Stx2 induz expressão gênica diferencial e perturba genes do ritmo circadiano no túbulo proximal

Abstrato: Escherichia coli produtora de toxina Shiga(STEC) causa defeitos tubulares proximais no rim. No entanto, os fatores alterados pela toxina Shiga (Stx) nos túbulos proximais ainda não foram demonstrados. Determinamos o receptor Stx Gb3 em rins murinos e humanos e confirmamos a expressão do receptor nos túbulos proximais. Stx2-injetou tecidos renais de camundongos eCélulas epiteliais tubulares proximais renais primárias humanas tratadas com Stx2-(RPTEC) foram coletados e a análise de microarranjos foi realizada. Comparamos matrizes de rim murino e RPTEC e selecionamos 58 genes comuns que são expressos diferencialmente versus controle (0 h, sem tratamento com toxina). Descobrimos que o gene mais expresso foi o GDF15, que pode estar envolvido na perda de peso induzida por Stx2-. Genes associados a atividades Stx2 relatadas anteriormente, como src quinase Sim, ativação da via de fosforilação, resposta proteica desdobrada (UPR) e resposta ao estresse ribotóxico (RSR) mostraram expressões diferenciais. Além disso, os genes do relógio circadiano foram expressos diferencialmente, sugerindo distúrbio do ritmo circadiano renal induzido por Stx. O transportador tubular proximal de Na+ -glicose regulado pelo ritmo circadiano SGLT1 (SLC5A1) foi regulado negativamente, indicando deterioração funcional tubular proximal, e os camundongos desenvolveram glicosúria confirmando disfunção tubular proximal. Stx2 altera a expressão gênica em túbulos proximais murinos e humanos através de atividades conhecidas e distúrbios do ritmo circadiano recentemente investigados, que podem resultar em disfunções tubulares proximais.

Palavras-chave:Toxina Shiga tipo 2 (Stx2);túbulo proximal renal; rato; célula epitelial tubular proximal renal humana (RPTEC); microarranjo; ritmo circadiano

Contribuição principal:Foram analisados ​​genes diferencialmente expressos de rins de camundongos tratados com Stx e células tubulares proximais primárias humanas. Além dos genes previamente conhecidos2-afetados por Stx, foi demonstrado que os genes associados ao ritmo circadiano alteram sua expressão e influenciam a função tubular proximal.

1. Introdução

Escherichia coli produtora de toxina Shiga(STEC) causa sintomas graves de síndrome hemolítico-urêmica (SHU), que é definida pela tríade de insuficiência renal aguda, trombocitopenia e anemia hemolítica [1]. Acredita-se que as toxinas Shiga (Stxs) desempenhem um papel importante no dano às células nesta doença infecciosa. A histopatologia renal característica da SHU inclui danos glomerulares e tubulares, como deposição de fibrina capilar nos glomérulos e necrose tubular, respectivamente [1,2]. A ocorrência anterior de disfunção nos túbulos proximais de pacientes infectados por STEC foi relatada pela análise da urina. Os marcadores urinários funcionais tubulares proximaisN-acetil glucosaminidase(NAG) e 2 microglobulinas (2MG) da urina em estágio agudo de pacientes com SHU associada a STEC O157- ou O111- foram medidas como altamente aumentadas, sugerindo disfunção tubular proximal precoce [3].

Stxs, incluindo Stx2, consistem em uma única subunidade A e cinco subunidades B (toxina A1B5), nas quais a subunidade A possui atividade enzimática depurinando a adenina 4324 do rRNA 28S da subunidade do ribossomo 60S, enquanto as subunidades B são necessárias para ligar as células hospedeiras através da globotriaosilceramida (Gb3). Existem várias influências conhecidas que os Stxs exercem nas células. (I) Ao ligar-se ao seu receptor Gb3, a toxina provoca transdução de sinal através da quinase da família Src Sim [4,5]. Após a ligação ao receptor, os Stxs internalizam-se na célula por endocitose e são transportados retrógradamente para o RE. Os Stxs passam pelo endossomo e pelo aparelho de Golgi, onde a subunidade A é clivada entre os fragmentos catalíticos A1 e A2 do terminal C pela furina [6], embora os fragmentos A1 e A2 ainda estejam conectados por uma ligação dissulfeto. A toxina atinge o RE e a ligação dissulfeto pode ser reduzida; então, um fragmento A1 da holotoxina é liberado [7,8]. É quando a influência do (II) estresse de ER acontece com fragmentos de toxinas que imitam proteínas desdobradas, que induzem resposta proteica desdobrada (UPR). Ambas as subunidades A e B são capazes de se ligar a Bip, o que é indicativo de induzir estresse de ER [9,10]. O fragmento A1 clivado é translocado para o citoplasma e depura uma adenina do rRNA 28S para (III) inibir a síntese proteica. A modificação que Stxs causa no rRNA 28S induz (IV) resposta ao estresse ribotóxico (RSR), que ativa a cascata de sinalização a jusante [11]. Sabe-se que as influências (II) e/ou (IV) induzem (V) transcrição genética específica, levando à secreção de citocinas [12]. Além disso, (II) e (IV) estão envolvidos na (VI) apoptose induzida por Stxs [13–15].

Experimentos in vitro usando túbulos proximais humanos e modelos de camundongos in vivo conectam fortemente os danos tubulares proximais aos Stxs. Tanto as culturas primárias quanto as linhagens celulares dos túbulos proximais humanos são altamente suscetíveis a Stxs e exibem liberação de citocinas e morte celular, incluindo apoptose (16–20). As células epiteliais tubulares proximais renais primárias humanas (RPTECs) expressam o receptor Gb3, são altamente suscetíveis às toxinas Shiga e têm sido usadas em muitos artigos para analisar reações biológicas, como inibição da síntese protéica, produção de citocinas e indução de apoptose [17,20] . Camundongos injetados com toxina Shiga tipo 1 (Stx1) apresentaram glicosúria, o que indica menor reabsorção de glicose pelo túbulo proximal [21]. Isto sugere toxicidade de Stxs para os túbulos proximais tanto in vitro como in vivo. Em modelos de camundongos infectados por STEC, achados freqüentes na histopatologia são necrose de células epiteliais tubulares e células descamadas dentro do lúmen dos túbulos proximais [22–24]. Camundongos injetados com Stx purificado (Stx1 ou Stx2) também apresentam descamação dos túbulos proximais com núcleos relativamente intactos [25–27].

Embora os danos dos túbulos proximais associados à injeção de Stx ou à infecção por STEC tenham sido descritos funcionalmente e histologicamente, os alvos genéticos envolvidos na lesão dos túbulos proximais ainda não foram demonstrados.

Aqui analisamos expressões gênicas em rins de camundongos injetados com Stx2-e culturas de células epiteliais tubulares proximais renais primárias humanas (RPTEC) tratadas com Stx para mostrar alterações genéticas associadas ao túbulo proximal induzidas por Stx2.

2. Resultados

2.1. Stx2-Patologia renal de camundongo injetada

Para identificar a patologia renal murina associada a Stx{{0}}, seções de tecido renal de camundongos injetados com Stx2- foram coradas com ácido periódico de Schiff (PAS). Uma mancha rosa clara e forte no lado luminal das células epiteliais tubulares indica glicocálice da borda em escova, que é característico das células tubulares proximais. Determinamos células/núcleos fora do glicocálice (dentro do espaço luminal) como separados de células vizinhas e membranas basais (isto é, células descartadas). Na Figura 1B (8 h pós Stx2), C e D (48 h pós Stx2), células descartadas com núcleos relativamente intactos são mostradas com setas. Também observamos restos celulares dentro do lúmen tubular proximal (pontas de seta da Figura 1). Após a administração de Stx2, essas lesões apareceram com bastante clareza, enquanto às 0 h (Figura 1A, sem Stx2) eram insignificantes.

Figura 1. Stx2 induz a descamação de células tubulares proximais no rim murino. São mostradas manchas de ácido periódico de Schiff (PAS) de seções de rim murino injetadas com Stx2-. (A) 0 h (naïve), (B) 8 h e (C) 48 h após a injeção de Stx2. As setas indicam descamação das células tubulares proximais. As setas indicam restos celulares. Um campo ampliado dentro de (C) é mostrado em (D) com células descamadas apontadas com setas. Barras em (A – C) indicam 50 µm. A barra de escala em (D) indica 10 µ

2.2. Expressão de Gb3 em rins de camundongos e humanos

2.2.1. Expressão do córtex renal Gb3 do camundongo

Como as células tubulares proximais mostraram danos histológicos do insulto Stx2, testamos a expressão do receptor Stx2 globotriaosilceramida (Gb3) no córtex renal murino juntamente com um marcador tubular proximal aquaporina -1 (AQP1). Como mostrado na Figura 2, as células positivas para AQP1- exibiram positividade para Gb3 principalmente no lado luminal das células (as células são marcadas com pontas de setas fechadas, enquanto os lúmenes são marcados com asteriscos). Observamos também que as manchas tubulares Gb3 negativas para AQP1 presumivelmente coletam células ductais (Figura 2, ponta de seta aberta), conforme relatado [28]. A intensidade da coloração Gb3 foi mais forte nas células AQP1 (-), no entanto, o número deste tipo de túbulos foi menor em comparação com os túbulos proximais duplo-positivos Gb3 / AQP1 no córtex. Células endoteliais CD31-positivas são Gb3 negativas no rim de camundongo. Um controle de anticorpo correspondente ao isotipo para Gb3 (IgM de rato) foi utilizado como controle negativo. IgM de rato não reagiu com tecido renal de camundongo (Figura S1)

2.2.2. Expressão do córtex renal humano Gb3

No tecido renal humano, Gb3 também foi positivo em túbulos proximais positivos para AQP 1- (Figura 3, pontas de setas fechadas). A localização de Gb3 nas células tubulares proximais foi mais forte no lado luminal. Também observamos células AQP1(-)Gb3(+) (Figura 3, pontas de setas abertas), como fizemos no tecido murino. As células endoteliais humanas expressam Gb3 (CD31/Gb3 duplo positivo, Figura 3, asterisco). As seções de controle do isotipo com IgM de rato não mostraram reação positiva no tecido renal humano (Figura S2).

2.3. Análise de Microarranjos

Como as células epiteliais tubulares proximais de camundongos e humanas são positivas para Gb3, isso sugere que esse tipo de célula é afetado diretamente pelo Stx2. Para determinar genes2-afetados por Stx em células tubulares proximais murinas e humanas, extraímos RNA total dos rins de camundongos injetados com Stx2-e RPTECs primários humanos tratados com Stx2-e analisamos expressão genética por microarray

2.3.1. Genes diferencialmente expressos em rim de camundongo e RPTEC

Foram selecionados genes diferencialmente expressos (DEGs), que são comuns aos rins de camundongos e ao RPTEC. A base para a seleção de DEGs comuns é que (1) genes com alteração log2- vezes (contra 0 h) maior que 1 ou menor que -1 no rim de camundongo e no microarranjo RPTEC pelo menos em um- ponto de tempo e (2) distribuição da mudança log2- vezes de um gene se ajusta a curvas cúbicas em vez de curvas quadráticas para acomodar melhor os picos de expressão gênica no meio do tempo no microarranjo renal. Com os dois critérios acima, selecionamos 58 genes comuns entre o rim de camundongo tratado com Stx 2- e o RPTEC humano (Figura 4A). Os padrões de expressão destes 58 genes no rim do rato são mostrados num mapa térmico (Figura 4B). A maioria dos genes foi regulada positivamente nas últimas horas após a injeção de Stx2; no entanto, alguns genes tinham padrões de expressão anteriores. Os genes que tiveram mais de 1 mudança de log2- foram listados para cada ponto no tempo (Tabela 1).

Figura 4. Análise de microarranjos. (A) Entre os genes analisados ​​por microarranjo, 147 genes (circulados em verde) e 4013 genes (circulados em vermelho) de rim de camundongo tratado com Stx2-e RPTEC, respectivamente, foram detectados como tendo log{ {4}} vezes a alteração menor que -1 ou maior que 1. Os genes que foram alterados pelo tratamento Stx2 contra 0 h em ambos os microarranjos (genes/DEGs expressos diferencialmente comuns) totalizaram 58 (área sobreposta vermelha e verde). (B) O mapa térmico dos 58 genes comuns é mostrado na linha do tempo de amostragem de rim de camundongo. Z é igual a 0 denota uma média de valores de alteração log2-de um gene e reflete uma tendência de expressão gênica. Assim, uma cor esverdeada representa um valor inferior à média de um determinado gene consecutivo, enquanto uma cor avermelhada representa uma alteração acima da média. Os dados de registro 2-dobrados dos 58 genes do conjunto de dados de 72 horas injetado com PBS em comparação com 0 h são apresentados na Tabela S3 para referência. (C) O gráfico de barras de enriquecimento do Metascape GO é mostrado. O eixo X mostra valores −log10 p de termos GO enriquecidos em 58 DEGs comuns, onde um número maior de termos GO enriquecidos é mais provavelmente relevante para o sistema. Os 20 principais termos GO enriquecidos são mostrados. (D) A análise STRING de 58 DEGs comuns é mostrada nos seis clusters mais conectados/relacionados. As cores esféricas denotam genes pertencentes ao mesmo cluster. As relações de ações entre os genes são mostradas de maneira codificada por cores e formatos finais. ENSG00000279576 foi agora codificado como ENSP00000485396, que denota o ID humano do gene MALAT1.

Para analisar a funcionalidade dos DEGs comuns, utilizamos a plataforma Metascape. Ele atribui termos de Gene Ontology (GO), que consistem em função molecular, componente celular e processo biológico, a genes selecionados. Depositamos os 58 DEGs comuns no Metascape e obtivemos os 20 principais termos GO aos quais esses DEGs pertencem (Figura 4C). Os termos GO estão listados com os genes correspondentes na Tabela S1. Para ver uma lista de genes dentro de cada termo GO mostrado na Figura 4C, consulte a Tabela S2 de enriquecimento do Metascape. Os termos GO associados à morte celular, inflamação e cascatas de sinalização foram classificados entre os 20 primeiros, conforme esperado; no entanto, o ritmo circadiano chamou a atenção como um novo termo GO. Conexões conhecidas de genes comuns foram mostradas com análise STRING (Figura 4D). Nesta análise, os genes foram agrupados em seis grupos diferentes que foram contabilizados com uma forte associação de ligação, influências (catálise, ativação ou inibição), bem como coexpressão de genes.

2.3.2. Tendência da Expressão Gênica

Traços de várias expressões genéticas são mostrados em gráficos com eixo x para o tempo (h) após a injeção de Stx2 e o eixo y para mudança log2- vezes em relação a 0 h (Figura 5). Assim, o valor do eixo y é igual a 1 significa uma mudança de 2- vezes vs. 0 expressão h.

Figura 5. Genes expressos diferencialmente com cronograma de amostragem de camundongos. (A) Padrões de expressão de mRNA PDK4 e CEBPB são mostrados. (B) genes imediatos. (C) Expressões das proteínas matricelulares CYR61 (CCN1) e CTGF (CCN2). (D) São mostrados os genes DDIT3 (CHOP, GADD153), parceiro de ligação a DDIT3 CEBPB e fator de feedback negativo PPP1R15A (GADD34) relacionados à UPR. (E) São mostrados os fatores de transcrição DDIT3 (CHOP, GADD153) e ATF3 e GDF15, que são regulados transcricionalmente por esses fatores. (F) São mostrados genes associados a UPR e RSR. (G) EDN1 em relação aos genes UPR são plotados. (H) Os picos iniciais de EDN1 e EGR1 e o pico seguinte de PER1 são mostrados com um aumento gradual posterior em todos os três genes. (I) Os genes do cluster roxo da Figura 4D são genes relacionados ao ritmo circadiano. (J) Os genes centrais circadianos PER1, Arntl (BMAL1), Cry1 e Clock são mostrados. (K) São mostrados genes renais PER1 e regulados pelo relógio circadiano. (L) São mostrados genes inflamatórios com genes relacionados à via NF-kB. Para ver os pontos de dados log2 individuais, consulte a Figura Suplementar S4. A Figura S5, mostrando o log2 médio com barras de desvio padrão, é apresentada como referência.

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