SLC37A2, uma molécula relacionada ao fósforo aumenta nas células musculares lisas da aorma calcificada

Calcificação vascularé uma importante fonte dedoença cardiovascularem pacientes com doença renal crônica.Hiperfosfatemialeva ao aumento do influxo intracelular de fósforo, o que leva a um aumento de células semelhantes a osteoblastos nas células do músculo liso vascular. PiT-1 transita fosfato nas células musculares lisas vasculares. No entanto, o mecanismo de calcificação vascular não é completamente compreendido. Este estudo investigou moléculas candidatas relacionadas ao fósforo além do PiT-1. Nossa hipótese é que moléculas relacionadas ao fósforo pertencentes aotransportador de soluto(SLC) estaria envolvida na calcificação vascular. Como resultado da análise de microarranjos de DNA, focamos no SLC37A2 e mostramos que a expressão de mRNA dessas células aumentou nas células musculares lisas da aorta calcificadas (AoSMC). Foi relatado que SLC37A2 transporta trocas de glicose-6-fosfato/fosfato e fosfato/fosfato. A análise in vitro mostrou que a expressão de SLC37A2 não foi afetada pela inflamação no AoSMC. A expressão de mRNA e proteína SLC37A2 aumentou em AoSMC calcificada. In vivo a análise mostrou que a expressão do mRNA de SLC37A2 na aorta dedoença renal crônicaratos foi correlacionado com genes marcadores osteogênicos. Além disso, o SLC37A2 foi expresso na área de calcificação vascular emratos com doença renal crônica. Como resultado, mostramos que SLC37A2 é uma das moléculas que aumenta comcalcificação vascularin vitro e in vivo.

Palavras-chave: SLC37A2,calcificação vascular, células musculares lisas da aorta,doença renal crônica, hiperfosfatemia

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Como o número de pacientes comdoença renal crônica(DRC) aumenta, o número de pacientesnecessitando de diálisetambém aumentará. A maioria das mortes em pacientes submetidosdiálisesão devidos adoenças cardiovascularescomoinsuficiência cardíaca, distúrbios cerebrovascularesou infarto do miocárdio. (,2) Uma importante fonte dedoença cardiovascularé a calcificação ectópica,() uma anormalidade causada pela formação e deposição de cristais de fosfato de cálcio nos tecidos moles. (4 6) Vários fatores, como inflamação. o estresse oxidativo e o aumento dos níveis plasmáticos de cálcio (Ca) e fósforo (P) estão envolvidos na progressão da calcificação vascular. Dentre esses fatores, a hiperfosfatemia está mais fortemente associada à calcificação vascular. (7.8) A hiperfosfatemia é causada pela ingestão excessiva de P na presença de diminuição da função renal. Portanto, os pacientes em diálise precisam limitar a ingestão de P. (79-12) No entanto, foi relatado quecalcificação vascularjá está progredindo quando a diálise é iniciada; também foi observado em pacientes com DRC em estágio inicial, quando a hiperfosfatemia não é evidente. (3) Consequentemente, é importante prevenir a calcificação vascular em pacientes com DRC em estágio inicial para melhorar o prognóstico de vida.

o que leva a um aumento do influxo de P nas células musculares lisas vasculares (CMLV). O influxo de P é realizado via PiT-1, um transportador na superfície da membrana celular do CMLV. PiT- é um membro da superfamília de transportadores de soluto (SLC), que inclui um transportador de fosfato de sódio codificado por SLC20A1.04 PiT- transporta fosfato através de membranas celulares dependentes de Na e subsequentemente mineralização da matriz devido a níveis elevados de p.s) Como intracelular Os níveis de P aumentam, as CMLV começam a expressar fatores de transcrição osteogênicos, como o fator de transcrição 2 relacionado ao runt (Runx2)(16). Esse efeito é seguido pelo aumento da expressão de genes específicos de osteoblastos, como osteopontina e osteocalcina. Além disso, reduziu a expressão de proteínas específicas do músculo liso. como a proteína do músculo liso 22-0 (SM22-0), ocorre. Como resultado, as CMLV são transformadas em células semelhantes a osteoblastos. (1718)Estudos clínicos recentes mostraram que os níveis sanguíneos de cálcio. partículas de proteína (CPP), que representam partículas coloidais de fosfato de cálcio, aumentam com a diminuição da função renal. (19-21)Além disso, foram relatadas correlações com níveis sanguíneos de CPP e P.2o2i) É possível que o CpP possa desencadear a progressão da calcificação vascular.22-24)

No entanto, calcificação vascular foi observada em pacientes com DRC em estágio inicial com níveis plasmáticos normais de P. (13) Além disso, o mRNA PiT-1 é expresso de forma onipresente em todos os tecidos. Assim, outra molécula pode atuar principalmente na área de calcificação vascular. Há relatos de queinflamaçãopromove calcificação vascular. Fatores inflamatórios como interleucina (IL)-1B, IL-6 e fator de necrose tumoral alfa (TNF-a) induziram diferenciação de VSMC em células semelhantes a osteoblastos(2s26) TNF-a induz calcificação vascular através da via do AMPc, que desempenha um papel na diferenciação dos osteoblastos.2728) IL-6 regula várias vias que levam à calcificação vascular das CMLV2-31) Além disso. IllB, IL-6 e TNF-a também são fatores associados ao aumento da calcificação vascular induzida por níveis elevados de p.3233). os dados atuais não explicam completamente o mecanismo da vascularização

calcificação induzida por esses fatores. Nossa hipótese é que poderia haver outras moléculas relacionadas ao P, como as da superfamília SLC, envolvidas na calcificação vascular. Nós nos concentramos em proteínas de membrana da superfamília SLC e investigamos potenciais moléculas candidatas relacionadas ao P, além do PiT-1, para envolvimento na calcificação vascular. Além disso, examinamos a relação entre moléculas candidatas e calcificação vascular em vídeo e in vivo.

Materiais e métodos

Cultura de células. Células musculares lisas humanas normais (AoSMC) foram obtidas de Lonza (Basel, Suíça). AoSMC foi cultivada de acordo com as instruções do fabricante. AoSMC foram mantidos em meio de crescimento (meio basal de células musculares lisas suplementado com 5% de soro fetal bovino (FBS), fator de crescimento epidérmico, insulina, fator de crescimento de fibroblastos-B e gentamicina/anfotericina-B). A mídia foi trocada a cada dois dias. Os AoSMC foram cultivados em uma incubadora umidificada com 5% de CO2 a 37 graus e mantidos até a confluência ser alcançada e então utilizados em experimentos.

AoSMC calcificada. A calcificação de AoSMC foi induzida conforme descrito anteriormente.435) AOSMC foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado com 15% de FBS e penicilina-estreptomicina e cultivadas com 2,6 mM P por 3, 6, 9, 12 e 14 dias. A concentração de P foi ajustada pelo tampão P NaH, PO/Na e HPO. pH 7,2). Outras AoSMCs não foram cultivadas com 2,6 mM de P.

Microarranjo de DNA. RNA total de amostras de AoSMC cultivadas e não cultivadas com P 2,6 mM foram utilizados. O RNA total 5.{3}}ug foi analisado usando um microarranjo de DNA (Agilent Technologies, Tóquio, Japão). SurePrint G3 Human GE 8 x 60k ver. 2 Microarray foi usado para examinar cerca de 26,000 genes. A razão foi calculada dividindo o nível de expressão de AoSMC cultivada com 2,6 mM por 12 dias pelo nível de expressão de AoSMC não cultivada com 2,6 mM P

Microarranjo de DNA

RNA total de amostras de AoSMC cultivadas e não cultivadas com P 2,6 mM foram utilizados. O RNA total 5.{3}}ug foi analisado usando um microarranjo de DNA (Agilent Technologies, Tóquio, Japão). SurePrint G3 Human GE 8 x 60k ver. 2 Microarray foi usado para examinar cerca de 26,000 genes. A razão foi calculada dividindo o nível de expressão em AoSMC cultivada com 2,6 mM durante 12 dias pelo nível de expressão em AoSMC não cultivada com 2,6 mM de P.Expressão de SLC37A2 na inflamação vascular. Para induzir uma resposta inflamatória em AoSMC, as células foram cultivadas com meio de crescimento até atingirem a confluência e então tratadas com 1 ugmL de lipopolissacarídeos (LPS) (LPS de escherichia coli O111:B4; Sigma, St. Louis, MO) por 24 e 72 sem 2,6 mM P. Outros AoSMC não foram cultivados com análise de reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real. O RNA total foi extraído de AoSMC tratado com LPS por 24 e 72 h e células não tratadas com LPS. A PCR quantitativa em tempo real baseada em SYBR green foi realizada utilizando cDNA sintetizado e um conjunto de iniciadores apropriado para cada gene alvo com um sistema de PCR em tempo real StepOnePlus (Applied Biosystems, FosterCity, CA). As sequências iniciadoras foram as seguintes: IL humana-6.5-AATTCGGTACATCCTCGACGG-3' e 5-GCCATCTTTGGAAGGTTCAGG-3'; SLC37A2,5TCACTTTAGTGCCAAGGAGGC-3' e 5CCATTGGTGTAGTCAGAGACG-3' humanos; gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH5'-CTGCACCACCAACTGCTTAGC- e 5-CTTCTGGGIGGCAGTGATGC-3.IL-6 e os níveis de expressão de mRNA SLC37A2 foram calculados após normalização com GAPDH.Expressão de SLC37A2 em calcificado AoSMC. O total foi extraído de AoSMC não cultivadas com 2,6 mM P e células AoSMC cultivadas com 2,6 mM P por 3, 6, 9, 12 e 14 dias. A PCR em tempo real foi realizada usando o cDNA sintetizado. As sequências iniciadoras foram as seguintes segue: Runx2 humano, 5-TGAGAGCCGCTTCTCCAACCC-3' e 5-CTCTGGCTTTGGGAAGAGCCG-3. Os níveis de expressão de mRNA Runx2 e SLC37A2 foram calculados após normalização com APPH.

Análise de Western Blot.

A proteína total foi coletada de amostras AoSMC cultivadas nas mesmas condições utilizadas para análise de PCR em tempo real. Estas amostras foram lisadas utilizando solução salina tamponada com Tris (pH 75) suplementada com NP a 5%-40 e um cocktail inibidor de protease a 1%. As amostras de concentração de proteína foram medidas utilizando o Kit de Ensaio de Proteína BCA (Thermo FisherScientific.Waltham, MA). e a concentração foi ajustada por Western blotting, 10 μg de proteína foram separados em gel de poliacrilamida a 10% usando eletroforese em gel de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida. A membrana foi tratada com anticorpo SLC37A2 (Novus Biologicals, Centennial, CO) ou anticorpo GAPDH (GeneTex, Irvine, CA) como anticorpos primários, incubada com anticorpo IgG de coelho conjugado com peroxidase de rábano silvestre (R&D Systems, Minneapolis, MN) como anticorpo secundário e visualizado usando Amersham ECL Select (GE Healthcare. Buckinghamshire, Inglaterra) e analisador de imagem luminescente (LAS-1000 plus, FUNIFILM, Tóquio, Japão). A banda foi quantificada usando lmagel.

Experimental

Todos os protocolos do estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de Hyogo, Escola de Ciências Humanas e Meio Ambiente. Ratos Sprague-Dawley machos com doze semanas de idade foram adquiridos do Japan SLC (Shizuoka, Japão). Os ratos foram mantidos em um ciclo de 12-claro, 12-h escuro (09:00-21:00) e tiveram livre acesso a comida e água extra-pura.

As dietas experimentais incluem uma dieta controle P (1,0% P, 0,6Ca, 20% proteína), uma dieta com adenina (0,75% adenina , 1,0% P, 0,6%Ca, 2,5% proteína), uma dieta pobre em P (LP) (0,2% P,0 ,6% de Ca, 10% de proteína) e uma dieta rica em P (HP) (1,0% de P, 0,6% de Ca, 10% de proteína) baseada na dieta AIN93-G (Oriental Levedura, Tóquio, Japão) com caseína como fonte de proteína.3637) Foi relatado que uma dieta pobre em proteínas promove calcificação vascular em ratos com insuficiência renal induzida por adenina, portanto foi realizada restrição proteica.3738) Antes do agrupamento, todos os ratos (n=23) foram alimentados com uma dieta padrão MF(Levedura Oriental) durante uma semana para se aclimatarem. Com 13 semanas de idade, os ratos foram divididos em 2 grupos: o grupo controle (n=5) e o grupo DRC induzida por adenina (n=18). O grupo controle recebeu a dieta controle P por 6 semanas. . O grupo com DRC induzida por adenina recebeu a dieta de adenina por cerca de 3 semanas e foi então dividido em 2 subgrupos: o grupo DRC-LP (n=8) ou o grupo CKDHP (n=10). Os ratos do grupo DRC-LP e do grupo DRC-HP receberam dieta LP e dieta HP por 3 semanas, respectivamente, durante o período experimental, a ingestão alimentar foi registrada diariamente. Durante a dieta de adenina, amostras de sangue foram coletadas da veia da cauda entre 10h e 11h, uma vez por semana até a segunda semana e, posteriormente, uma vez a cada 2 dias para monitorar os níveis plasmáticos. Durante a dieta LP ou dieta HP, amostras de sangue foram coletadas uma vez por semana. Amostras de urina foram coletadas e o volume de urina foi registrado uma vez por semana. Os ratos foram sacrificados com anestésico utilizando isoflurano (Wako Pure Chemical Industries. Osaka Japão) e laparotomias. Amostras de sangue retiradas da veia cava inferior e da aorta toracoabdominal foram coletadas para análise.

Expressão de SLC37A2 na aorta.

Aproximadamente um terço da aorta toracoabdominal coletada foi utilizada para visualizar calcificação e realizar imunocoloração. A aorta foi embebida em parafina e 4-seções foram cortadas. As seções foram coradas usando um Método Von Kossa para Kit de Cálcio (Polysciences. Warrington, PA) de acordo com as instruções do fabricante. a análise de imunocoloração foi realizada com cortes seriados. As secções foram incubadas com anticorpo SLC37A2 durante a noite a 4 graus e depois tratadas com Histofine Simple Stain Rat MAX-POMULTI) (Nichirei Biosciences, Tóquio, Japão) durante 30 min à temperatura ambiente. Posteriormente, as secções foram tratadas com um kit DABsubstrate (Nichirei).

O RNA total foi extraído do restante da aorta toracoabdominal congelada. A PCR em tempo real foi realizada utilizando o cDNA sintetizado. As sequências iniciadoras foram as seguintes: osteopontina de rato, 5ACCCATCTCAGAAGCAGAATC-3' e 5ATCCATGTGGTCATGGCTTTC-3' e; rato SLC37A2,5-TAGTCCCAGCTTCGAGTACGG-3' e 5'-CTGATGGGCTTTCTGGACATG-3. Os níveis de expressão de mRNA de osteopontina e mRNA de SLC37A2 foram calculados após normalização com GAPDH

Análise estatística.

Os dados são apresentados como média + SE. As diferenças entre os grupos foram analisadas pelo teste t. Em experimentos de AoSMC calcificados induzidos por fosfato, as diferenças foram analisadas usando uma análise de variância unidirecional seguida pelo método de Dunnett. Nos experimentos do modelo DRC, as diferenças foram analisadas pelo teste de K ruskal-Wallis seguido pelo método Steel-Dwass. Os coeficientes de correlação (rs) foram determinados pelo teste de classificação do coeficiente de correlação de Spearman. Para todos os testes. valores p bicaudais<0.05 were considered statistically significant.