Produção de Lipase por Yarrowia Lipolytica em Fermentação em Estado Sólido Usando Subprodutos de Frutas da Amazônia e Farelo de Soja Como Substrato Parte 2
Jun 30, 2023
2.5. Hidrólise de óleo de peixe
As lipases têm sido usadas na hidrólise de ácidos graxos para concentrar ácidos graxos poliinsaturados (PUFAs) [44,45]. A principal vantagem da aplicação de lipases na produção de ácidos graxos poliinsaturados é a especificidade da enzima e as reações ocorrem em condições de temperatura moderada, o que favorece a manutenção da estrutura dos PUFAs [44]. O uso de lipases é preferido aos métodos químicos, pois fornecem glicerídeos de baixo rendimento e pureza [46]. O papel das lipases na hidrólise seletiva de ácidos graxos saturados (SFAs) e ácidos graxos monoinsaturados (MUFAs) a partir de triacilgliceróis (TAGs) é produzir glicerídeos ricos em PUFAs. O princípio deste método é o impedimento estérico causado pela configuração molecular das ligações duplas carbono-cis nos PUFAs que causam o dobramento das cadeias de ácidos graxos. Assim, os sítios ativos enzimáticos não acessam as ligações éster desses ácidos graxos com seus esqueletos de glicerol [47,48]. Inúmeros benefícios estão associados à inserção de ácidos graxos na dieta como desenvolvimento infantil, prevenção de doenças cardiovasculares, câncer e diversos transtornos mentais (depressão, transtorno de déficit de atenção, hiperatividade), além do potencial anti-inflamatório e potencial hipertenso controle [49].
O glicosídeo de cistanche também pode aumentar a atividade de SOD nos tecidos do coração e do fígado e reduzir significativamente o conteúdo de lipofuscina e MDA em cada tecido, eliminando efetivamente vários radicais reativos de oxigênio (OH-, H₂O₂, etc.) e protegendo contra danos ao DNA causados por radicais OH. Os glicosídeos feniletanóides cistanche têm uma forte capacidade de eliminação de radicais livres, uma capacidade redutora maior do que a vitamina C, melhoram a atividade de SOD na suspensão de esperma, reduzem o conteúdo de MDA e têm um certo efeito protetor na função da membrana espermática. Os polissacarídeos Cistanche podem aumentar a atividade de SOD e GSH-Px em eritrócitos e tecidos pulmonares de camundongos experimentalmente senescentes causados por D-galactose, bem como reduzir o conteúdo de MDA e colágeno no pulmão e no plasma e aumentar o conteúdo de elastina, têm um bom efeito de eliminação no DPPH, prolongar o tempo de hipóxia em camundongos senescentes, melhorar a atividade de SOD no soro e retardar a degeneração fisiológica do pulmão em camundongos experimentalmente senescentes Com degeneração morfológica celular, experimentos mostraram que Cistanche tem boa capacidade antioxidante e tem potencial para ser um medicamento para prevenir e tratar doenças de envelhecimento da pele. Ao mesmo tempo, o echinacoside em Cistanche tem uma capacidade significativa de eliminar os radicais livres DPPH e tem a capacidade de eliminar espécies reativas de oxigênio e prevenir a degradação do colágeno induzida por radicais livres, e também tem um bom efeito de reparo nos danos causados pelos radicais livres da timina.
【Para mais informações:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】
A produção de extratos enzimáticos para serem aplicados em processos como a hidrólise pode ser uma tarefa cara. Assim, pesquisar matérias-primas que reduzam o custo de produção pode ser uma alternativa interessante. A utilização de um biocatalisador sólido é desejável, pois este biocatalisador sólido pode ser reaproveitado em reações enzimáticas, além de apresentar excelente estabilidade de armazenamento à temperatura ambiente, sem custos de refrigeração e facilidade de transporte [41]. Não há relatos sobre o uso de um biocatalisador sólido de Yarrowia lipolytica para produzir PUFAS pela hidrólise enzimática de óleo de peixe. Assim, a aplicação do extrato enzimático bruto e biocatalisador sólido produzido a partir da torta de óleo de andiroba e farelo de soja (50:50) foi estudada para avaliar o potencial de aplicação de enzimas na hidrólise do óleo de peixe para posterior produção de ácidos graxos poliinsaturados em um processo adequado (Figura 6). É possível observar um alto grau de hidrólise (DH) em tempos de reação mais curtos usando um biocatalisador sólido (63, 70,8, 72,5 e 74,7 por cento) do que o extrato enzimático (47,5, 61,5, 66,5 e 74,8 por cento) após 24, 48, 72h e 144h, respectivamente.
O processo de hidrólise enzimática é constantemente aplicado para obtenção de ácidos graxos poliinsaturados concentrados. Gao et al. [50] usaram lipase na hidrólise do óleo de bacalhau e os teores de EPA e DHA melhoraram 3,24-vezes e 1,98-vezes, respectivamente. Aarthi et al. [20] utilizaram lipase concentrada (1000 U/mL) na hidrólise de óleos de peixe e também encontraram uma taxa de hidrólise acima de 60 por cento após 72 h. Neste trabalho, melhores graus de hidrólise foram obtidos usando um extrato enzimático bruto de lipase (ou seja, sem purificação) quando comparado o mesmo tempo de hidrólise. Outros autores estudaram a hidrólise do óleo de fígado de Musteleus mustelus e óleo de gordura de foca relatando 75% e 70% de hidrólise após 24 e 9 h de reação, respectivamente [25,26].
Martins e cols. [51] utilizaram uma lipase comercial de Burkholderia cepacia (Amano) para a hidrólise do óleo de peixe e após 48 h de reação, obtiveram 55,6 por cento de DHA em relação ao teor máximo calculado. Em nosso trabalho, em um estudo preliminar, obtivemos 70,8 por cento de hidrólise após 48 h de reação usando o biocatalisador sólido.
Até agora, tais descobertas sugeriram a viabilidade de usar subprodutos para produzir lipase em fermentação em estado sólido como forma de mitigar danos ambientais, avaliar subprodutos e custo-efetividade. Além disso, os resultados mostram o potencial de aplicação da enzima lipase na hidrólise do óleo de peixe para posterior produção de ácidos graxos poliinsaturados em um processo adequado.
Apesar de abundante em subprodutos agroindustriais de baixo custo, a determinação e padronização da composição, bem como estimativa de custo para obtenção do extrato enzimático e biocatalisador sólido a partir de subprodutos agroindustriais de baixo custo ainda são um desafio, mas extremamente dependente do tipo de subproduto, sazonalidade e quantidade gerada, bem como do processo utilizado, localização geográfica, entre outros fatores. Assim, questões como complexidade da cadeia e seus custos logísticos, utilização de processos complexos e onerosos, alto consumo de energia, questões regulatórias, entre outras, devem ser superadas. Nesse sentido, o processamento de subprodutos deve superar várias barreiras antes de se tornar economicamente viável, incluindo a necessidade de processar grandes quantidades de matérias-primas, a capacidade de processar matérias-primas heterogêneas, a logística integrada com diferentes indústrias de processamento e a possibilidade de integração processo na unidade de processamento para permitir a geração de ingredientes de alto valor, entre outros [52-55].
3. Materiais e Métodos
3.1. Material
O farelo de soja foi adquirido da Caramuru Alimentos (Goiás, Brasil). A torta de andiroba produzida a partir da extração do óleo foi fornecida pela Beraca Ingredientes Naturais (Pará, Brasil). Ambos os substratos foram padronizados quanto à granulometria (<1.18 mm) and properly stored under refrigeration in polypropylene packages until use. The fish oil was purchased from Mundo dos Óleos, and according to the manufacturer, it is extracted by cold pressing and filtration, obtained from raw material with guaranteed origin. All other chemicals used were of analytical grade and used as received without any further purification, being obtained from Tedia (acetone), Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA, glucose, azocasein, agar, yeast extract, ethanol, methanol), Vetec (Tween 80), Oxoid (peptone), Isofar (sodium hydroxide, gum Arabic), and Precision Plus Protein Kaleidoscope—Bio-rad (molecular mass markers, kDa).
3.2. Condições de Cultivo de Microrganismo e Inóculo
Yarrowia lipolytica IMUFRJ50682, isolada de um estuário na Baía de Guanabara, Rio de Janeiro, Brasil [56] foi cultivada a 28 ◦C em meio YPD - ágar (p/v: extrato de levedura 1 por cento; peptona, 2 por cento; glicose, 2 por cento ; ágar, 3 por cento). As células foram cultivadas em meio líquido contendo extrato de levedura 1 por cento (p/v), peptona 2 por cento (p/v) e glicose 2 por cento (p/v) por 72 h, 160 rpm a 28 ◦C.
3.3. Caracterização de subprodutos agroindustriais
A composição físico-química do farelo de soja e da torta de óleo de andiroba foi determinada em termos de teor de umidade, proteína, carboidrato, cinzas, extrato etéreo, fibra insolúvel e fibra solúvel, conforme metodologia divulgada pela Association of Official Analytical Chemists (AOAC ) [57]. Adicionalmente, como a produção de lipase por Y. lipolytica é afetada pela aeração [58], a porosidade do leito em SSF foi avaliada de acordo com a Equação (1), onde ε é a porosidade (expressa em m3 ar·m−3 leito); ρdrysolid é a densidade aparente da amostra seca (kg·m−3 ); e ρwetsolid é a densidade da amostra após a adição de água (kg·m−3 ) [58].
3.4. Produção de lipase por SSF
A matriz sólida contendo farelo de soja e torta de óleo de andiroba foi preparada antes da inoculação em reator tipo bandeja com diferentes proporções do substrato e autoclavada a 121 ◦C por 20 min. Os parâmetros fixos do processo usados para a produção de lipase foram umidade de 55% e concentração de inóculo de 0,71 mg de biomassa seca/g de substrato [24]. Os reatores foram incubados em uma câmara de Demanda Bioquímica de Oxigênio (BOD) a 28 ◦C e amostras de sacrifício (ou seja, um reator do tipo bandeja para o tempo de amostragem) foram coletadas durante a fermentação para análise.
A SSF foi avaliada usando diferentes combinações de torta de óleo de andiroba e farelo de soja ({{0}}:1{{10}}0; 25:75; 50:50; 75 :25 e 100:0) em diferentes horários (0, 12, 24, 32 e 48 h). Em seguida, avaliou-se a suplementação da matriz sólida contendo torta de andiroba e farelo de soja (50:50) adicionando 1,5 (% p/v) de óleo de soja ao longo do tempo (0, 12, 14, 20, 24, 28, 48, e 72 h) para obter um aumento na atividade lipolítica. Além disso, foi testada a presença de Tween 80 (0,001 por cento p/v) no meio de fermentação contendo 1,5 (por cento p/v) de óleo de soja. A fermentação foi monitorada pela determinação da atividade de lipase e protease, bem como da umidade e do pH (descrito na Subseção "3.6. Determinações analíticas").
3.5. Extração de Enzimas e Produção de Biocatalisador Sólido
A extração da enzima foi realizada pela adição de 50 mL de tampão fosfato de potássio 50 mM pH 7,0 nos biorreatores seguido de incubação a 37 ◦C, 200 rpm, por 20 min. Posteriormente, o material fermentado suspenso no tampão foi prensado com auxílio de um masher com olhal e centrifugado a 3000 rpm por 5 min. O biocatalisador sólido foi obtido a partir da liofilização de toda a massa obtida ao final do processo de fermentação por 72 h e armazenada em temperatura ambiente por 7 meses para verificação da estabilidade enzimática.
3.6. Determinações analíticas
3.6.1. Atividade da Lipase
A atividade da lipase foi realizada pelo método proposto por Freire et al. [59]. O meio de reação foi emulsionado em um homogeneizador Ultra Turrax (IKA) usando 5 por cento (p/v) de azeite e 5 por cento (p/v) de goma arábica em tampão fosfato 100 mM (pH 7.0). Extrato enzimático (1 mL) ou 0,5 g do biocatalisador sólido foi adicionado a 19 mL da mistura reacional e incubado por 20 min, 200 rpm a 37 ◦C. A reação foi interrompida pela adição de 20 mL de solução de acetona-etanol e os ácidos graxos livres foram titulados em um titulador automático (Metrohm 916—Ti-Touch) usando solução de NaOH 0,04 mol/L. Uma unidade de atividade de lipase (U) foi definida como a quantidade de enzima que produz 1 µmol de ácido graxo por minuto, nas condições do ensaio.
3.6.2. Atividade de Protease
A atividade da protease foi quantificada de acordo com a metodologia de Charney e Tomarelli [60]. Extrato enzimático (0,5 mL) foi adicionado em 0,5 mL de solução de 0,5 por cento (p/v) de azocaseína preparada com tampão de acetato 50 mM (pH) e incubado a 32 ◦C por 40 min. A reação foi interrompida pela adição de 0,5 mL de solução de ácido tricloroacético 15 por cento (p/v) e as amostras foram centrifugadas a 3000 rpm por 15 min. O sobrenadante (100 µL) foi adicionado em uma placa de microtitulação 96- contendo 100 µL de hidróxido de potássio 5 M, e a absorbância a 428 nm foi medida em um leitor de placas de microtitulação (SpectraMax, Molecular Devices). Uma unidade de atividade foi definida como a quantidade de enzima capaz de promover um aumento unitário da absorbância por minuto.
3.6.3. Teor de umidade e pH
O teor de umidade foi monitorado usando uma balança de analisador de umidade (AND MX-50). O pH foi medido em um medidor de pH (TECNAL, modelo TR-107 PT100, Brasil).
3.7. SDS-PAGE
A eletroforese foi realizada de acordo com o método relatado por Laemmli [61] em um gel de poliacrilamida (5% de empilhamento, 15% de separação, 00,75 mm de espessura). As amostras foram misturadas na proporção (1:4) a partir de uma combinação de torta de óleo de andiroba e soja (50:50) com tampão de amostra contendo -mercaptoetanol, aquecidas a 95 ◦C por 5 min e aplicadas sobre o gel. A eletroforese foi realizada a 150 V por 30 min (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA), e o gel foi revelado usando Coomassie Blue R-250. Foi utilizado um marcador de proteína padrão (Bio-rad, Hercules, CA, EUA) com peso molecular variando de 10 a 250 kDa.
3.8. Hidrólise de óleo de peixe: uma aplicação potencial
O grau de hidrólise (DH) do óleo de peixe foi medido pesando 1 g de óleo de peixe e adicionando 25 mL de tampão fosfato pH 7.0 para verificar o potencial de aplicação da enzima na hidrólise do óleo de peixe. Em seguida, 5 mL do extrato enzimático (37 U) em frascos âmbar foram agitados por 168 h. A reação foi interrompida com 20 mL de acetona e os ácidos graxos livres foram titulados em titulador automático com KOH metanólico 0,1 M. O branco da reação foi obtido com a adição da enzima apenas no final da reação.
O grau de hidrólise (DH) foi calculado de acordo com a Equação (2):
onde As é a acidez da amostra; Aa é a acidez da autohidrólise; Si é o índice de saponificação.
3.9. Análise estatística
Todos os experimentos foram replicados três vezes. Em cada replicação, as análises foram realizadas em triplicata. Os resultados corresponderam à média ± desvio padrão. Os dados foram analisados pela análise de variância (ANOVA) de uma via, enquanto o teste de Tukey (p < 0,05) foi usado para testar diferenças entre as médias usando o Sisvar 5.6.
4. Conclusões
O meio de fermentação obtido após a mistura da torta de andiroba e farelo de soja foi muito eficiente na produção de lipase. A matriz de fermentação escolhida foi a mistura de torta de andiroba e farelo de soja na proporção de 50:50, produzindo 63,70 U·g −1 de atividade lipolítica. A atividade lipolítica máxima foi obtida (82,52 U·g −1 ) após o uso da relação torta de andiroba e farelo de soja de 50:50 após a suplementação com Tween 80 (0,001 por cento ) e óleo de soja (1,5 por cento ). Na análise eletroforética, foram detectadas bandas de proteínas já relatadas na literatura como YL Lip2 (37 e 40 kDa). A aplicação prévia de lipase na hidrólise do óleo proporcionou até 63 por cento de hidrólise após 24 h. Este estudo mostrou que é possível produzir lipase usando subprodutos da região amazônica combinados com farelo de soja e aplicá-lo à hidrólise do óleo de peixe para posteriormente produzir ácidos graxos poliinsaturados em um processo adequado.
Contribuições do autor:Conceituação, BDR, ACL e MAZC; Metodologia, ASSC, JCSS, FVdN, CECdS, BDR, ACL e MAZC; Análise formal, ASSC, JCSS e FVdN; Investigação, ASSC, JCSS e FVdN; Recursos, ASSC, JCSS e FVdN; Curadoria de dados, ASSC, JCSS e FVdN; Redação—preparação do rascunho original, ASSC, JCSS, FVdN e CECdS; Redação – revisão e edição, BDR, CECdS, ACL e MAZC; Supervisão, BDR, CECdSACL e MAZC; Administração de projetos, BDR, ACL e MAZC; Aquisição de financiamento, BDR, ACL e MAZC Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.
Agradecimentos: Os autores agradecem a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior—Brasil (CAPES—Finance Code 001); o Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico (CNPq); e a Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ).
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