h Sem tratamento") ou solução UW para a qual PrC cristalino-210, para atingir 30 mM [17], foi adicionado, dissolvido imediatamente e, em seguida, o pH ajustado para o pH da solução UW inicial de 7,4 adicionando 0,0619 µL de NaOH 5N por µmol de sal PrC-210 HCL (FW: 220). A meia-vida do PrC-210 tiol (forma ativa) é de aproximadamente 3,5 h em soluções de pH fisiológico, como solução UW e sangue humano [14]. Após perfusão in situ, o BN esquerdorimfoi removido cirurgicamente e depois suturado por anastomose romba de vasos e ureter no local desocupado do rim esquerdo do rato receptor LEW. O LEW certorimfoi ligado e removido imediatamente antes. Cinco minutos após o fechamento cirúrgico do rato LEW, o rato recebeu uma dose sistêmica de PrC{{0}} (121 ug de PrC-210 HCl por g de peso corporal, o que equivale a 0.24 X Dose Máxima Tolerada) por injeção intraperitoneal. Conforme mostrado no esquema da Figura 1, o rato também recebeu doses de injeção intraperitoneal de PrC-210 (0,24 MTD) em mais 4 h e mais 8 h após o transplante. Os ratos foram eutanasiados mais 20 h após o transplante, erinse amostras de plasma foram coletadas para análise. Havia um mínimo de cinco ratos em cada grupo de tratamento.
2.4. Medições de soro BUN e creatinina
BUN e creatinina foram medidos em amostras de soro usando a Catalyst One Analyzer Technology (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, EUA).
2.5. Ensaios de imunoabsorção enzimática
Os ensaios foram realizados conforme descrito nos protocolos do kit ELISA (Rat TIMP-1, Cat# RTM- 100; Rat MIP3-A, Cat# DY540; Rat TNF-alpha, Cat# RTA{ {5}}; Sistemas de P&D, Minneapolis, MN, EUA). Resumidamente, diluições de plasma de rato foram adicionadas a placas pré-revestidas, incubadas por 2 h a 37 О C. anticorpo conjugado com biotina específico para a proteína testada foi então adicionado e incubado por 1 h a 37 О C, lavado, conjugado com avidina foi adicionada peroxidase de rábano, seguida de lavagem e adição de substrato TMB. A reação foi incubada por 10 a 30 minutos, parada com ácido sulfúrico e lida a 450 nm.
2.6. Proteome Profiler Rat Cytokine Array
Os ensaios foram realizados essencialmente como descrito no protocolo do produto. Resumidamente, o plasma foi incubado com membranas de nitrocelulose manchadas com anticorpos de captura e controle. Após a incubação, as membranas foram lavadas e incubadas com estreptavidina HRP. Em um desvio do protocolo, utilizamos o SuperSignal West Femto (ThermoFisher, Madison, WI, EUA; Cat# 34094) para detecção quimioluminescente, pois deu um sinal mais forte. As manchas foram visualizadas num sistema FotoDyne gel doc.
2.7. Histologia
Fixado em formalina (formalina a 10%), embebido em parafina,rinsforam cortados em seções de 5 um. As lâminas foram desparafinizadas, reidratadas de xileno através de uma série de etanol graduada até água e posteriormente tratadas conforme descrito abaixo. As lâminas foram digitalizadas usando uma objetiva 20- em um Aperio Digital Pathology Slide Scanner. Todas as lâminas de H&E foram revisadas pelo Dr. Weixiong Zhong, MD, PhD, patologista de transplantes e pontuadas para PTC, glomerulite (g), vasculite (v)/arterite intimal, inflamação intersticial (I) e coloração C4d, de acordo com Banff 2009 [21].
Separadamente, as lâminas receberam um número cego e imagens digitais não sobrepostas dos túbulos renais foram tiradas na interface entre a medula e o córtex de cada lâmina H/E. Tomou-se o cuidado de não incluir lúmens e glomérulos de grandes vasos. Quantificação automatizada de pixels vermelhos e azuis em cada 10-rimimagem foi realizada usando uma macro personalizada escrita no software ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/index.html
acessado em 13 de abril de 2021). Os pixels vermelhos refletiam a espessura tubular proximal, incluindo a borda em escova. Os núcleos foram quantificados no canal azul. A proporção de pixels nucleares azuis para túbulos vermelhos forneceu uma pontuação de infiltração inflamatória para a infiltração de glóbulos brancos no pós-transplanterins. As pontuações foram calculadas em média e plotadas usando Graphpad Prism.
2.8. Atividade da Enzima Caspase Ativada
Atividade de caspase 3 e 7 ativada emrimos sobrenadantes homogeneizados foram determinados usando o substrato fluorescente Apo-ONE (Promega, Madison, WI, EUA) [16]. Brevemente, descongeladorinsforam misturados com 8-tampão de lise em excesso contendo 50 mM de Na HEPES, pH 7,4, 100 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 10 mM de DTT, 10 por cento de glicerol e homogeneizados a 4 О C por 30 s com um homogeneizador de tecidos Omni . O homogenato de rim foi centrifugado a 4ºC (16,000- g) em uma microcentrífuga Eppendorf por 20 min. Os sobrenadantes foram imediatamente testados quanto à atividade de caspase e teor de proteína pelo método de Bradford usando albumina de soro bovino como padrão. O ensaio de caspase ativada foi realizado da seguinte forma: 5 uL de sobrenadante (~40 ug de proteína de sobrenadante) foi diluído para um volume total de 50 uL com o tampão de lise acima, foi misturado com 50 uL do substrato Apo-ONE não diluído no poço de uma placa preta, opaca, de 96 poços para iniciar a reação de 60 min. As placas foram agitadas a 200 RPM a 37 ºC por 60 min. A clivagem do peptídeo substrato de caspase DEVD foi medida usando um leitor de placas fluorescentes BMG Clariostar em um comprimento de onda de excitação de 499 nm e um comprimento de onda de emissão de 521 nm. Um padrão de caspase foi incluído em cada experimento.
2.9. Mitocôndrias do Rim de Rato
A fração mitocondrial purificada foi preparada a partir de rato homogeneizadorinspor uma técnica de centrifugação padrão [22]. As mitocôndrias purificadas foram suspensas em tampão 0.15 M Tris HCl, pH 7,4.
Para determinar se a adição de PrC exógeno{{0}} suprime a fragmentação do DNA mitocondrial induzida por ROS [22], em um volume de reação de 25 uL (em um tubo de PCR), adicionamos: 1{{29} } uL de mitocôndrias purificadas, diluição de 5 uL de PrC-210 ou água (PrC-210 foi adicionado 10 min antes do gerador de Fe mais mais mais mais ADP mais H2O2 ●OH) e 10 uL contendo FeCl2 (2,5 mM; FW:127), sal de sódio de adenosina 5'-difosfato (10 mM; FW: 427) e H2O2 (concentração final de 0,003 por cento). Após 20 min a 37 О C, 10 uL da reação foi misturado com 5 uL de corante de carregamento de gel 6- contendo 0,3 por cento de SDS; os tubos ficaram em água a 60 ºC por 1 min, 10 ul foram então carregados em um poço de um gel TAE de agarose a 1 por cento, e após 60 min a 60 volts, os géis foram corados e fotografados. Um mínimo de três réplicas foram feitas para cada ponto de ensaio para permitir a comparação estatística.
2.10. Análise estatística
Os dados são expressos como as médias mais /一 STDs. Os testes t de Student foram usados para determinar a diferença estatística e os valores de p usando o software GraphPad Prism 7.03. valores de p inferiores a 0,05 foram considerados significativos.
3. Resultados
3.1. PrC-210 Supressão de Patologia de Aloenxerto Renal
Às 20 h pós-transplante, a histologia do BN transplantadorins(Figura 2A-D) tratado apenas com solução UW mostrou claramente aumento dos escores de Banff para tubulite e capilarite peritubular (setas vermelhas e amarelas); as pontuações de patologia somadas são mostradas no painel E. BNrinsperfundidos com PrC{{0}}contendo solução UW e recebendo doses sistêmicas intraperitoneais pós-implante de PrC-210 (Figura 2D) mostraram patologia inflamatória claramente suprimida no rim e escores de Banff suprimidos para tubulite e peritubular capilarite igual aos escores de Banff do grupo controle BN "0 h" (Figura 2E). A administração de PrC-210 conferiu reduções significativas nos marcadores de dano renal de creatina (p=0.032) e BUN (p=0.046).
3.2. Níveis de caspases ativadas em rins pós-transplante
Níveis de caspase ativada em BNrimhomogeneizados foram significativamente reduzidos em aloenxertos BNrinsque não foram expostos ao tratamento com PrC{0}} durante as 20 h após o transplante (Figura 5). A perfusão de rins BN com PrC-210-contendo solução UW e o transplante em ratos Lewis que receberam doses sistêmicas de PrC-210 resultou na mesma atividade de caspase ativada observada nos rins controle "0 h".
3.3. Níveis de citocinas inflamatórias após aloenxerto renal BN
Em experimentos de triagem,rimhomogeneizar sobrenadas de 0 h controles e 20 h sem tratamentorinsforam rastreados com o Proteome Profiler 29 cytokine array para detectar níveis de expressão de citocinas e quimiocinas alterados, associados à inflamação, 20 h após o transplante. Conforme mostrado nas duas inserções de microarray da Figura 6, foram observadas alterações em TIMP-1, TNF-alfa e MIP-3a/CCL20. Placas de ELISA individuais foram então usadas para quantificar essas alterações em homogenatos e soros renais, agora incluindo também ratos tratados com PrC-210. Os níveis de TIMP-1 e TNF-alfa aumentaram 20 h após o transplante e, em ambos os casos, seus níveis diminuíram na presença de PrC-210 (Figura 6A–C). Os níveis de MIP-3a/CCL20 foram aumentados em 20 h, mas aumentaram significativamente mais em ratos tratados com PrC-210-(Figura 6D).
3.4. PrC-210 Proteção de Mitocôndrias Renais de Ratos
Função mitocondrial sustentada durante e apósrimtransplante é necessário para a sobrevivência do órgão transplantado. As ERO geradas durante a isquemia associada ao transplante, isquemia-reperfusão e inflamação pós-implante podem afetar o desempenho e a sobrevivência das mitocôndrias renais. Devido ao importante papel mitocondrial, isolamos mitocôndrias de rins de ratos e determinamos se PrC-210 em concentrações farmacológicas alcançáveis poderia proteger essas organelas de um insulto de ROS.
Na Figura 7, rato purificadorimas mitocôndrias foram incubadas com um gerador de ●OH [23]. Após a breve reação, vimos fragmentação ROS significativa do DNA mitocondrial de rim de rato. Após o insulto de ROS, uma alíquota das mitocôndrias foi solubilizada em tampão de carregamento de gel contendo SDS e o DNA mitocondrial foi separado e "dimensionado" usando cromatografia em gel de agarose (Figura 7). O insulto de ROS reduziu claramente o tamanho médio do DNA mitocondrial do rim de rato (pista b), e a adição de PrC-210 às mitocôndrias evitou a quebra do DNA (pistas c–g) em um PrC-210 maneira dependente da concentração.
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4. Discussão
AloenxertorimO transplante, que desencadeia a rejeição do rim mediada por anticorpos e células do hospedeiro inato, é um dos principais contribuintes para a curto e longo prazo.rimdanos durante o transplante, e a Função Retardada do Enxerto associada é observada em até 50% dos rins transplantados. Realizamos este estudo para determinar se PrC-210 seria eficaz na supressão da gravidade do dano induzido após um transplante de rim de aloenxerto em um modelo de rato que elimina em grande parte o tempo isquêmico do transplante e seu estresse oxidativo associado. Nossa suposição foi de que essa abordagem deve nos permitir ver o impacto da PrC-210 no insulto inflamatório pós-transplante com interferência mínima de isquemia.
O aumento de TNF-alfa e a infiltração mononuclear substancial demonstram que o transplante renal com aloenxerto induz inflamação aguda pronunciada nas 20 h após o transplante, e isso foi correlacionado com o dano das células tubulares renais observadas norimhistologia (Pontuações de Banff). O TNF-alfa é produzido principalmente por macrófagos ativados e é uma proteína de sinalização celular envolvida na inflamação aguda. Está intimamente associado à patogênese da rejeição aguda e crônica do aloenxerto [24].
Em contraste com os achados acima em BN não tratadarins, PrC-210 administrado como parte da solução UW e administrado sistemicamente em ratos pós-transplante reduziu tanto o nível de TNF-alfa quanto a infiltração renal por células mononucleares, que são ambos sinais de inflamação aguda reduzida. PrC-210 reduziu o dano renal como visto nos escores de lesão renal histológica (Pontuações de Banff) para níveis de base não tratados e reduziu os níveis de ambos os escores funcionais de patologia renal, creatinina e BUN.
A inflamação em rins BN não tratados foi associada a um aumento em TIMP-1 e MIP-3A/CCL20. Em comparação, vimos que o tratamento com PrC-210 reduziu significativamente o nível de TIMP-1 e aumentou significativamente o nível de MIP-3A/CCL20.
O inibidor tecidual da metaloproteinase-1 (TIMP-1) é um importante regulador da síntese e degradação da matriz extracelular (MEC). O acúmulo excessivo de MEC é o principal mecanismo patológico do desenvolvimento da fibrose durante e após a lesão renal aguda. Não há essencialmente nenhuma expressão de TIMP-1 emrimtecido [25], uma observação que é corroborada em nossa Figura 6A, B, mas TIMP-1 é conhecido por ser expresso em rins lesados, principalmente em células epiteliais tubulares renais, membrana basal tubular renal e citoplasma de células intersticiais células. A expressão aumentada de TIMP-1 foi positivamente correlacionada com a deterioração simultânea da função renal [26]. Ratos tratados com PrC-210 mostraram uma redução profunda nos níveis de TIMP-1 (p=0.001), tanto no homogenato renal quanto no plasma; isto implica que PrC-210 exerce um forte efeito protetor contra a reorganização induzida por transplante da matriz extracelular renal.
A quimiocina MIP-3a/CCL20 ativa o receptor CCR6, que é expresso especialmente em células T reguladoras (Tregs). CCL20 é expresso por células endoteliais e intersticiais tubulares e também é regulado positivamente em rins com lesão renal aguda. A via CCL20-CCR6 desempenha um papel vital no recrutamento de células T mediadas por Tregs para o rim, e as Tregs foram descritas como tendo um papel positivo narimreparo, tolerância ao transplante e sobrevida renal. Tanto o bloqueio de anticorpos da via CCL20-CCR6, quanto o uso de camundongos com deficiência de CCR6-rimexperimentos de lesão, mostraram aumentar a gravidade da insuficiência renal e mortalidade [27]. Isso sugere que, clinicamente, o aprimoramento da via CCL20-CCR6 e a ativação das Tregs podem ser uma possível rota terapêutica para limitar as infecções agudas e crônicas.rimlesão [28]. Em nosso estudo (Figura 6D), o nível de MIP-3a/CCL20 foi significativamente maior em ratos tratados com PrC-210-do que em ratos não tratados. Especulamos que esta é uma das razões para o (i) recrutamento significativamente menor de células mononucleares para os rins (Figura 3C) e (ii) o dano renal significativamente reduzido (Figura 2) nos ratos tratados com PrC-210- .
A função mitocondrial renal normal e, mais importante, os insultos a ela durante as etapas de armazenamento do rim, implante e inflamação pós-implante são determinantes significativos da lesão de ROS e insuficiência renal durante o transplante. Foi, portanto, significativo que PrC-210 demonstrou conferir supressão completa da fragmentação do DNA mitocondrial (Figura 7) em concentrações (2-4 mM) que foram alcançadas no plasma de camundongos e ratos que receberam intraperitoneal ou oral sistêmica 0.5 doses MTD de PrC-210 que foram toleradas sem toxicidade detectável [29].
Em nossos estudos anteriores relacionados ao transplante de rim [16,17], observamos aumentos substanciais na caspase ativada em rins expostos a lesões de "isquemia fria" e "isquemia-reperfusão". Esses insultos induzidos por isquemia aos rins foram reduzidos ao fundo pelo tratamento com PrC-210 (Figura 8). Nos estudos deste manuscrito (Figura 5), em que a isquemia fria e a isquemia-reperfusão foram essencialmente eliminadas pelo transplante imediato, não houve aumento da caspase ativada nos rins transplantados. Em vez disso, a caspase ativada foi significativamente reduzida em mais 20 h nos controles "sem tratamento com drogas", e o tratamento com PrC{10}} eliminou completamente essa redução de caspase em ratos com mais de 20 h e manteve o nível de caspase estável. Nossa interpretação desses resultados interessantes é que ausente qualquer insulto significativo de radicais livres induzido por isquemia através de ROS e RNS para o pós-transplanterins, não há marcadores associados de morte celular e apoptose como as caspases ativadas. Em vez disso, nesses transplantes de rim de aloenxerto, os sinais inflamatórios de citocinas e quimiocinas recém-expressas agora regulam o metabolismo celular, o que inclui influenciar a via de apoptose. A literatura descreve que a superexpressão de TIMP-1 leva à supressão da apoptose [26]. Nossos resultados de caspase (Figura 5) suportam este efeito TIMP-1 descrito, e eles implicam que TIMP-1 é importante na regulação da fisiopatologia do dano celular após transplante de aloenxerto renal. Em corroboração com a supressão anterior de PrC-210 da expressão TIMP-1 (Figura 6A, B), o tratamento com PrC-210 eliminou completamente a mudança de caspase, mantendo os níveis de caspase no mesmo nível visto em os rins de controle "0 h". Como os níveis séricos reduzidos de PrC-210 TIMP-1 em mais 20 h (Figura 6B) refletem com precisão a supressão significativa do aloenxerto: (i) apoptose (Figura 5), (ii) patologia histológica (Figuras 2 e 3) e (iii) infiltração de células inflamatórias (Figura 3), esperamos que o monitoramento dos níveis séricos de TIMP-1 em receptores de aloenxerto de rim humano seja uma maneira lógica de monitorar a eficácia clínica de PrC-210 em futuros ensaios clínicos .
Em nosso trabalho até o momento [16,17], mostramos que a PrC-210 é capaz de proteger os rins transplantados contra os insultos de isquemia fria e isquemia-reperfusão. Neste estudo, vemos agora que o PrC-210 também protege os rins do aloenxerto dos insultos inflamatórios não isquêmicos que ocorrem após o implante renal. PrC-210 reduz significativamente os níveis de citocinas inflamatórias agudas, como TNF-alfa, e suprime a expressão da quimiocina TIMP-1. Ambos os eventos, e potencialmente, ainda mais apoiados pela expressão adicional de CCL20, seriam esperados para: (i) reduzir o dano renal do aloenxerto, (ii) suprimir o recrutamento de células T para o rim e (iii) suprimir a ativação do inato e sistema imunológico adaptativo. Na Figura 8, resumimos essas descobertas para apoiar o papel que achamos que a PrC- 210 pode desempenhar no transplante de rim humano; ele suprime: (i) isquemia fria espécies reativas de oxigênio (ROS) e espécies reativas de nitrogênio (RNS) danos ao fundo [17],
(ii) dano de ROS de isquemia-reperfusão ao fundo [16], e (iii) dano de inflamação do aloenxerto substancialmente, em alguns casos, ao fundo. Como o principal mecanismo de ação da PrC-210 para a PrC-210 é a eliminação de radicais livres de oxigênio e nitrogênio, isso implica que esses radicais livres são um importante contribuinte para o dano renal observado em condições não isquêmicas, ou seja, a inflamação associada ao aloenxerto estudada neste manuscrito.
Em resumo, isso sugere que PrC-210 poderia fornecer proteção de órgãos amplamente aplicável para muitas condições de transplante de aloenxerto; poderia proteger os rins transplantados durante e após todas as etapas do processo de transplante – desde a doação de órgãos, passando pelo transporte, reimplante e inflamação pós-operatória – para minimizar a rejeição aguda e crônica.
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Contribuições do autor:NAW, WZ (Weifeng Zeng), WZ (Weixiong Zhong), BMV e MMCG participaram da realização da pesquisa e análise dos dados; TRG e NAW participaram do desenho da pesquisa e da análise dos dados; WEF e TRG participaram do desenho da pesquisa, da execução da pesquisa, da análise dos dados e da redação do artigo. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.
Financiamento:Esta pesquisa foi financiada pelo UW Institute for Clinical and Translational Research e concedeu UL1TR002373 ao UW ICTR do NIH/NCATS, American Society of Transplant Surgeons (133 AAA1552), American College of Surgeons (133 AAB2176), e concedeu apoio ao WEF (# R03CA176799).
Declaração do Conselho de Revisão Institucional: Esta pesquisa foi aprovada prospectivamente pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Escola de Medicina e Saúde Pública da Universidade de Wisconsin (Protocolo Animal #M005204).
Declaração de disponibilidade de dados:Os dados do estudo estão totalmente disponíveis neste manuscrito. Conflitos de interesse: Os autores declaram não haver conflito de interesse.
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