Redução da lesão de preservação/reperfusão renal por hipertermia controlada durante a perfusão em máquina ex vivo

Contato:joanna.jia@wecistanche.com/WhatsApp: 008618081934791

Thomas Minor1,*,† e Charlotte von Horn1,†

O possível efeito renoprotetor de um breve tratamento de choque térmico controlado durante a perfusão isolada de máquina ex vivo de enxertos de doadores antes dareperfusãodeve ser investigado em um estudo primário in vitro.Porcinorins(n=14) foram recuperados após 20 minutos de parada cardíaca do doador e submetidos a 20 horas de armazenamento estático a frio na solução da Universidade de Wisconsin. Antes dereperfusão, rinsforam submetidos a 2 horas de recondicionamento da máquina de perfusão com aumento gradual da temperatura de perfusão até 35 graus. Na metade dorins(n=7), um breve impulso hipertérmico (10 minutos de perfusão a 42 graus) foi implementado no período de perfusão da máquina. A recuperação funcional dos enxertos foi observada após reperfusão normotérmica in vitro. O tratamento hipertérmico resultou em um aumento de 50 por cento da proteína de choque térmico (HSP) 70 e HSP 27 mRNA e foi acompanhado por ~ 50 por cento de melhoria da reabsorção tubular de sódio e glicose após a reperfusão, em comparação com os controles. Além disso, a perda renal de aspartato aminotransferase foi significativamente reduzida para um terço dos controles, assim como a perda de proteína urinária, avaliada pela razão albumina/creatinina. Conclui-se que o tratamento de choque térmico ex vivo parece ser uma opção de fácil implementação e promissora para aumentar a maquinaria de autodefesa renal contrareperfusãoprejuízoapós preservação que merece mais investigação em modelos pré-clínicos.

Cistanche dr vita opcé muito bom pararimreperfusão

Destaques do estudo

QUAL É O CONHECIMENTO ATUAL SOBRE O ASSUNTO?

✔ A indução de proteínas de choque térmico (HSPs) em tecidos locais é um mecanismo de defesa bem conhecido em resposta a estresses ambientais. A regulação positiva dessas chaperonas moleculares induz mecanismos de reparo e tolerância contra células subsequentes.prejuízo. Clínicorimo transplante depende cada vez mais do uso de órgãos de doadores de critérios estendidos que apresentam maior suscetibilidade à isquemia/reperfusãoprejuízo. A máquina de perfusão ex vivo de enxertos de órgãos marginais fornece acesso privilegiado ao enxerto e uma nova perspectiva para uma aplicação fácil e controlada de uma estimulação hipertérmica ao órgão isolado para desencadear respostas de choque térmico e desencadear vias de sinal que afetam favoravelmente a exacerbação consecutiva do tecido lesão e melhorarenalrecuperação após o transplante.

QUE PERGUNTA ESTE ESTUDO ABORDOU?

✔ Examinamos um potencial efeito protetor de um breve estímulo hipertérmico durante o pré-transplante ex vivorimperfusãono resultado funcional no pós-isquêmicoreperfusão.

O QUE ESTE ESTUDO AGREGA AO NOSSO CONHECIMENTO?

✔ Este estudo dá algumas indicações de que o tratamento hipertérmico durante a perfusão em máquina renal ex vivo atua como uma possível nova ferramenta para a melhora dos resultados funcionais de pacientes marginalmente preservadosrinsapós reperfusão pós-isquêmica. Os dados suportam um papel relevante das HSPs na redução da destruição celular e na melhora da função renal tubular pós-transplante.

COMO ISSO PODE MUDAR O FARMACO CLÍNICO

OGY OU CIÊNCIA TRADUCIONAL?

✔ A adição de hipertermia breve controlada a um protocolo de perfusão de máquina normotérmica estabelecido é um método de fácil implementação para aplicação clínica e pode contribuir para melhorar a recuperação de órgãos após o transplante.

O transplante renal clínico depende cada vez mais do uso de órgãos de doadores de critérios estendidos que foram danificados antes da recuperação ou provavelmente estão abaixo do ideal

qualidade. Juntamente com a proporção crescente de órgãos que apresentam maior suscetibilidade a gatilhos lesivos na preservação isquêmica,1,2 alterações teciduais

relacionadas à lesão de isquemia/reperfusão representam um problema crescente e importante no transplante renal que desencadeia disfunção celular na reperfusão.

A indução de chaperonas celulares e o desencadeamento de um fenótipo de sinal protetor (por exemplo, por estresse térmico subcrítico), é um mecanismo bem conhecido para reduzir as alterações teciduais pertinentes a uma situação de estresse posterior e desafiar a homeostase do tecido.3,4

O advento da máquina de perfusão isolada como alternativa ou adjuvante ao armazenamento refrigerado isquêmico de enxertos marginais de doadores abriu uma nova perspectiva para uma aplicação fácil e controlada de um desafio hipertérmico ao órgão isolado, a fim de desencadear uma resposta de choque térmico e desencadear sinal vias que afetam favoravelmente a exacerbação consecutiva da lesão tecidual e melhoram a recuperação renal após o transplante.

Foi comprovado experimentalmente que o efeito de pré-condicionamento da resposta ao choque térmico está relacionado a um aumento supranormal temporário da citorresistência5, além de ser operatório via aprimoramento dos mecanismos de reparo celular secundário.6 Mais recentemente, foi demonstrado que a indução de proteínas de choque térmico (HSPs) podem conferir proteção mesmo quando induzidas logo após o insulto original ao tecido já ter ocorrido.7

O acesso privilegiado ao órgão isolado exclui requisitos complicados para aquecimento de todo o corpo e incorre em efeitos colaterais adversos nos organismos doadores ou receptores.

Portanto, este estudo foi concebido como uma investigação piloto para examinar evidências primárias de tratamento hipertérmico durante a perfusão em máquina renal ex vivo para atuar como uma possível nova ferramenta para a melhoria do resultado funcional de rins marginalmente preservados após a reperfusão pós-isquêmica.

MÉTODOS

Todos os experimentos foram realizados em rins que foram recuperados de fêmeas de porcos Landrace alemães mortos (idade: 10-12 semanas, peso: 25 e 30 kg). A lei federal relativa à proteção de animais e os princípios de cuidados com animais de laboratório (publicação do National Institutes of Health (NIH) no. 85-23, revisado em 1985) foram seguidos. Os animais foram tratados de acordo com as regras e após a aprovação das autoridades locais.

Os rins foram removidos 20 minutos após a parada circulatória e lavados na mesa traseira por gravidade de 100 cm com solução fria (4 graus) da Universidade de Wisconsin até que o efluente se tornasse claro. Nenhuma heparina foi administrada em nenhum momento.

Os enxertos foram posteriormente armazenados por 18 horas em um béquer preenchido com uma solução da Universidade de Wisconsin e uma temperatura regulada para 4 graus por meio de um criotermóstato.

No grupo controle, os rins foram então submetidos a 2 horas de perfusão em máquina normotérmica oxigenada (95 por cento O2; 5 por cento CO2) com solução Aqix RS I suplementada com 40 g/L de albumina sérica bovina. Conforme proposto anteriormente,8,9 a perfusão foi iniciada em hipotermia seguida de aumento graduado de até 35 graus nos primeiros 60 minutos, controlado por um criotermostato circulante programável.

No grupo experimental, um breve período de hipertermia controlada (HC) foi incluído na perfusão isolada

Tratamento de choque térmico ex vivo de enxertos de órgãos menores e protocolo de von Horn. Após atingir 35 graus, a temperatura do perfusato foi temporariamente elevada para 43 graus por 10 minutos (Figura 1) antes da continuação da perfusão a 35 graus pelo restante do período 2-hora. O tempo e a altura do aumento da temperatura foram derivados de experimentos de triagem incremental anteriores com o objetivo de obter um efeito consistente.

Em três experimentos, a pressão parcial de oxigênio no tecido foi controlada pelo uso de um sensor de oxigênio óptico tipo agulha de microfibra, conectado a um medidor de oxigênio de fibra óptica com compensação de temperatura (Microx 4, PreSens precisão sensing, Regensburg, Alemanha), que simultaneamente registrou a temperatura correspondente por meio de uma sonda termistor.

A agulha foi colocada na região cortical interna do rim para documentar a oxigenação tecidual adequada mesmo durante períodos hipertérmicos de perfusão.

Modelo de reperfusão renal isolada

A recuperação renal da lesão de preservação/reperfusão foi avaliada usando um modelo de reperfusão in vitro estabelecido, conforme descrito anteriormente.10

Em resumo, os rins foram lavados a frio com 100 mL de solução salina no final do período de recondicionamento da máquina e, em seguida, mantidos em temperatura ambiente por 20 minutos para simular o segundo período de isquemia quente durante o implante cirúrgico in vivo. Este tempo também foi usado para canulação do ureter com um tubo grande para permitir a coleta de urina na reperfusão.

Os rins foram colocados em uma câmara de plexiglass controlada por termostato e perfundidos através da artéria renal a uma pressão pulsátil média de 90 mmHg. O efluente venoso escoava livre para o reservatório. A oxigenação do perfusato foi realizada com 95 por cento de O2/5 por cento de CO2 usando um oxigenador de fibra oca termocontrolado. A pressão arterial foi mantida por meio de uma bomba de roletes servo-controlada em conjunto com um transdutor de pressão conectado à cânula de perfusão arterial. A urina foi coletada do tubo de PE inserido no ureter que foi guiado para fora do reservatório. A cada 100 mL de urina coletada foram filtrados e reinfundidos no reservatório para

figura 1Renaltecido cortical pO2 (linha pontilhada) durante a perfusão em máquina ex vivo em relação à respectiva temperatura de perfusato (linha contínua).

para manter a composição eletrolítica constante do perfusato ao longo do tempo.

Procedimentos analíticos

A pressão parcial de oxigênio e as concentrações de perfusato de glicose e eletrólitos foram medidas em um analisador de gases de pH-sangue (laboratório ácido-base ABL 815flex, Radiometer, Copenhagen).

As atividades enzimáticas da aspartato aminotransferase (AST) e as concentrações de creatinina foram determinadas de forma rotineira por fotometria de refletância em uma unidade de atendimento Reflotron Plus (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha).

Renala depuração foi calculada para os respectivos intervalos como creatinina urinária × fluxo urinário/creatinina perfusada.

A concentração de albumina na fração urinária ao final do experimento foi medida fotometricamente usando o ensaio de ligação de corante com verde de bromocresol no centro laboratorial do hospital universitário e a quantidade de proteína foi normalizada contra as concentrações correspondentes de creatinina como albumina urinária para proporção de creatinina.

A carga filtrada de sódio (FL Na) foi calculada como

FL=TFG × Na

FRNa=(FLNa − Na(urina) ×fluxo de urina)∕FLNa

A carga filtrada e a reabsorção fracionada de glicose foram calculadas de acordo.

Transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase subsequente

O RNA total foi isolado de amostras de tecido congeladas por pressão do córtex externo e analisado conforme descrito anteriormente.8

Os valores basais foram calculados a partir de amostras de tecido que foram retiradas derinsex vivo. Os resultados foram quantificados usando o método ΔΔCt. Os genes alvo foram normalizados para gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase como padrão interno. Os valores de expressão do gene Fold foram calculados para cada amostra individual conforme normalizado em relação aos valores da linha de base.

Os seguintes primers (adquiridos da Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha) foram usados ​​no estudo: gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (nº PPS00192A), HSP72 (nº PPS00074A), HSP27 (nº PPS01262) e HO{ {6}} (nº PPS01191A).

Western Blot

A imunotransferência de proteínas foi realizada a partir de lisados ​​de células inteiras dorenalcórtex por eletroforese em gel de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida e transferência eletroforética para membrana de nitrocelulose, conforme descrito anteriormente.8 A coloração foi feita com Ponceau S verificou uniformidade de carregamento e transferência de proteínas.

A incubação com anticorpos primários foi realizada durante a noite a 4 graus (quinase regulada por sinal extracelular anti-fosfo de coelho (ERK, Thermo Fisher, #MA5-15174—1:500) ou anti HSP 72 (StressMarq Bioscience, #SCM -100—1:300). Após incubação com anticorpo secundário acoplado à peroxidase de rábano (1:1,000) por 1 hora em temperatura ambiente, a proteína foi detectada por quimioluminescência aprimorada usando um C-Digit Blot Scanner (Li-COR).

A quantificação do teor de proteína foi realizada densitometricamente com UN-SCAN-IT gel versão 6.1 (Silk Scientific, Orem UT) conforme normalizado contra a expressão de ERK total (Thermo Fisher, #MA5-15174) ou ß-actina (Thermo Fisher , #PA1-46296).

Estatisticas

Todos os valores são expressos como médias ± SD para n {{0}} animais por grupo e as diferenças entre os grupos foram testadas por teste t bilateral não pareado usando a correção de Welch para variâncias desiguais, se não indicado de outra forma. A significância estatística foi estabelecida em P <>

RESULTADOS

Máquina de perfusão

Durante o reaquecimento oxigenado controlado dos enxertos perfundidos da máquina, a hipertermia temporária levou a uma queda transitória visível narenaltecido cortical pO2 (Figura 1), que, no entanto, sempre permaneceu acima de 200 mmHg e, portanto, claramente atendeu aos requisitos fisiológicos durante a perfusão normotérmica que havia sido relatado como 30-50 mmHg.11,12

Renala liberação de AST no perfusato circulante foi ainda ligeiramente menor no grupo hipertermia do que nas condições de controle (19,8 ± 12,1 vs. 33,3 ± 25,9 U/L; CH vs. controle, não significativo).

Leitura molecular da hipertermia transitória durante a perfusão em máquina ex vivo

A preservação e a reperfusão levam a uma notável indução de HSPs mesmo sob condições de controle com ~ 2-vezes, 8-vezes e até 100-vezes aumento de transcrições de mRNA de hemooxigenase 1, HSP 27 e HSP 72, respectivamente.

No entanto, a hipertermia transitória controlada durante a perfusão da máquina efetivamente aumentou esse aumento na indução de genes em cerca de 50% em todos os casos. O efeito mostrou-se altamente significativo tanto para HSP 27 quanto para HSP 72, enquanto não foi evidenciada significância estatística quanto à indução da heme oxigenase 1 (Figura 2).

A fosforilação de ERK representa um evento de sinal protetor rápido e responsivo que também pode promover a expressão de HSP 72.13

Foi investigado como repercussão precoce do estresse calórico no nível protéico. As análises de Western blot revelaram que a hipertermia transitória durante a perfusão da máquina aumentou significativamente a quantidade de fosforilação ERK no tecido quando comparado com o grupo controle (Figura 3). Correspondentemente, a expressão proteica de HSP 72 também foi significativamente elevada acima dos valores de controle após hipertermia controlada durante a perfusão em máquina.

A hipertermia transitória melhorarenalrecuperação após preservação

O fluxo de perfusato durante a reperfusão foi em média entre 300 e 400 mL/minuto, sem diferenças entre os dois

grupos. A produção de urina também foi semelhante em ambos os grupos com 897 ± 354 vs. 601 ± 280 mL/90 minutos (controle vs. CH).

Renala liberação de AST foi tomada como parâmetro de lesão celular global e acompanhada durante a reperfusão (Figura 4). Vê-se que o tratamento hipertérmico resultou em valores inicialmente mais baixos no início da reperfusão e mitigou ainda mais o aumento progressivo durante a perfusão em curso.

Renala função da célula tubular foi avaliada pela análise da reabsorção de sódio e glicose do ultrafiltrado (Figura 5). Descobriu-se que as taxas de reabsorção fracionária derins, previamente submetido à hipertermia controlada durante a perfusão da máquina, superou significativamente os do grupo controle em ~ 40 por cento .

Para excluir a possibilidade de que o controlerinspode ter sido carregado com cargas absolutas mais altas de sódio ou glicose no ultrafiltrado, também determinamos a carga total de filtração de ambas as substâncias, que, no entanto, não diferiu entre os dois grupos com FL Na no valor de 2,7 ± {{3 }},7 e 2,5 ± 0,8 mmol/minuto e FL glu para 24,8 ± 12,1 e 28,6 ± 9,4 mg/min (controle vs. CH, respectivamente).

As taxas de filtração glomerular também foram ambíguas em ambos os grupos; os valores de depuração da creatinina totalizaram {{0}},25 ± 0.06 mL/g/minuto no grupo controle e 0,24 ± 0,08 mL/g/minuto após CH.

Por outro lado, a perda de proteína urinária foi significativamente reduzida norinsque foram submetidos a CH (Figura 6).

DISCUSSÃO

O uso da máquina de perfusão ex vivo representa uma tendência de evolução no manejo da preservação do enxerto antes do transplante de órgãos.

Na última década, a máquina de perfusão hipotérmica foi estabelecida como um método de preservação superior em comparação com o armazenamento a frio estático simples14,15 e tornou-se popular para a preservação de órgãos de maior risco, bem como critérios estendidos.14–16

A estimulação pulsátil da vasculatura durante o período extracorpóreo17, bem como a presença de oxigênio18 mostraram manterrenalhomeostase e melhorarfuncionalresultados após o transplante.

Recentes avanços técnicos promoveram uma nova tendência para a perfusão normotérmica da máquina como uma alternativa mais fisiológica às tecnologias de perfusão hipotérmica, que compensa o maior gasto por uma melhor manutenção da homeostase metabólica e uma oportunidade mais autêntica de avaliar o enxerto preservado antes do transplante.19,20

Além disso, a máquina de perfusão normotérmica representa uma plataforma ideal para intervenções terapêuticas no órgão isolado que pode servir para fins de condicionamento visando aliviar as consequências de lesão de recuperação/preservação anterior ou para precondicionar contra lesão de reperfusão posterior após segunda isquemia quente e reperfusão no transplante.

cistanche rim wirkung

Descobriu-se que o tratamento de choque térmico como abordagem terapêutica promove mecanismos de proteção muito eficazes nos rins e induz tolerância a insultos específicos, estabilizando a estrutura da proteína e a integridade celular. Este efeito é baseado principalmente na síntese de HSPs específicas, que são expressas constitutivamente nos rins e podem ser altamente reguladas em resposta a uma variedade de condições de estresse.4

Este estudo mostra que um breve desafio hipertérmico durante a perfusão renal isolada efetivamente provoca uma reação de choque térmico molecular, como evidenciado pelo nível pré-transcricional e protéico, e ativa a sinalização de sobrevivência através da via ERK. O procedimento descrito não foi associado com hipóxia tecidual aparente, apesar da perfusão isolada sem transportadores de oxigênio adicionais.

Foi estabelecido anteriormente que a indução de HSPs pode começar dentro de < 1 hora21 e que a expressão de HSP 72 aumenta para multidões já após 3 horas.22 HSP 70 é a chaperona mais proeminente responsiva ao estresse hipertérmico e desempenha um papel fundamental papel na proteção dos tecidos pelo aumento da maquinaria de autodefesa celular.5

A HSP 72 previne o dobramento incorreto de proteínas,5 facilita a remoção de proteínas danificadas6 e participa do redobramento e reparo de proteínas. No apoio a processos de reparo celular que são muito mais baratos do que a síntese de novo. Assim, a HSP 72 reduz as necessidades metabólicas durante a situação crítica de reperfusão após lesão celular21 e, assim, ajuda arecuperação celulardo insulto.

A estabilização das membranas lisossômicas23 reduz a lesão celular por hidrolases ácidas e a indução consecutiva de morte celular. No nível molecular, estudos anteriores indicam que HSP 72 ativa a via MEK/Erk e o efeito protetor relevante está relacionado à fosforilação de Raf, MEK e Erk e sobrevivência celular. redução na liberação global de AST, que foi tomada como parâmetro de dano celular geral. Além disso, o aumento progressivo da AST durante a reperfusão em curso também foi notavelmente atenuado pelo tratamento.

Junto com isso, houve uma mitigação significativa dedisfunção renaluma vez que a capacidade de reabsorção das células tubulares foi aumentada em ~ 50 por cento em relação aos valores de controle.

A HSP 27 é uma HSP de baixo peso molecular que também foi considerada importante na resposta protetora ao choque térmico nos rins.4 Estudos em células tubulares de ratos mostram que o acúmulo de HSP 27 nas células do túbulo proximal está associado ao aumento da sobrevivência e regeneração. 26

Com base nos resultados do presente estudo piloto, a implementação de um breve desafio hipertérmico no protocolo de perfusão da máquina ex vivo parece ser uma maneira fácil de condicionar enxertos renais marginalmente preservados que promove resiliência à lesão de reperfusão por aumento da autodefesa celular maquinaria. Ainda existe controvérsia se a perfusão em máquina deve ser feita antecipadamente, imediatamente após a obtenção do enxerto27 apesar de incorrer em inconvenientes logísticos, ou se um breve período de perfusão isquêmica final após o transporte do órgão por armazenamento a frio estático seria suficiente e mais facilmente implementável em rotina clínica.28,29 O condicionamento ex vivo do enxerto pelo HC seria possível em ambas as modalidades.

No entanto, deve-se ter cautela em relação a conclusões finais prematuras. O rim perfundido isolado (IPK) é uma ferramenta útil para estudos de triagem funcional30 e as correlações entre os dados de IPK e os resultados clínicos tornam o modelo IPK uma ferramenta potencialmente útil para avaliação da função renal.17,31 No entanto, a capacidade funcional bastante constante do modelo é limitado a algumas horas,32 o que impede observações de longo prazo.

Como uma expressão máxima de HSPs ainda pode ocorrer além desse período,22 um potencial aumento adicional do efeito protetor do tratamento hipertérmico (por exemplo, em termos de regeneração melhorada após insulto isquêmico) não será considerado em nossa configuração piloto. Além disso, é bem conhecido de estudos anteriores em outros modelos, que o tratamento por choque térmico ou a superexpressão de HSP 27 induzida por lentivírus pode resultar em uma mitigação da reatividade inflamatória de órgãos-alvo lesionados

juntamente com uma redução significativa da infiltração de neutrófilos no tecido.33,34

A infiltração leucocitária, por sua vez, é conhecida como um dos principais fenômenos do tipo agudo que desencadeia reações inflamatórias lesivas após isquemia renal e reperfusão in vivo.

No entanto, para excluir efeitos adversos concomitantes da ativação de células sanguíneas em superfícies de tubos artificiais, que seriam inevitáveis ​​em um modelo in vitro estendido, transplante e reperfusão reais sob condições fisiológicas, incluindo morfologia natural do vaso, parecem ser obrigatórios para abordar com precisão as células efeitos inflamatórios, que, portanto, não foram abordados na presente investigação piloto.

Por fim, descobertas recentes demonstraramdiferenças de sexoem transcritos expressos em células do túbulo proximal de machos versus fêmeas que podem refletir disparidades relacionadas ao sexo na doença renal crônica ou módulos de genes pró-inflamatórios. reações de choque térmico. Possivelmente, o comportamento diferente do tecido masculino, por outro lado, não foi abordado e, portanto, não pode ser considerado neste estudo.

Em conclusão, nossos dados até agora mostram que a breve perfusão hipertérmica ex vivo é uma maneira fácil de indução de chaperona no enxerto renal isolado que confere proteção parenquimatosa na reperfusão precoce e garante confirmação adicional usando modelos de transplante in vivo com tempos de observação prolongados.

Agradecimentos. Os autores agradecem a valiosa ajuda técnica de Bastian e Regina Lüer.

Financiamento. Nenhum financiamento foi recebido para este trabalho.

Conflito de interesses. Os autores declararam não haver interesses conflitantes neste trabalho.

Contribuições do autor. TM e CvH escreveram o manuscrito. TM e CvH projetaram a pesquisa. TM e CvH realizaram a pesquisa. TM e CvH analisaram os dados.