A espermidina alivia o dano mitocondrial miocárdico recém-nascido induzido por hipóxia intrauterina em ratos, inibindo o estresse oxidativo e regulando o controle de qualidade mitocondrial parte 1

Abstrato

Fundo: A hipóxia intrauterina (IUH) aumenta o risco de doenças cardiovasculares na prole. Como um eliminador de espécies reativas de oxigênio (ROS), a poliamina espermidina (SPD) é essencial para a sobrevivência e crescimento embrionário e fetal. No entanto, são necessários mais estudos sobre a proteção do SPD e os mecanismos de danos cardíacos induzidos por IUH na prole.

O glicosídeo de cistanche também pode aumentar a atividade de SOD nos tecidos do coração e do fígado e reduzir significativamente o conteúdo de lipofuscina e MDA em cada tecido, eliminando efetivamente vários radicais reativos de oxigênio (OH-, H₂O₂, etc.) e protegendo contra danos ao DNA causados por radicais OH. Os glicosídeos feniletanóides Cistanche têm uma capacidade robusta de eliminação de radicais livres, uma capacidade redutora maior que a vitamina C, melhoram a atividade de SOD na suspensão de esperma, reduzem o conteúdo de MDA e têm um certo efeito protetor na função da membrana espermática. Os polissacarídeos Cistanche podem aumentar a atividade de SOD e GSH-Px em eritrócitos e tecidos pulmonares de camundongos experimentalmente senescentes causados ​​por D-galactose, bem como reduzir o conteúdo de MDA e colágeno no pulmão e no plasma e aumentar o conteúdo de elastina, têm um bom efeito de eliminação no DPPH, prolongar o tempo de hipóxia em camundongos senescentes, melhorar a atividade de SOD no soro e retardar a degeneração fisiológica do pulmão em camundongos experimentalmente senescentes Com degeneração morfológica celular, experimentos mostraram que Cistanche tem boa capacidade antioxidante e tem potencial para ser um medicamento para prevenir e tratar doenças de envelhecimento da pele. Ao mesmo tempo, o echinacoside em Cistanche tem uma capacidade significativa de eliminar os radicais livres DPPH e tem a capacidade de eliminar espécies reativas de oxigênio e prevenir a degradação do colágeno induzida por radicais livres, e também tem um bom efeito de reparo nos danos causados ​​pelos radicais livres da timina.

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Objetivos: Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos preventivos do tratamento pré-natal com SPD em danos cardíacos induzidos por IUH em ratos recém-nascidos e seu mecanismo mitocondrial subjacente.

Métodos: O modelo de IUH em ratos foi estabelecido pela exposição a 10 por cento de O2 sete dias antes do termo. Enquanto isso, durante sete dias, as ratas grávidas receberam SPD (5 mg.kg-1.d-1; ip). Os ratos descendentes de um dia foram sacrificados para avaliar vários parâmetros, incluindo desenvolvimento do crescimento, dano cardíaco, proliferação de cardiomiócitos, estresse oxidativo miocárdico, apoptose celular e função mitocondrial, e controle de qualidade mitocondrial (MQC), incluindo mitofagia, biogênese mitocondrial e fusão/fissão mitocondrial. Em experimentos in vitro, os cardiomiócitos primários foram submetidos à hipóxia com ou sem SPD por 24 horas.

Resultados: IUH diminuiu o peso corporal, o peso do coração, a expressão cardíaca de Ki67, a atividade de SOD e os níveis de CAT e adenosina 5'-trifosfato (ATP) e aumentou a expressão de BAX/BCL2 e o número de núcleos TUNEL-positivos. Além disso, IUH também causou anormalidade da estrutura mitocondrial, disfunção e diminuição da mitofagia (diminuição do número de mitofagossomas), diminuição da biogênese mitocondrial (diminuição da expressão de SIRT-1, PGC-1 , NRF-2 e TFAM) e levou a um desequilíbrio de fissão/fusão (aumento da porcentagem de fragmentos mitocondriais, aumento da expressão de DRP1 e diminuição da expressão de MFN2) no miocárdio. Surpreendentemente, o tratamento SPD normalizou as variações nos parâmetros induzidos por IUH. Além disso, o SPD também preveniu o acúmulo de ROS induzido por hipóxia, a deterioração do potencial de membrana mitocondrial e a diminuição da mitofagia em cardiomiócitos.

Conclusão: O tratamento materno com SPD causou danos cardíacos induzidos por IUH em ratos recém-nascidos, melhorando a função mitocondrial miocárdica via anti-oxidação e anti-apoptose e regulando o MQC.

1. Fundo

Estudos epidemiológicos e em animais indicam que um ambiente intrauterino adverso está associado a um risco aumentado de doenças cardiovasculares na idade adulta (1). A hipóxia pré-natal, o ambiente intra-uterino adverso mais comum, pode tornar o feto incapaz de realizar seu potencial de crescimento geneticamente determinado, manifestado como retardo de crescimento e lesão da função orgânica na gestação(2). A hipóxia fetal crônica geralmente resulta de gravidez com aumento da resistência vascular placentária, como pré-clâmpsia, intergestação em altitude elevada ou doenças respiratórias maternas. Mais significativamente, um terço delas são afetadas pela síndrome de hipoventilação da apnéia obstrutiva do sono (SAHOS) no final da gravidez, e também está associada ao desenvolvimento da síndrome de hipertensão gestacional. A alteração fisiopatológica mais crítica da SAHS é a hipóxia intermitente crônica (3, 4). Em vários modelos animais, a hipóxia intrauterina (HIU) leva à redução da eficiência cardíaca, disfunção diastólica e sistólica, crescimento hipertrófico, diminuição da proliferação de cardiomiócitos e retardo na maturação dos cardiomiócitos no coração fetal e neonatal, aumentando assim o risco de doenças cardíacas na prole adulta. 5). O efeito de programação da hipóxia crônica pode explicar principalmente o mecanismo em estágios críticos do desenvolvimento do coração, o que leva ao aumento do estresse oxidativo cardíaco e aumento da apoptose celular na prole (6-9). O conceito de programação de desenvolvimento faz sentido porque nossa fisiologia é muito mais maleável e plástica durante o início da vida. A condição intrauterina determina e programa os conceitos de fisiologia e metabolismo que compõem nossa vida. Consequentemente, a resposta adaptativa fetal ao IUH leva ao desenvolvimento de doenças cardiovasculares no adulto (10). As mitocôndrias são organelas complexas que desempenham papéis cruciais na geração de energia celular e uma miríade de eventos de sinalização celular. A integridade estrutural e funcional das mitocôndrias é crítica para a sobrevivência dos cardiomiócitos e, quando comprometida, a interrupção da homeostase mitocondrial resulta no desenvolvimento de doenças carac. Recentemente, vários estudos se concentraram no papel da disfunção mitocondrial indutora de hipóxia pré-natal crônica na mediação de danos cardíacos na prole. Foi relatado que essa função mitocondrialiratória foi prejudicada, e a expressão de várias regras moleculares mitocondriais alterou o coração perinatal exposto ao IUH (11). Além disso, IUH leva à diminuição da atividade enzimática do complexo mitocondrial e disfunção da fatia do coração na prole posterior após isquemia miocárdica (12). Assim, este estudo teve como objetivo descobrir a ligação molecular entre hipóxia pré-natal, estresse oxidativo, disfunção mitocondrial e lesão cardíaca em recém-nascidos (13).

O desenvolvimento e a maturação deste sistema mitocondrial de alto volume no miocárdio ocorrem principalmente nas fases de desenvolvimento perinatal e pós-natal, principalmente devido ao deslocamento metabólico cardíaco do uso de glicose ou ácidos graxos para a geração de adenosina 5'-trifosfato (ATP) após o nascimento (14). Evidências emergentes sugerem que os mecanismos de controle de qualidade mitocondrial (MQC) são determinantes críticos para a maturação dos cardiomiócitos (15). O controle de qualidade mitocondrial, incluindo principalmente a biogênese mitocondrial, a mitofagia juntamente com a dinâmica, uma rede regulatória afinada, orquestra a quantidade e a qualidade das mitocôndrias e melhora a função mitocondrial e a sobrevivência dos cardiomiócitos sob condições de estresse (16). Os receptores ativados por proliferadores de peroxissoma (PPAR) coativador 1 (PGC-1) ​​desempenham um papel crítico na condução da biogênese mitocondrial e da função no coração (17). Os proliferadores de peroxissomos ativam os receptores coativadores 1 / (-/-) corações de camundongos exibem as assinaturas do defeito maturacional e anormalidade grave na função e densidade mitocondrial (18). Além disso, a exclusão do mediador da mitofagia Parkin impede a maturação morfológica e funcional das mitocôndrias no estágio neonatal (19). As mitocôndrias são organelas altamente dinâmicas, sofrendo constantes eventos de fissão e fusão associados à sua função. No período embrionário tardio, a ablação genética específica de carac da fusão mitocondrial pro em MFN1 e MFN2 em camundongos exibe disfunção mitocondrial grave após o nascimento e desenvolve cardiomiopatia (20). Surpreendentemente, um estudo recente revelou que a hipia crônica interrompeu a dinâmica mitocondrial no cérebro fetal de um porco (21). Consequentemente, MQC pode atuar como um ponto focal no desenvolvimento de lesão miocárdica na prole neonatal IUH. No entanto, pouco se sabe sobre os efeitos da hipóxia pré-natal no sistema MQC cardíaco neonatal e o efeito da disfunção do MQC na saúde do coração neonatal. Este estudo assumiu esta missão de explorar o mecanismo mitocondrial relacionado ao dano miocárdico induzido por IUH em novos descendentes e explorar ainda mais estratégias preventivas para reduzir a lesão cardíaca de IUH.

As poliaminas (PAs), incluindo putrescina (PU), espermidina (SPD) e espermina (SP), estão presentes em quase todos os organismos vivos e são essenciais para a sobrevivência, crescimento e desenvolvimento embrionário e fetal (22-24) . Estudos descobriram que ovelhas expostas a IUH podem melhorar a displasia embrionária suplementando poliaminas exógenas (25, 26). Além disso, o crescente corpo de literatura indica o papel das poliaminas na eliminação de radicais livres e na proteção do DNA, proteínas e lipídios dos danos prejudiciais do estresse oxidativo. Também é revelado que a suplementação de poliamina aumenta o tempo de vida em organismos modelo por meio de pro-testes antioxidantes, anti-inflamatórios e indutores de mitofagia (27-29). Estudos recentes documentaram que a suplementação com SPD na dieta é cardioprotetora e prolonga a expectativa de vida em camundongos e humanos, estimulando a mitofagia e a respiração mitocondrial e melhorando a função cardíaca (30, 31). Mais importante, relatamos anteriormente que a exposição hipóxica materna durante os estágios finais do desenvolvimento fetal resultou na lista ana dasada e aumentou o catabolismo de poliaminas no tecido carac de ratos recém-nascidos. O SPD preveniu lesões cardíacas em ratos descendentes de um dia expostos a IUH pela inibição da atividade mitocondrial (32).

2. Objetivos

Neste estudo, é hipotetizado que IUH induz déficits de estrutura e função mitocondriais, aumentando o estresse oxidativo e destruindo o mecanismo MQC no coração da prole recém-nascida, e assume-se que o tratamento materno SPD in utero reduz a lesão miocárdica diminuindo o programa de desenvolvimento das mitocôndrias. Este estudo pode contribuir para o desenvolvimento de estratégias preventivas ou terapêuticas para filhos de IUH para prevenir doenças cardiovasculares em adultos.

3. Métodos

3.1. animais

Os ratos Wistar machos e fêmeas (3 meses de idade) foram adquiridos do Departamento de Animais de Laboratório da Harbin Medical University. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Revisão de Ética da Harbin Medical University (China) e todos os experimentos foram conduzidos pelas diretrizes do National Institutes of Health. Os ratos com uma proporção macho-fêmea de 2:1 foram colocados aleatoriamente em uma gaiola para acasalamento. Os esfregaços vaginais foram realizados no dia seguinte para detectar a presença de espermatozóides nos tampões vaginais ou esfregaços vaginais, o que foi confirmado como o dia zero da gravidez. As ratas grávidas foram mantidas em uma sala com umidade controlada (60 por cento ) e temperatura controlada (21 graus ), e o ciclo claro-escuro foi de 12:12 horas.

3.2. Modelo de Hipóxia Intrauterina

Do 15º ao 21º dia de gestação, as ratas do grupo hipóxia (n=10) foram colocadas em uma câmara fechada de plexiglass, injetadas com ar e nitrogênio e monitoradas por um analisador de oxigênio (Pro OX12{{13 }}; BioSpherix, Nova York, EUA) e inalado com um teor de oxigênio de 10 por cento durante quatro horas por dia. As amostras de sangue arterial foram coletadas da artéria femoral direita, os valores de gases sanguíneos e pH foram medidos para manter a pressão parcial de oxigênio arterial de 50 - 55 mmHg, a saturação de oxigênio no sangue foi mantida em 80 - 85 por cento e procedimentos específicos foram realizados conforme descrito anteriormente (32). As ratas experimentais foram divididas aleatoriamente em quatro grupos: grupo controle (controle), grupo hipóxia intrauterina (Hpx), grupo hipóxia intrauterina mais espermidina (Hpx-Spd) e grupo hipóxia intrauterina mais espermidina mais inibidor (Hpx-Spd-DFMO ). Seis ratas por grupo receberam injeção intraperitoneal no 15º - 21dia de prenhez. Os ratos receberam solução salina a 0,9 por cento (1 mL/kg/d) nos grupos controle e Hpx, SPD (5 mg/kg/d) no grupo Hpx-Spd e SPD (5 mg/kg/d) e difluorometila -L-ornitina (DFMO, um inibidor da enzima chave da síntese de poliamina ODC) (5 mg/kg/d) no grupo Hpx-Spd-DFMO, respectivamente. Após o parto, 1-os recém-nascidos de um dia foram sacrificados e seus corações foram extraídos para estudos experimentais de acompanhamento.

3.3. Análise Histológica

O tecido ventricular esquerdo dos ratos foi cortado em espessura < 1 cm, fixado com paraformaldeído a 4 por cento, desidratado com álcool e embebido em parafina. A parafina embebida foi cortada em fatias de 5 mm de espessura, depois seca em estufa a temperatura constante de 60 graus, desparafinada com xileno e seguida de coloração com hematoxilina-eosina (HE). As fatias de tecido foram observadas para avaliar as mudanças na morfologia e estruturas cardíacas com um microscópio óptico (Eclipse E200; Nikon, Tóquio, Japão).

3.4. Análise de imunofluorescência

A coloração de imunofluorescência Ki67 foi realizada conforme descrito anteriormente (33). Resumidamente, o tecido ventricular esquerdo dos ratos foi fixado em formol a 4 por cento, embebido em parafina; a desparafinação, a hidratação e o reparo do antígeno foram concluídos primeiro. Esses tecidos foram bloqueados com 00,5% de albumina de soro bovino por 2 horas e depois incubados com anticorpo monoclonal de coelho Ki67 (1: 100, AF1738, Beyotime, China) a 4 graus durante a noite. Após a lavagem com PBS, o tecido foi incubado com IgG de cabra anti-coelho marcado com flúor Alexa (1: 500, A 0468, Beyotime, China) e contrastado com DAPI para núcleos. As imagens foram visualizadas e digitalizadas sob microscopia confocal a laser (OLYMPUS, FV1000, Japão). O software foi utilizado para analisar a colocalização das imagens mescladas.

3.5. Quantificação de Fibrose

A fibrose cardíaca foi avaliada pela coloração do tricrômico de Masson. Conforme descrito acima, as seções de tecido cardíaco dos ratos neonatos foram desparafinadas e hidratadas por métodos padrão e depois coradas com tricrômico de Masson de acordo com os protocolos. Dois cortes transversais não adjacentes foram usados ​​para cada coração. A porcentagem de área fibrótica na área total do miocárdio ventricular esquerdo foi analisada usando o software ImageJ, vl.52 (NIH, Bethesda, MD).

3.6. Marcação de Nick End de dUTP Mediada por TdT e Medições de Células Apoptóticas

Um ensaio TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) foi usado para determinar o número de células apoptóticas nos corações de ratos recém-nascidos com um dia de vida. Os tecidos do coração foram tratados seguindo nosso procedimento descrito anteriormente usando um Kit de Detecção de Morte Celular (Roche, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Três lâminas de cada bloco foram avaliadas quanto à porcentagem de células apoptóticas. Quatro campos de slides foram examinados aleatoriamente com ampliação de 200 ×. No total, foram contadas 100 células em cada campo.

3.7. Medição da atividade da enzima antioxidante

A atividade da superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT) foi medida usando kits comerciais (SOD: A001-3- 1 e CAT: A007-1-1; Jiancheng Bio. Institute, Nanjing, China) com um espectrofotômetro (Perkin- Elmer, Norwalk, CT, Estados Unidos). De acordo com as instruções do fabricante, a operação foi concluída e a concentração de proteína foi medida pelo método do ácido bicinconínico (Pierce, Rockford, Estados Unidos) com albumina sérica bovina (BSA) como padrão (34).

3.8. Medição do conteúdo de adenosina 5'-trifosfato

O conteúdo de ATP no tecido cardíaco foi medido usando um kit de ensaio de ATP (S0026B, Beyotime, Bio. Institute, China). De acordo com as instruções do fabricante, o lisado foi adicionado na proporção de acordo com o peso do tecido, homogeneizado com um homogeneizador de vidro e, em seguida, centrifugado a 4 graus 12000 g. O sobrenadante foi coletado e o conteúdo de ATP em cada amostra foi detectado com um luminômetro (NanoDrop, Nanodrop2000, Thermo, EUA) kit BCA (P0012s, Beyotime, Bio. Institute, China). O método do ácido bicinconínico foi usado para determinar a concentração de proteína e, em seguida, converter a concentração de ATP em nmol/g de proteína.

3.9. Microscopia Eletrônica de Transmissão

O tecido apical cardíaco foi dissecado em pequenos pedaços de aproximadamente 1 mm × 1 mm × 1 mm e então fixado em tampão glutaraldeído fosfato a 4 graus. Após desidratação de rotina, imersão, inclusão e coloração, as seções ultrafinas de 50 - 70 nm foram feitas. A ultraestrutura do tecido cardíaco foi observada em microscópio eletrônico de transmissão (TEM) e fotografada (H600 Hitachi, Tóquio, Japão). Mitocôndrias individuais e miofilamentos foram mapeados sob a condição de ampliação de 10.000 vezes com o software Image J versão 1.80 (National Institutes of Health), e suas áreas foram medidas de cada coração (35). Enquanto isso, os fragmentos mitocondriais < 1 µm3, que não foram divididos (geralmente redondos), foram identificados e a porcentagem média de fragmentos mitocondriais no campo de visão foi contada usando o Índice de Fragmentação Mitocondrial (MFI).

3.10. Isolamento Mitocondrial

As mitocôndrias foram isoladas a 4 graus usando centrifugação diferencial com um kit de isolamento de mitocôndrias (Beyotime Biotechnology, Xangai, China). Resumidamente, o tecido cardíaco fresco foi cortado em pedaços de tecido e centrifugado com 10 volumes de PBS pré-resfriado, o sobrenadante foi descartado, o precipitado foi digerido com tripsina por 20 min, o tampão de isolamento A adicionado foi centrifugado, o sobrenadante foi transferido para outro tubo, centrifugado novamente, e a fração precipitada foi a mitocôndria isolada. O pellet mitocondrial cardíaco final foi ressuspenso em tampão de homogeneização, armazenado em gelo e usado para experimentos na função de respiração mitocondrial dentro de 4h.

3.11. Medição do consumo de oxigênio mitocondrial

O consumo de oxigênio mitocondrial foi medido por um eletrodo de oxigênio do tipo Clark (Hansatech Instruments, Norfolk, Reino Unido) em um tampão de respiração mitocondrial. Piruvato (5 mM) e malato (5 mM) foram usados ​​como substrato para mitocôndrias contendo complexo I na concentração final de 500 µg proteína/mL. O consumo de oxigênio estimulado por ADP (estado 3 de respiração) foi medido na presença de 200 µM de ADP, e o consumo de oxigênio independente de ADP (estado 4 de respiração) foi monitorado. A razão de controle respiratório (RCR, estado 3 dividido pelo estado 4) reflete o consumo de oxigênio por fosforilação (acoplamento). Os procedimentos continuaram, conforme descrito anteriormente (36).

3.12. Análise Western Blot

A amostra de tecidos cardíacos foi colhida e armazenada a -80 graus. Tecidos cardíacos ventriculares esquerdos congelados foram homogeneizados em tampão de lise RIPA gelado (Beyotime Inc., Shanghai, China P0013B). As concentrações de proteína foram quantificadas usando um kit de ensaio de proteína BCA (Beyotime Inc., Shanghai, China P0006C). As amostras contendo proteína total foram separadas por 10 por cento (p/v) SDS-PAGE e transferidas para uma membrana de PVDF (Millipore, Bedford, MA, Estados Unidos). Foram utilizados os seguintes anticorpos: Anticorpos para GAPDH (1:2000,10494-1-AP), MFN2 (1:1000,12186-1- AP), SIRT-1 (1:1000,{{16 }}AP), NRF-2 (1:600,16396-1-AP), TFAM (1:1000,19998-1-AP) e BAX (1,1000,509599-2-Ig) foram adquiridos da Proteintech (WuHan, China), BCL2 (1:2000, sc-7382) e DRP1 (1:1000, sc-271583) foram adquiridos da Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX) e PGC -1 (1:1000, ab106814, Abcam, Cambridge, MA, Reino Unido). O anticorpo secundário (IgG de cabra anti-coelho marcado com peroxidase de rábano silvestre) era da Beyotime Corporation (Shanghai, China). As intensidades das bandas de proteína foram quantificadas usando um sistema de imagem de gel Fluor Chem Chemiluminescence (Protein Simple, EUA). A densidade óptica das bandas de proteína foi analisada com o software Image J versão l.52 (NIH, Bethesda, MD).

3.13. Modelo de cardiomiócito hipóxico

Cardiomiócitos de ratos neonatos (NRMCs) foram isolados e cultivados por métodos padrão, conforme descrito anteriormente (32). Resumidamente, os corações dos ratos neonatais de três dias foram extraídos, picados, cultivados e depois digeridos em 0,25 por cento de tripsina e 0,02 por cento de EDTA (Beyotime Biotechnology, Xangai, China). Após centrifugação, os precipitados foram transferidos para DMEM suplementado com 10 por cento de soro fetal de vitela (Biolot, Rússia) e incubados em ar úmido contendo 5 por cento de 2. Três dias após serem semeadas, as células foram colocadas em uma câmara hipóxica de vidro (Biospherix OxyCycler C42 , Redfield, NY) e preenchido com nitrogênio por 8 min para descarregar o oxigênio residual. Esses cardiomiócitos foram divididos aleatoriamente nos seguintes grupos: (1) Grupo controle (controle), células cultivadas em condições normais de incubação; (2) grupo hipóxia (Hpx), células colocadas na câmara hipóxica por 24 h e depois cultivadas normalmente por 24 h; (3) grupo Hpx-Spd, células colocadas na câmara hipóxica e incubadas com 10 µmol/L SPD por 24 h; (4) Grupo Hpx-SpdDFMO, células colocadas em câmara hipóxica e incubadas com 10 µmol/L SPD mais 2 mmol/L DFMO por 24h.

3.14. Medição de espécies reativas de oxigênio

A geração de ROS foi medida pelo ensaio de coloração de di-hidroetídio (DHE) (Cat No. S0063, Beyotime, China). Resumidamente, os cardiomiócitos primários foram incubados com 5 µmol/L DHE a 37 graus por 30 min, lavados com PBS e depois movidos sob o microscópio para observar as mudanças na intensidade de fluorescência. As imagens foram tiradas com um microscópio de fluorescência Olympus FluoView FV1000 (Olympus Optical Co., Ltd., Takachiho, Japão) em um comprimento de onda de excitação de 535 nm, e o comprimento de onda máximo de emissão foi de 610 nm, n > 20 células por grupo.

3.15. Determinação do Potencial da Membrana Mitocondrial

O corante éster etílico de tetrametilrodamina (TMRE) é carregado positivamente e pode ser localizado seletivamente nas mitocôndrias. É amplamente utilizado para determinar o potencial de membrana mitocondrial (∆Ψm). Em suma, a solução de trabalho de coloração TMRE a uma concentração de 200 µmol/L foi adicionada aos cardiomiócitos tratados agrupados, bem misturada e colocada em uma incubadora de células a 37 graus por 20 min. O sobrenadante foi aspirado e as células foram lavadas com PBS e movidas para um microscópio invertido para observar a mudança na intensidade de fluorescência. O comprimento de onda de excitação foi de 549 nm e a luz de emissão foi de 579 nm. A intensidade da fluorescência vermelha indicou a mudança de ∆Ψm, n > 20 células por grupo.

3.16. Experimento de Localização Mitocondrial e Lisossomal

De acordo com a instrução, Mito-Tracker Green (NO.C1048, Beyotime, China) e Lyso-Tracker Red (NO.C1046, Beyotime, China) usaram a análise de colocalização mitocondrial e lisossômica. NRCMs foram carregados com 200 nM MitoTracker Green FM e 50 nM LysoTracker Red em HBSS por 30 min antes dos experimentos, as células foram lavadas com PBS e, em seguida, as imagens das células foram obtidas usando um microscópio de fluorescência Olympus FluoView FV1000. A linha de laser de 488 nm foi usada para excitar a fluorescência do MitoTracker Green, medida entre 505 e 515 nm. Para LysoTracker Red, a linha de laser de 577 nm foi usada com uma medição de 590 nm. A sobreposição de intensidade de pixel vermelho e verde foi determinada usando software de quantificação no Nikon Eclipse Microscope, n > 20 células por grupo.

3.17. Análise estatística

Todos os dados dos grupos experimentais foram comparados usando ANOVA de uma via seguido pelo teste post hoc de Bonferroni com o software GraphPad Prism versão 8 (GraphPad Software Inc., La, Jolla.CA) e o software SPSS versão 17.1 (SPSS, Chicago, IL, United Estados). Os dados foram expressos como média ± SEM, e o nível de significância foi definido como P < 0,05.

4. Resultados

4.1. Filhos e características do coração

O peso corporal (PC) e o peso do coração (PC) foram medidos, e a razão PC/PC (PC/PC) foi calculada (Figura 1). Os resultados mostraram que o PC e o PC dos ratos recém-nascidos diminuíram e o PC/PC aumentou devido à hipóxia intrauterina. Em comparação com o grupo IUH, o BW e o HW dos ratos neonatais no grupo SPD aumentaram (P <0.05) e o HW/BW diminuiu (P <0. 05); Comparado com o grupo SPD, ambos BW e HW do grupo de tratamento DFMO diminuíram (P <0,05), e HW/BW aumentou significativamente (P <0,05).

4.2. Efeitos do SPD na estrutura morfológica do miocárdio, proliferação celular e fibrose em filhos recém-nascidos expostos a

Os resultados da coloração cardíaca HE mostraram que os corações de descendentes de um dia expostos a IUH apresentaram inchaço e fibras miocárdicas frouxamente arranjadas. Entretanto, os corações IUH tratados com SPD mantiveram uma estrutura tissular miocárdica aceitável (Figura 2A). Em seguida, avaliamos o número de cardiomiócitos binucleares com o corte de tecido corado com HE; o número de cardiomiócitos binucleares foi maior no grupo IUH do que no grupo controle (P <0.05). Em comparação com o grupo IUH, a proporção de cardiomiócitos binucleares no grupo de tratamento SPD diminuiu significativamente (P <0.05); O DFMO atenuou o efeito do SPD (P <0.05) (Figura 2C). Detectamos ainda a expressão de Ki67 (um marcador de proliferação celular) em miocárdio de rato usando o método de imunofluorescência. Quanto maior a expressão de Ki67, mais forte a fluorescência rosa por fusão de vermelho e azul (Figura 2E). Os resultados mostraram que, em comparação com o grupo controle, a expressão de Ki67 no grupo IUH diminuiu significativamente (P < 0.05), a expressão de Ki67 aumentou significativamente após a administração de SPD (P < { {28}}.05), e o efeito do SPD foi abolido pelo DFMO (P < 0,05) (Figura 2F). Esses resultados indicam que o SPD pode inibir a retirada prematura de cardiomiócitos do ciclo celular induzido pelo IUH e promover a proliferação de cardiomiócitos na nova prole exposta ao IUH. Em seguida, utilizamos a coloração de Masson para detectar as alterações no conteúdo de colágeno miocárdico e avaliamos a fibrose miocárdica pela medida da área de colágeno (Figura 2BandD). Descobrimos que a deposição de colágeno miocárdico no coração dos ratos recém-nascidos expostos ao IUH aumentou (P < 0,05), cujo nível foi maior em comparação ao grupo controle. Pelo contrário, a área de fibrose miocárdica após o tratamento com SPD reduziu significativamente (P < 0,05). No entanto, em comparação com o grupo de tratamento SPD, a área de fibrose aumentou significativamente no grupo HpxSpd-DFMO (P <0,05).

4.3. Efeitos da espermidina na estrutura mitocondrial miocárdica, na função respiratória e no conteúdo de adenosina 5'-trifosfato em descendentes de recém-nascidos expostos à hipóxia intrauterina

As alterações da estrutura ultraestrutural do tecido cardíaco e as características mitocondriais foram analisadas por TEM (Figura 3A). O software Image J foi utilizado para quantificar a porcentagem de conteúdo mitocondrial (área mitocondrial em toda a área da célula) e área mitocondrial (Figuras 3B e C). Os resultados mostraram que no grupo controle, os miofilamentos miocárdicos estavam organizados, a estrutura do sarcômero era clara, as mitocôndrias eram compactas, a matriz era mais densa e as cristas mitocondriais estavam organizadas. No entanto, as mitocôndrias incharam, e a matriz solta e diminuição da densidade foram observadas em alguns cardiomiócitos do grupo IUH. Em comparação com o grupo controle, a proporção de mitocôndrias em cardiomiócitos e a área de mitocôndrias foram reduzidas (P <0.05). No entanto, nos corações de ratos do tratamento SPD, os miofilamentos do miocárdio eram puros, a estrutura do sarcômero era clara, a matriz mitocondrial era compacta e o inchaço mitocondrial diminuía. Em comparação com o grupo IUH, a proporção de mitocôndrias em cardiomiócitos aumentou (P <0.05) e a área de mitocôndrias aumentou (P <0,05). DFMO inibiu esses efeitos induzidos por SPD (P < 0,05).

Usamos piruvato/malato como substrato para avaliar a função respiratória mitocondrial, incluindo frequências respiratórias dos estados 3 e 4 e RCR (Figura 3D - F). Observamos que, em comparação com o grupo controle, a frequência respiratória nos estados 3 e 4 e o RCR do grupo IUH foram todos significativamente menores (P < 0.{{10}}5). Curiosamente, o RCR dos estados 3 e 4 se recuperou após o tratamento SPD (P < 0.05). Em contraste, esses efeitos SPD foram significativamente inibidos no grupo de tratamento DFMO (P <0,05). Da mesma forma, em comparação com o grupo controle, o conteúdo de ATP miocárdico no grupo IUH reduziu significativamente (P <0,05). Em comparação com o grupo IUH, o conteúdo de ATP aumentou notavelmente no grupo tratado com SPD (P <0,05) e DFMO atenuou os efeitos do SPD (P <0,05) (Figura 3G). Esses achados sugerem que o SPD pode proteger os danos na estrutura e função mitocondrial miocárdica e prevenir o declínio dos níveis de ATP em ratos recém-nascidos expostos a IUH.

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