Estudo sobre a função neuroendócrino-imune de Cistanche Deserticola e seus produtos de vapor de vinho de arroz em modelo de rato induzido por glicocorticóide-Ⅰ

1. Introdução

Cistanche deserticola, que é chamado de "ginseng do deserto", é uma medicina tradicional chinesa que tem sido usada há séculos como uma erva tônica yang pararevigorando os rins e fortalecendo o yang[1]. Oito espécies e uma variação deCistanche Herba foram registrados na China e apenasCistanche deserticolaYC Ma eCistanche tubulosa(Schenk) Wight estão registrados na Farmacopeia Chinesa [2]. Estudos farmacológicos demonstraram queCistanches Herbaexibiu neuroprotetor [3], imunomodulador [4], cardioprotetor [5], antifadiga [6], antiinflamatório [7], hepatoprotetor [8], antioxidante [9], antibacteriano [10], laxante [11] e antitumoral efeitos [12]. O vastoO espectro de atividades biológicas relatadas deste gênero tem sido atribuído à sua composição fitoquímica complexa e variada.Cistanche deserticolacontém glicosídeos feniletanoides, iridóides, polissacarídeos [13], etc. O conteúdo de glicosídeos feniletanóides é o mais alto nos materiais medicinais originais [14].

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O processamento de Matéria Médica Chinesa (CMM) é uma técnica farmacêutica tradicional para atender aos diferentes requisitos de tratamento, dispensação e preparação de acordo com a teoria da medicina tradicional chinesa. Esses produtos processados ​​são chamados de peças de decocção, que são utilizadas em clínicas. O processamento visa aumentar a eficácia para reduzir a toxicidade de medicamentos brutos. A Farmacopeia Chinesa de 2015 registrou que fatias grossas de Cistanche (CD) e Cistanche cozida no vapor com vinho de arroz (WCD) poderiam ser usadas como peças de decocção na clínica. Nosso grupo de pesquisa mostrou que o efeito laxante foi aliviado, e os efeitos antienvelhecimento e revigorantes do yang dos rins foram aumentados depois que Cistanche foi cozido no vapor com vinho de arroz [15].

A função do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal-glândula timo (HPAT) está desordenada na síndrome de deficiência de rim-yang [16]. Pacientes com deficiência de yang do rim também apresentam extensa disfunção imunológica. A disfunção do eixo HPA está intimamente relacionada à imunodeficiência. A teoria da rede neuroendócrina-imune (NEI) mostra que os sistemas imunológico e neuroendócrino compartilham muitos ligantes e receptores [17], e o hipotálamo é considerado o pivô para ligar o neuroendócrino ao sistema imunológico.

Neste estudo, replicamos a deficiência de yang do rim em ratos modelo com injeção exógena de corticosteróide e exploramos o mecanismo da deficiência de yang do rim em resposta a diferentes produtos processados ​​de Cistanche deserticola do ponto de vista da função endócrino-imune.

2. Materiais e métodos

2.1. Materiais e Reagentes

Cistanche deserticola foi coletada de Alashan Neimenggu em 2019.5 e identificada como caules carnudos secos de Cistanche deserticola YC Ma pelo Prof. Yanjun Zhai (Escola de Farmácia, Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Liaoning, China). Os espécimes de voucher foram preservados no Centro de Tecnologia de Engenharia de Processamento de Liaoning.

Os compostos padrão de ajugol foram adquiridos à Chengdu Pure Chem-Standard Co., Ltd. (Chengdu, China); cistanósido F,equinacosídeo, cistanosídeo A e isoacteosídeoforam adquiridos da Must Company (Sichuan China); o acteosídeo foi adquirido da Dalian Meilun Bio. Co., Ltd. (Dalian, China). Acetonitrila e metanol de grau MS foram adquiridos da Merck KGaA (Darmstadt, Alemanha). O ácido fórmico de grau HPLC foi adquirido da Merck KGaA (Darmstadt, Alemanha). O vinho de arroz foi adquirido da Zhejiang Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd.

Corticosterona (CAS: 50-22-6, pureza > 98%, TCI Shanghai Development Ltd. Co.), pílulas chinkuei shin chewan (Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd.), rato ACTH, CRH, T, IL{{ Os kits de detecção ELISA 2}}, IFN-c, TNF-, IL-2 e IL-10 foram adquiridos da Nanjing Jiancheng Co., Ltd. O kit ELISA de cortisol de rato foi fornecido pela BOSK Co., anticorpo CD4 de rato, anticorpo CD8a (nos. 561833 e 559976), lisado de RBC (Solarbio, R1010), solução tampão PBS (Solarbio, P1020-500), TRIzol (MAN0001271), CaM e iniciadores a montante e a jusante de -actina foram fornecidos pelo kit de transcrição reversa Guangzhou Invitrogen Co. (nº RR037A) e o kit de síntese de cDNA (nº 10000068167) foram fornecidos pela Bole Life Medicine Products (Shanghai) Co., Ltd. Clorofórmio, isopropanol, etanol a 75% e uretano As soluções eram todas analiticamente puras e produzidas pela Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. A água ultrapura foi produzida pelo sistema Milli-Q (18,2 MΩ, Millipore, MA, EUA).

2.2. Instrumentos Experimentais

Um marcador enzimático (Thermo, modelo 3530911931), lavador automático de placas (modelo HBS- 4009), medidor de força push-pull com display digital (modelo VICTOR- 50N), centrífuga de congelamento de alta velocidade (modelo Sigma 3k15 ), espectrofotômetro ultramicro (modelo B-50Q), amplificador genético (modelo L96G), PCR quantitativo de fluorescência em tempo real (modelo StepOne), citômetro de fluxo (modelo AC66051710132), micrótomo de parafina (modelo Laika), microscópio (Olympus , modelo BS-53) e um instrumento de água pura (modelo F7JA36507).

2.3. Preparação de amostras para UPLC-Q-TOF-MS e experimentos farmacológicos

WCD foi processado a partir do mesmo lote deCistanche deserticolaem nosso laboratório. Para a preparação do WCD, pedaços secos de CD (5 mm de espessura) (100 g) foram infundidos com vinho de arroz (30 mL), cozidos no vapor em alta pressão (1,25 kPa) por 4 h e depois secos a 55 graus.

Os pós grossos de CD e WCD foram embebidos em 10 vezes etanol a 95% por 0,5 h, extraídos por refluxo 3 vezes de cada vez por 1 h, e filtrados, e os filtrados 3 vezes foram combinados. O etanol foi recuperado sob pressão reduzida e o extrato foi obtido para administração. O extrato (1 mL) foi adicionado a metanol 50%, perfazendo o volume total para 20 mL, e armazenado a 4°C para análise de conteúdo.

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2.4. Condições UPLC-QqQ-MS para análise de extratos de CD e WCD

2.4.1. Condições Analíticas do LCThMS

O sistema UPLC-MSThMS com software MassLynx 4.1 Analyst foi utilizado para realizar a aquisição e processamento dos dados. A coluna analítica foi uma Acquity UPLC BEH C18 (1{{10}}0 mm × 2,1 mm, 1,7 μm) a uma temperatura de 40 graus C. A fase móvel foi 0,1% de solução aquosa de ácido fórmico (A) e acetonitrila contendo 0,1% de ácido fórmico (B). O gradiente de eluição foi de 0,00–1,00 min com 3% B, 1,01–2,00 min com 3%–11,5% B, 2,01–3.{{29 }} min com 12% B, 3,01–4.00 min com 15% B, 4,01–5.00 min com 20% B, 5,01–6.00 min com 22 % B, 6,01–8,00 min com 25% B e 8,01–9,00 min com 10% B. A vazão foi de 0,3 mLTh min e o volume de injeção foi de 1,0 μL.

O espectrômetro de massa triplo quádruplo Waters (Xevo TQD, Waters Corp., Milford, MA, EUA) equipado com uma fonte de ionização por eletrospray (ESI) foi utilizado no modo de íons negativos. O gás de dessolvatação foi nitrogênio com vazão de 500 LThh a uma temperatura de 250 graus. Todos os compostos detectados foram medidos no modo de monitoramento de reações múltiplas (MRM); A Tabela 1 apresenta os parâmetros energéticos e a Tabela 2 apresenta as curvas de calibração dos componentes analisados.

2.4.2. Preparação de Substâncias de Referência

Tubulósido A (3,02 mg), equinacósido (3,00 mg), 2′-acetilacteosídeo (2,34 mg), acteosídeo (2,45 mg), isoacteosídeo (0,61 mg), cistanosídeo F ( 2,14 mg), salidrosídeo (3,39 mg), ácido geniposidico (2,84 mg), ajugol (1,58 mg) e catalpol (2,39 mg) foram dissolvidos em metanol para preparar uma solução estoque. A solução estoque foi diluída com metanol para obter as concentrações apropriadas para as soluções padrão de trabalho. Todas as soluções preparadas foram armazenadas a 4 graus antes do uso.

2.5. Preparação e Agrupamento de Modelos Animais

Ratos machos SD (180-220 g) foram adquiridos à Liaoning Changsheng Biotechnological Co., Número de licença animal: SCXK (Liao) 2015-0001. Todos os ratos foram mantidos com livre acesso a comida e água a 25 graus e umidade relativa de 30–50%. Os animais foram alojados durante 7 dias antes dos experimentos.

Cem ratos foram divididos aleatoriamente em 10 grupos: grupo controle branco (BC), grupo controle modelo (MC), grupo controle positivo (PC), grupo controle vinho de arroz (WC), grupo CD alta dose (CD -HD), grupo de dose média de CD (CD-MD), grupo de dose baixa de CD (CD-LD), grupo de dose alta de WCD (WCD-HD), grupo de dose média de WCD (WCD-MD) e Grupo WCD de baixa dose (WCD-LD). As doses de CD-HDThWCD-HD, CD-MDTh WCD-MD e CD-LDThWCD-LD foram 5,48 gTh (kg ∙ d), 2,74 gTh (kg ∙ d) e 1,37 gTh (kg ∙ d), respectivamente. A dose para o grupo PC foi de 1,646 gTh(kg ∙ d), e para o grupo WC, 1 mLTh100 g por 40 dias. No 6º dia após a administração, os ratos foram injetados subcutaneamente com a suspensão aquosa de corticosterona (corticosterona + 0,1% de dimetilsulfóxido + 0,1% de Tween-80 + 0,9% de cloreto de sódio), exceto para o grupo BC [18]. A concentração de corticosterona foi de 5 gThL e a dose foi de 0,1 mLTh100 g. Os ratos do grupo BC receberam solução salina normal + 0,1% de dimetilsulfóxido + 0,1% de Tween- 80 + 0,9% de cloreto de sódio por injeção na mesma dose.

2.6. Determinação das funções do eixo HPA

2.6.1. Teste de peso, temperatura e poder de retenção

Um teste de peso foi realizado a cada 3 dias e a temperatura foi medida a cada 6 dias. durante o experimento. No 39º dia, a força máxima do membro posterior foi mensurada por meio de um medidor de preensão. Os ratos foram colocados em plataformas lisas, fazendo com que seus membros posteriores agarrassem o poste. Os ratos agarrarão instintivamente qualquer objeto para evitar mover-se para trás quando a cauda for puxada até que a força de tração exceda a aderência. Quando o rato perdesse a aderência, o pré-amplificador poderia registrar automaticamente a força máxima de aderência.

2.6.2. Determinação do nível de T, CRH, ACTH, CORT e cortisol no soro

Uma hora após a última administração, os ratos foram anestesiados por injeção intraperitoneal de solução de uretano (20 gTh100 mL). Em seguida, as amostras de sangue foram coletadas, centrifugadas a 3.500 r por 15 min para obtenção do soro e armazenadas a -20 graus. As concentrações de T, CRH, ACTH, CORT e cortisol foram medidas com kits ELISA para ratos de acordo com as instruções do fabricante.

2.6.3. Observações microscópicas

A estrutura morfológica do tecido da glândula adrenal foi observada pela coloração HE. O tecido adrenal foi fixado em paraformaldeído a 10%, desidratado em etanol, tornado transparente por solução de xileno, embebido por métodos convencionais, cortado em fatias de 4 μm de espessura, desparafinado com solução de xileno, hidratado com gradiente de etanol e depois corado com hematoxilina e eosina solução corante. Depois de transparente com xileno, a placa foi selada com goma neutra e observada ao microscópio.

2.6.4. Coloração imuno-histoquímica da expressão da proteína Bax, Bcl-2, Caspase-3, Fas e FasL na glândula adrenal

Seções adrenais de ratos fixadas em formalina e embebidas em parafina foram desparafinizadas e reidratadas após serem cortadas a uma espessura de 4 μm. Para o bloqueio da atividade da peroxidase endógena, os cortes foram pré-incubados em bloco de peróxido de hidrogênio por 10 min. As seções foram mergulhadas em citrato 0 0,01 M (pH 6,0) e aquecidas até a ebulição. O processo foi repetido após 5 a 10 minutos. Após resfriamento, as seções foram lavadas com PBS (pH 7,2–7,6) 1–2 vezes, deixadas em temperatura ambiente por aproximadamente 5 min e lavadas com PBS (pH 7,2–7,6) 2–3 vezes. A solução bloqueadora de BSA a 5% foi adicionada à temperatura ambiente e o excesso de líquido na seção foi sacudido 20 minutos depois. Anticorpos primários diluídos específicos para FasTh FasL, Bcl-2ThBax e caspase-3 (1:100 diluídos com PBS) foram adicionados e incubados a 37 graus por 1 h ou 4 graus durante a noite. As seções foram lavadas 2 a 3 vezes com PBS (pH 7,2 a 7,6). Em seguida, adicionou-se IgG de cabra anti-murganho biotinilado e as secções foram secas a 20-37 graus durante 20 min e lavadas com PBS (pH 7, 2-7, 6) 4 vezes durante 5 min. Após lavagem completa em PBS, os cortes foram incubados com uma mistura dos reagentes A e B por 30 min, incubados com PBS por 45 min e finalmente revelados com substrato DAB (DAKO) por 30 min antes de serem levemente contrastados com hematoxilina, desidratados, e montado.

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2.7. Determinação de funções imunológicas

2.7.1. Cálculo do Índice de Órgãos Imunológicos

Uma hora após a última administração, os ratos foram anestesiados por injeção intraperitoneal de solução de uretano (20 gTh100 mL) e, em seguida, o baço e a glândula timo foram removidos e pesados ​​imediatamente em capa estéril. Os coeficientes de peso do baço ou do timo (%) - peso do baço ou do timo (mg) Peso corporal (g).

2.7.2. Detecção de subconjuntos de linfócitos T no sangue periférico

Esplenócitos e hemócitos foram incubados com os anticorpos monoclonais anti-CD4 (PE) e anti-CD8 (FITC) durante 30 min no escuro. Foram adicionados 2 mL de lisado de eritrócitos e a solução foi misturada em vórtex. A solução foi deixada no escuro por 10 minutos e centrifugada por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e então a solução foi lavada 3 vezes com PBS gelado e ressuspensa em solução permeabilizante de PBS. Pelo menos 10{11}} células foram analisadas por citometria de fluxo dentro de 1 h após cada coloração com Mab.

2.7.3. Determinação do nível de IL-10, IL-6, IL-2, TNF- e IFN-c no soro

Uma hora após a última administração, os ratos foram anestesiados por injeção intraperitoneal de solução de uretano (20 gTh100 mL) e o sangue foi retirado da aorta abdominal. O sangue foi centrifugado a 3.500 r por 15 minutos para obtenção do soro e armazenado a -20 graus. As concentrações de IL-10, IL-6, IL-2, TNF- e IFN-c foram detectadas com kits ELISA de rato de acordo com as instruções do fabricante.

2.8. Expressão de CaM em tecidos do hipotálamo e da hipófise

O RNA total foi extraído dos tecidos do hipotálamo e da hipófise pelo TRIzol. A transcrição reversa foi realizada em 10 μL de RNA total de acordo com as instruções do fabricante. Quantidades iguais de cDNA foram analisadas via qPCR na presença de corante de ligação ao dsDNA (Promega, EUA) e o sistema de PCR em tempo real CFX 96 (Bio-Rad, EUA) para observar os diferentes genes sob as condições de ativação inicial em 95 graus por 10 min, 40 ciclos de desnaturação a 95 graus por 15 s e extensão de recozimento a 60 graus por 1 min.

Primers para CaM e -actina são apresentados na Tabela 1, e -actina foi usada como controle interno. Cada amostra foi normalizada usando a diferença nos limiares críticos (Ct) entre o gene alvo e a -actina. A seguinte equação foi usada para descrever o resultado: ΔΔCt � (gene alvo Ct − gene Ct -actina) grupo experimental − (gene alvo Ct − gene Ct -actina) grupo controle. Os níveis de mRNA de cada amostra foram então comparados, usando a expressão 2- gene alvo ΔΔCt. Os resultados de cada grupo foram calculados (Tabela 3).

2.9. Análise Estatística

Todos os dados foram analisados ​​utilizando o software SPSS (versão 19.0, SPSS Institute Inc., Chicago, IL). As diferenças entre os grupos foram analisadas com análise de variância de medidas repetidas unilaterais (ANOVA). Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão (DP) utilizando o software GraphPad Prism (versão 6.0, San Diego, CA, EUA). Diferenças com valor P inferior a 0,05 foram consideradas estatisticamente significativas.

3. Resultados Experimentais

3.1. Análise UPLC-QqQ-MS

Para obter a melhor separação, formato de pico e um curto tempo de análise, as condições cromatográficas incluindo coluna, fase móvel e programa de gradiente foram estudadas em nosso experimento preliminar. Os cromatogramas típicos com modo MRM são apresentados na Figura 1.

Na Tabela 4, podemos observar que o conteúdo de glicosídeos feniletanóides no WCD aumentou em comparação aos do CD, especialmente para equinacosídeo e acteosídeo, enquanto o conteúdo de iridóides diminuiu no WCD.

3.2. Regulamento para Função do Eixo HPA

3.2.1. Teste de peso, temperatura e poder de retenção

Os ratos do grupo MC e dos grupos experimentais apresentaram sintomas de deficiência de yang do rim gradualmente após receberem corticosterona. Os sintomas, como perda de peso, hipotermia, perda de brilho do cabelo, desânimo, atraso na resposta e uma diminuição significativa no consumo de água e atividade, melhoraram muito nos grupos CD e WCD. A Figura 2 (a) mostra as mudanças de peso. O peso de cada um dos grupos de medicamentos aumentou, especialmente nos grupos CDHD e WCD-HD. O ganho de peso no grupo MC foi o menor. A Figura 2 (b) mostra as mudanças de temperatura, que foram as mais baixas no grupo MC, e a temperatura aumentou nos grupos WCD-HD, WCD-MD e WCD-LD.

A Figura 2 (c) mostra que o poder de retenção aumentou para o grupo BC e cada um dos grupos experimentais, e o grupo WCD-MD foi o mais alto, o que demonstrou que os sinais de fraqueza induzidos pela deficiência de yang do rim melhoraram após a administração.

3.2.2. Níveis de T, CRH, ACTH, CORT e Cortisol

A Figura 3 mostra que, em comparação com os do grupo BC, o nível de T, CRH, ACTH e CORT no soro de rato diminuiu (P < 0.01) e o nível de cortisol diminuiu (P < 0.05) no grupo MC. Em comparação com os do grupo MC, o nível de T nos grupos WCD-HD e WCD-MD aumentou (P <0.01), o nível de CRH no WCD-LD, Os grupos WCD-MD e WC melhoraram (P <{24}},01), o conteúdo de ACTH aumentou nos grupos CD-HD, WCD-MD e WCD-HD (P <0,01), o nível de CORT aumentou nos grupos Grupos CD-MD, WCD-MD e WCD-HD (P <0,01) e aumentados nos grupos CDHD e WCD-LD (P <0,05), e o nível de cortisol aumentou em cada um dos grupos de medicamentos.

3.2.3. Resultados da observação microscópica

O tecido da glândula adrenal pode ser dividido em camada cortical e camada medular. As camadas corticais incluem camadas globulares, em feixe e reticulares. As células contêm mais lipídios e a camada medular consiste principalmente de células de feocromocitoma e uma pequena quantidade de tecido fibroso. Conforme mostrado na Figura 4, descobrimos que tudo estava normal no grupo BC, enquanto no grupo MC o córtex adrenal apresentava hiperplasia óbvia, atrofia celular e aumento de densidade. A faixa bulbosa engrossou e a zona fascicular translúcida, a zona reticular estreita e as células menores apresentaram coloração irregular e congestão capilar. No grupo PC, os limites corticais e medulares eram visíveis. As células das bandas globulares e em feixe foram dispostas uniformemente e a estrutura morfológica foi restaurada. A mesma melhor restauração foi observada nos grupos WCD, e os efeitos no grupo WCD-MD foram melhores que os dos grupos WCD-HD e WCD-LD. A morfologia da glândula adrenal nos grupos CD não foi tão boa quanto nos grupos WCD.

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