Estudo dos efeitos antienvelhecimento do calcitriol em células assassinas naturais humanas in vitro Ⅱ

3. Resultados

Este estudo se concentrou nos efeitos antienvelhecimento do calcitriol nas células NK. Os resultados mostraram que o Calcitrioldiminuiu a expressão de biomarcadores relacionados ao envelhecimento, incluindo CD16, TIM3, PD-1, KIR eaumentou a expressão de NKG2A de células NK. isso tambéminibiu a proliferação de células NKeprendê-los na fase G1. Calcitrioldiminuiu a liberação de fatores inflamatórioscomo IL-5, IL-13, IFN- e TNF- e tinham certosefeitos antioxidantes, o que pode contribuir para a suaefeitos antienvelhecimento.

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3.1 O calcitriol reverteu a expressão dos marcadores de envelhecimento superficial, retardou a amplificação das células NK e manteve as células NK na fase G1.

As células NK senescentes apresentaram alta expressão de biomarcadores relacionados ao envelhecimento, como CD16, PD-1, TIM3 e KIR, e baixa expressão de NKG2A. Descobrimos que os níveis de expressão dos biomarcadores relacionados ao envelhecimento NKG2A (Figura 1a) (*P < 0.05) aumentaram, enquanto a expressão de CD16 (Figura 1b), TIM3 (Figura 1c ), PD-1 (Figura 1d) e KIR (Figura 1e) (*P < 0,05) diminuíram após tratamento com calcitriol por 72 h. Os efeitos de reversão foram positivamente correlacionados com a concentração de calcitriol (Suplementar Figura 1).

Nós expandimos as células das amostras de sangue periférico humano in vitro. Em seguida, isolamos as células NK (CD{{0}}CD56 plus ) por classificação de esferas magnéticas (figura 1f). As células NK selecionadas foram então cultivadas com diferentes concentrações de calcitriol ou rapamicina por 72 h. Os resultados da coloração CCK8 mostraram que a taxa de crescimento das células NK tratadas com calcitriol de alta concentração (10− [7] M) foi mais lenta do que a do grupo de controle negativo (NC) (*P <{{17 }}.05) (Figura 1g). Além disso, o calcitriol regulou o ciclo celular NK. Após o tratamento com calcitriol por 48 h, as células NK mostraram um deslocamento dependente da concentração de calcitriol em direção à fase G1 (*P < 0,05), enquanto a proporção de células na fase G2 (#P < 0,05) diminuiu. A proporção de células NK tratadas com calcitriol na fase S não apresentou alteração, independentemente da concentração de calcitriol (Figura 1h, Figura complementar 2). Em seguida, testamos se essa parada de fase G1 derivada de calcitriol induzia apoptose de células NK e descobrimos que o biomarcador apoptótico de células NK, imunoglobulina de células T e domínio de motivo inibidor baseado em tirosina imunorreceptor (ITIM) (TIGIT), não mostrou alteração significativa (P> 0,05 , NS) (Figura 1i). Esses resultados implicaram que a adição de calcitriol reduziu a taxa de crescimento das células NK, diminuiu sua proliferação e induziu a parada da fase G1 das células NK em vez de causar apoptose.

3.2 O calcitriol diminuiu a liberação de citocinas inflamatórias nas células NK e inibiu a citotoxicidade das células NK

Inflammaging é uma inflamação crônica de baixo grau. Acelera o envelhecimento das células NK, pois as células NK participam dessa inflamação crônica. A Figura 2a demonstra que os níveis de IL-5, IL-13, IFN- e TNF- diminuíram significativamente em todos os grupos do que no controle negativo (*P < 0,05). IFN- e TNF- são citocinas pró-inflamatórias bem conhecidas, mas alguns estudos também mostraram as propriedades pró-inflamatórias do IL-5. Foi relatado que a IL-13 contribui para diferentes tipos de inflamação da mucosa, como asma alérgica, colite ulcerativa, esofagite eosinofílica e várias doenças relacionadas à fibrose.

No entanto, a citotoxicidade das células NK envolve principalmente a liberação de citocinas inflamatórias e a degranulação das células. Marcamos células K562 com DIO e co-cultivamos as células DIO-K562 com células NK tratadas com calcitriol por 4 h. A porcentagem de células DIO mais PI mais foi menor em todos os grupos de razão efetora (E)/alvo (T) do que no controle negativo (*P <0.05) (Figura 2b, c). A expressão deduzida do agrupamento de diferenciação 107 (CD107) indicou menor desgranulação (*P < 0,05) (Figura 2d). Estes resultados mostram a inibição da função de matar NK pelo calcitriol.

3.3 O calcitriol ativou a expressão de SIRT1- ∆Exon8 e a via SIRT1/pERK relacionada ao antienvelhecimento

Para investigar os efeitos antienvelhecimento do calcitriol nas células NK, detectamos as vias de sinalização relacionadas ao envelhecimento por imunotransferência. A análise de Western blotting foi realizada para avaliar os níveis de expressão de VDR, SIRT1-∆Exon8, SIRT1 e PERK nas células NK tratadas com calcitriol. A análise estatística mostrou que o calci triol ativou o eixo VDR/SIRT1/pERK em altas concentrações. Enquanto isso, o calcitriol ativou a expressão de SIRT1-∆Exon8 (*P < 0.05). (Figura 3a).

Figura 1. Fenótipo relacionado ao envelhecimento, expansão celular e análise do ciclo celular das células NK. (ae) As células NK humanas tratadas com calcitriol ou rapamicina por 72 h mostraram os seguintes biomarcadores celulares: natural killer grupo 2 membro A (NKG2A), cluster de diferenciação 16 (CD16), imunoglobulina de células T e proteína contendo domínio mucina 3 ( TIM3) morte celular programada-1 (PD-1) e receptor do tipo imunoglobulina assassino (KIR), que estavam relacionados ao envelhecimento. 50 nM de rapamicina (RAPA) foi usado como controle positivo. n=3 para cada grupo. *P < 0.05 e **P < 0.01 foram comparados com o grupo de controle negativo (NC). (f) Células NK (à direita) isoladas de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs, à esquerda) por separação de contas magnéticas. (g) Análise de proliferação celular medida pelo kit de contagem de células 8 (CCK8). (h) Efeito de calcitriol ou rapamicina no ciclo celular em células nk classificadas após tratamento por 72 h, wp 0.0, 00,05 e fp <0,05 indicaram a significância diferenças nas fases G1, S e G2, respectivamente. Todos os grupos foram comparados com NC, respectivamente. n=3. ) A porcentagem de globulina imunológica de células T e células NK positivas com domínio (TGI) de motif(M) inibitório baseado em imunorreceptor de tirosina após tratamento com calcitriol ou rapamicina por 72 h.*p < 0,05 e **p < 0,01 foram comparadas com NC. n=3.

3.4 O calcitriol resistiu ao envelhecimento das células NK induzido pelo estresse oxidativo in vitro

É amplamente aceito que o envelhecimento é causado pelo acúmulo de dano oxidativo devido ao grande corpo de evidências encontradas ao longo dos anos [31]. Cultivamos as células NK com diferentes concentrações de H2O2 por 24 horas e descobrimos que 1{{1{{20}}}0 μM era a concentração mais próxima da dose letal mediana (LD50) (Figura 3b) . A expressão de TIM3 na população de células NK aumentou com a adição de H2O2, enquanto a expressão diminuiu após o tratamento com calcitriol (*P < 0,05) (Figura 3c). Além disso, as células NK envelhecidas foram coradas de azul na presença de -galactosidase. Esta cor azul das células é uma característica específica das células senescentes. A análise estatística demonstrou que as células NK não tratadas têm menos atividade celular de -galactosidase, enquanto as células NK expostas a H2O2 apresentaram atividade elevada de -galactosidase. O calcitriol reduziu a população - galactosidase positiva, indicando a presença de menos células envelhecidas (*P < 0,05) (Figura 3d). A diminuição do potencial de membrana mitocondrial também foi observada em uma variedade de células envelhecidas de várias espécies de mamíferos. Avaliamos o potencial de membrana mitocondrial das células NK neste estudo. Os resultados estatísticos mostraram que o H2O2 diminuiu significativamente a atividade celular das células NK em comparação com as células não tratadas, enquanto o calcitriol aumentou o dano causado pelo H2O2 (*P < 0,05) (Figura 3e).

Figura 2. Efeitos do calcitriol nas funções das células NK. (a) Análise da citocina liberada pelas células NK tratadas com calcitriol em 48 h. b) Os resultados da separação celular ativada por fluorescência (FACS) mostraram células K562 mortas marcadas por 3,3 -octadecil-oxacarbocianinaDlO) e iodeto de propídio (P). As células K562 foram co-cultivadas com diferentes proporções de células Nk tratadas com calcitriol por 4h. (C) Análise FACS de células K562 mortas em ensaios de morte. (d) Os efeitos de degranulação de células Nk tratadas em ensaios de morte. n=3 para cada grupo. *p < 0.05 e **p < 0,01 foram comparados com NC

3,5 Calcitriol resistiu à apoptose de células NK induzida por estresse oxidativo in vitro

Em seguida, medimos o número de células apoptóticas. Os resultados da citometria de fluxo mostraram que o tratamento com 100 μM H2O2 por 24 h levou a apoptose significativa das células NK. No entanto, o tratamento com calcitriol diminuiu a taxa apoptótica (*P < 0,05) (Figura 4a). Todos os resultados acima demonstraram a resistência do calcitriol contra o estresse oxidativo causado pelo H2O2. No entanto, detectamos proteínas apoptóticas em células NK sob estresse oxidativo. Antes do tratamento com H2O2, calcitriol 10− [7] M foi adicionado às células NK por 24 h. Os níveis de proteínas relacionadas à apoptose, caspase-3 p17 e caspase-3 p20, aumentaram significativamente após o tratamento com H2O2. O calcitriol diminuiu a apoptose derivada de H2O2-e regulou negativamente a expressão de caspase-3, p17 e caspase-3 p20 (*P < 0,05) (Figura 4b). Esses resultados indicaram que o calcitriol resistiu à apoptose induzida por H2O2.

Figura 3. Oefeitos antienvelhecimentode calcitriol nas células NK. (a) A expressão do receptor de vitamina D (VDR), sirtuína 1 (SIRT1), SIRT1- ∆Exon8 e proteína quinase R-like retículo endoplasmático quinase (pERK) em células NK foi detectada por análise de western blotting após tratamento com calcitriol por 48 h. Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) foi usado como controle de carregamento. Diagrama de barras ilustrando os resultados do western blotting (n=3). *P < 0.{{10}}5 e **P < 0.01 foram comparados com NC (n=3). (b) Curva de mortalidade de dosagem de células NK após tratamento com peróxido de hidrogênio (H2O2) por 24 h. (c) Porcentagem de células TIM3 exibindo alta expressão após tratamento com 100 μM de H2O2 por 24 h. (d) Resultados da coloração e análise da -galactosidase associada à senescência. As células senescentes foram coradas em azul e indicadas por setas vermelhas. Barra de escala, 50 μm. (e) As células NK foram coradas com Hoechst e Clorometil-X-Rosamina (CMXRos) para determinar a localização celular e o potencial de membrana mitocondrial. As células envelhecidas e apoptóticas eram Hoechst mais CMXRos- e indicadas por setas brancas. Barra de escala, 50 μm. A análise estatística mostrou intensidade de fluorescência relativa. *P < 0,05 e **P < 0,01 foram comparados com o grupo H2O2 nas figuras C, D e E (n=3).

Figura 4. Os efeitos antiapoptóticos do calcitriol nas células NK. (a) Efeitos antiapoptóticos do calcitriol na lesão induzida por H2O2-. A análise FACS mostrou a porcentagem de células NK apoptóticas após o tratamento com 100 μM H2O2 por 24 h. (b) Os níveis de expressão de caspase-3 p20 e caspase-3 p17 em células NK foram detectados por análise de western blotting após tratamento com 100 μM H2O2 por 24 h. GAPDH foi usado como controle de carga. Diagrama de barras ilustrando os resultados do western blotting (n=3). *P < 0,05 foi comparado com o grupo H2O2.

4. Discussão

A interação de longo prazo entre a inflamação e o estresse oxidativo é um fator importante no envelhecimento. Além disso, a inflamação e o estresse oxidativo são sinérgicos [32]. O excesso de ERO gerado pelo estresse oxidativo ataca as células do corpo. Durante este processo, os fatores inflamatórios são liberados pelo sistema imunológico ativado para matar as células anormais, o que leva a uma maior geração de ROS. A falta de calcitriol pode causar doenças autoimunes, doenças metabólicas crônicas e tumores. No entanto, pouco se sabe sobre os efeitos antienvelhecimento do calcitriol no sistema imunológico, especialmente nas células NK.

Neste estudo, investigamos os efeitos antienvelhecimento do calcitriol nas células NK. Descobrimos que o calcitriol aumentou a expressão de NKG2A, enquanto diminuiu a expressão de KIR in vitro. A subpopulação CD56- CD16 plus de células NK, que é conhecida por estar relacionada à inflamação crônica, é significativamente aumentada em idosos [33]. Portanto, a redução na expressão de CD16 induzida pelo calcitriol pode ser atribuída ao seu efeito anti-inflamatório. TIM-3 e PD-1 foram relatados como os receptores inibitórios e de depleção das células NK. Nosso estudo mostrou que cal citriol regulou negativamente os níveis de expressão de TIM-3 e PD-1 e preveniu a apoptose de células NK.

Além disso, o calcitriol inibiu a expansão das células NK e manteve a população de células NK na fase G1 in vitro. No entanto, as células na fase S não foram afetadas. O TIGIT, conhecido como fator de checkpoint das células NK, permaneceu inalterado. Esses resultados indicaram que Figura 4. Os efeitos anti-apoptóticos do calcitriol nas células NK. (a) Efeitos anti-apoptóticos do calcitriol na lesão induzida por H2O2-. A análise FACS mostrou a porcentagem de células NK apoptóticas após o tratamento com 100 μM H2O2 por 24 h. (b) Os níveis de expressão de caspase-3 p20 e caspase-3 p17 em células NK foram detectados por análise de western blotting após tratamento com 100 μM H2O2 por 24 h. GAPDH foi usado como controle de carga. Diagrama de barras ilustrando os resultados do western blotting (n=3). *P < 0,05 foi comparado com o grupo H2O2. O calcitriol 6851 da BIOENGINEERED não levou à morte das células NK, mas apenas diminuiu a taxa de expansão das células NK.

É bem conhecido que a inflamação leva à imunossenescência [34,35]. Além disso, descobrimos que o calcitriol reduziu os níveis de IL-5, IL-13, IFN- e TNF- nas células NK. A citotoxicidade das células NK é parcialmente mediada pela liberação de fatores inflamatórios [36]. Além disso, houve diminuição da mortalidade das células tumorais K562 e da degranulação das células NK. Estes resultados estiveram de acordo com as nossas expectativas. A rapamicina é um medicamento bem conhecido que reduz a taxa metabólica para prevenir o envelhecimento [37], que é usado como controle positivo neste estudo. Isso resulta em imunossupressão e aumenta o risco potencial de tumor e carga tumoral. Esta carga foi confirmada em modelos de camundongos de câncer de mama [38]. Ainda não se sabe se o calcitriol exibe efeitos semelhantes aos da rapamicina. Mais estudos em animais e clínicos devem ser realizados para verificar seus efeitos no corpo humano.

Finalmente, estudamos os efeitos do calcitriol na senescência antioxidante. O resveratrol, um conhecido medicamento antienvelhecimento, pode regular negativamente a via NF-κB ativando o eixo SIRT1/PERK. Essa regulação negativa também demonstrou ser benéfica em distúrbios neurodegenerativos e doenças cardiovasculares [39]. A desacetilação da SIRT1 está associada ao controle metabólico e à biogênese mitocondrial. Nesse tipo de regulação, níveis elevados de SIRT1 podem promover o acúmulo do coativador gama do receptor ativado por proliferadores de peroxissoma -1 alfa (PGC-1 ) no núcleo, o que resulta na transcrição de genes necessários para função mitocondrial [40]. Além disso, o SIRT1 suprime o alvo mamífero da via de sinalização da rapamicina (mTOR), que pode proteger os nervos e resistir ao envelhecimento cerebral em camundongos [41]. Neste estudo, identificamos uma via regulatória semelhante para o calcitriol. Calcitriol ativou SIRT1 via VDR e elevou o eixo SIRT1/pERK.

Além disso, descobrimos que o calcitriol regulou positivamente a expressão de SIRT1-∆Exon8. Estresses são conhecidos como um fator de regulação positiva de SIRT1-∆Exon8. Embora o próprio SIRT1-∆Exon8 exiba atividade reduzida de desacetilação de p53, ele exerce um efeito de desacetilação aditivo em p53 quando expresso em conjunto com SIRT1 completo [42]. Este efeito indicou a função anti-apoptótica do calcitriol nas células NK. No entanto, o papel do SIRT1-∆Exon8 nas vias relacionadas à idade ainda precisa ser melhor compreendido. Como o declínio de SIRT1 pode ser devido a danos oxidativos [43], estabelecemos um modelo de células NK de envelhecimento agudo in vitro usando H2O2. O envelhecimento oxidativo induzido por H2O2 aumentou a expressão de TIM3, bem como a atividade de -galactosidase em células NK. Descobrimos que o calcitriol resistiu ao dano oxidativo e manteve a atividade mitocondrial e a viabilidade celular das células NK, evitando a apoptose celular. No entanto, o calcitriol ainda não foi identificado como um medicamento antienvelhecimento na medicina clínica, pois são necessárias mais evidências sobre os efeitos antienvelhecimento desse medicamento in vivo. Em resumo, fornecemos evidências preliminares para implicar os efeitos antienvelhecimento do calcitriol nas células NK in vitro. Acreditamos que os efeitos desta droga devem ser mais explorados em futuros estudos clínicos e animais.

5. Conclusão

Neste estudo, demonstramos aefeitos antienvelhecimentode calcitriol nas células NK. O calcitriol reverteu a expressão debiomarcadores de envelhecimentonas células NK. Ele desacelerou a amplificação NK e os manteve na fase G1. Além disso, o calcitriol inibe a liberação de citocinas inflamatórias e diminui a degranulação das células NK. A ativação do eixo SIRT1-∆Exon8 e VDR/SIRT1/pERK pelo calcitriol pode ser o principal mecanismo do efeito antienvelhecimento do calcitriol com base em todos os itens acima. Finalmente, o calcitriol resistiu à senescência oxidativa das células NK in vitro. Novos estudos devem se concentrar em pesquisa animal e clínica.

Destaques

(1) O calcitriol diminuiu a expressão de biomarcadores relacionados ao envelhecimento, incluindo CD16, TIM3, PD-1, KIR, e aumentou a expressão de NKG2A de células NK. (2) O calcitriol foi capaz de inibir a proliferação das células NK e prendê-las na fase G1. (3) O calcitriol diminuiu a liberação dos principais fatores inflamatórios, como IL-5, IL-13, IFN- e TNF- das células NK.(4) O efeito antienvelhecimento do calcitriol nas células NK pode ser alcançado através da via de sinal Sirt1- pERK.

Agradecimentos Gostaríamos de agradecer a todos os membros da equipe de nosso grupo por seu apoio e ao Comitê de Inovação em Ciência e Tecnologia de Shenzhen por seu apoio financeiro para este estudo.

Financiamento Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo Comitê de Inovação em Ciência e Tecnologia de Shenzhen (JCYJ20170412155231633), Fundo de Construção de Disciplina Médica Chave de Shenzhen (No. SZXK062), Chengdu Wecistanche Biotech e o Projeto Sanming de Medicina em Shenzhen (No. SZSM202011010); Comitê de Inovação em Ciência e Tecnologia de Shenzhen [JCYJ20170412155231633]; Fundo de Construção de Disciplina Médica Chave de Shenzhen [No. SZXK062]; Projeto Sanming de Medicina em Shenzhen [No. SZSM202011010].

Aprovação da ética Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética do Shenzhen Luohu People's Hospital (ZLNK 12/2019, Shenzhen, China). O consentimento informado foi obtido para experimentação com amostras humanas.

Declaração de divulgação Todos os autores aprovaram a submissão deste manuscrito. Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes conhecidos ou relações pessoais que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.

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