Estudo proteômico quantitativo desmascara a via do fibrinogênio na doença hepática policística Ⅱ
Nov 22, 2023
3. Resultados
3.1. Rim e fígado não seguem os mesmos mecanismos císticos
Estudos anteriores mostraram que a inativação precoce do gene Pkd1 (antes do p12) desencadeia o rápido desenvolvimento da doença policística (janela cística), enquanto a inativação após o p14 leva à formação tardia do cisto após 4–5 meses, com um fenótipo leve (janela não cística) [19]. Utilizando o mesmo modelo ortólogo de ADPKD (Pkd1cond/cond; Tam-Cre) [18,19], investigamos se essa janela de desenvolvimento renal correspondia no tempo a uma janela semelhante de desenvolvimento hepático. Para fazer uma comparação direta com nossos estudos anteriores [37], camundongos foram induzidos com tamoxifeno para inativar o gene Pkd1 nos dias pós-natais 14 (p14) e 12 (p12) e sacrificados aos 30 dias de idade (p30). Curiosamente, observamos um fenótipo cístico em ambos os momentos com um grau diferente de doença (leve e grave), sugerindo que o rim e o fígado têm janelas independentes de desenvolvimento cístico (Figura 1a) e/ou possíveis diferentes tempos e progressão da doença . Não foram encontradas diferenças entre machos e fêmeas nesta idade de abate entre ambas as janelas de inativação (n=6 foi usado para cada grupo de mutantes). Os animais mutantes p14 apresentaram um fenótipo mais brando que o grupo mutante p12, com menores valores de índice cístico, número de cistos e função hepática de acordo com o valor sérico de ALP (Figura 1b-d). Este é o primeiro estudo que mostra diferentes janelas/mecanismos de desenvolvimento para deficiência hepática e renal de Pkd1. Essas diferenças moleculares terão que ser determinadas em estudos futuros.
Figura 1. Caracterização do fenótipo do fígado cístico no dia 30 dos estágios p12 e p14. A deleção de Pkd1 em p12 acarreta uma cistogênese mais grave. (a) Imagens macroscópicas e microscópicas representativas de hematoxilina-eosina coradas de fígados de Pkd1cond/cond; tipo selvagem de camundongo Tam-Cre (WT, Pkd1cond/cond; Tam-Cre−) e mutante (KO, Pkd1cond/cond; Tam-Cre+ ) com deleção do gene Pkd1 induzida por tamoxifeno no dia 14 (grupo p14) e 12 (grupo p12) pós-natal. Todos os ratos foram sacrificados em p30. Barra de escala, 2 mm (painel superior) 100 µm (painel inferior). n representa o número de amostras por grupo e Bd significa ducto biliar. (b,c) Índice cístico hepático e número de cistos dos diferentes fenótipos. (d, e) Valores séricos de ALP e ALT. As barras representam médias ± SEM em todos os casos. p < 0,05 pelo teste t de Student (bicaudal) foi considerado resultado significativo. ns não representa significância. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.
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3.2. Análise Proteômica Shotgun e SWATH-MS em PLD
Conforme referido na Figura 2, realizamos análise proteômica diferencial em ambos os estágios císticos (p12 - doença cística grave - e p14 - doença cística leve -) de Mutantes (KO) em comparação com animais Wild Type (WT), a fim de identificar e caracterizar mecanismos moleculares relevantes submetidos à cistogênese hepática e à progressão da doença.
Figura 2. Esquema de fluxo de trabalho ilustrado. Usamos um modelo murino ADPKD (Pkd1cond/cond; camundongos Tam-Cre) no qual a inativação genética de Pkd1 foi induzida pela administração de tamoxifeno no dia 10 pós-natal (p10) e p11 (progressão rápida da doença) ou p15 e p16 (progressão retardada da doença). ) de acordo com a mudança de desenvolvimento para a cistogênese renal, definindo os dois grupos do estudo denominados p12 e p14 respectivamente [19]. Para ambos os grupos, utilizamos um n igual ou superior a seis indivíduos do tipo selvagem (WT) e Mutante (KO) em cada condição, e todos os animais foram sacrificados no p30. Estudamos o proteoma diferencial dos fígados WT e KO em ambas as gravidades da doença cística hepática (Figura 1), usando análise proteômica quantitativa SWATH-MS e aquisição dependente de dados shotgun DDA-MS. Das proteínas com alteração significativa na abundância, utilizamos a bioinformática Figura 2. Esquema de fluxo de trabalho ilustrado. Utilizamos um modelo murino ADPKD (camundongos Pkd1cond/cond; Tam-Cre) no qual a inativação genética de Pkd1 foi induzida pela administração de tamoxifeno no dia 10 pós-natal (p10) e p11 (progressão rápida da doença) ou p15 e p16 (progressão retardada da doença ) de acordo com a mudança de desenvolvimento para a cistogênese renal, definindo os dois grupos do estudo denominados p12 e p14 respectivamente [19]. Para ambos os grupos, utilizamos um n igual ou superior a seis indivíduos Wild Type (WT) e Mutant (KO) em cada condição, e todos os animais foram sacrificados no p30. Estudamos o proteoma diferencial dos fígados WT e KO em ambas as gravidades da doença cística hepática (Figura 1), usando análise proteômica quantitativa SWATH-MS e aquisição dependente de dados de espingarda DDA-MS. Das proteínas com uma mudança significativa na abundância, utilizamos ferramentas de bioinformática para detectar novos alvos terapêuticos e vias envolvidas na doença. Finalmente, validamos esses alvos usando primeiro estratégias in silico (análise DDA vs SWATH) e finalmente in vivo, bem como RT-qPCR, Western blotting e imuno-histoquímica. p significa dia pós-natal
Padrão de expressão de proteínas na cistogênese hepática Primeiro, realizamos análise de espectrometria de massa proteômica por aquisição dependente de dados shotgun DDA-MS ou DDA. Esta análise permite caracterizar o proteoma a partir de amostras completas e individuais, fornecendo a presença/ausência de proteínas com alta sensibilidade mas sem fornecer a sua quantificação. Consideramos exclusivamente todas as proteínas expressas diferencialmente em mais de cinco amostras independentes de um total de seis amostras, para os estágios p14 e p12 de indivíduos Wild Type e mutantes, respectivamente (Figura S1). Em p14, foram identificadas 1 proteína exclusiva de WT (ou regulada negativamente para a doença) e 7 proteínas exclusivas de MUT (reguladas positivamente), enquanto em p12 foram observadas oito proteínas exclusivas de WT e seis exclusivas de MUT (Figura S1).
Em seguida, utilizamos um método que nos permitiu quantificar proteínas expressas diferencialmente. Realizamos uma análise proteômica quantitativa SWATH-MS nas mesmas amostras que usamos para DDA, obtendo ~ 1.500 proteínas por amostra e mais de 2.000 proteínas em cada grupo de estudo. Primeiramente, realizamos a normalização da soma da área total (TAS) para avaliar se nossas amostras seguiam um padrão de distribuição normal, conforme mostrado nas Figuras S2 e S3. A seguir, estudamos a proteína com diferenças significativas entre os grupos Wild Type e Mutant. A Tabela 1 mostra as proteínas com uma mudança significativa na abundância com um aumento de duas vezes (regulado para cima) ou diminuição (regulado para baixo) e um valor p ajustado significativo (de acordo com o teste t de Student paramétrico) em WT vs. Amostras MUT em p14 e p12. No total, seis proteínas mostraram diferenças significativas na abundância de proteínas entre os grupos WT p14 e MUT-p14 (cinco proteínas reguladas positivamente e uma proteína regulada negativamente). Entre WT-p12 e MUT-p12, 26 proteínas (20 proteínas reguladas positivamente e 6 proteínas reguladas negativamente) mostraram diferenças significativas (Figura 3a e Tabela 1). Graficamente, essas variações podem ser observadas através de gráficos de vulcões, que foram gerados traçando as alterações log (2) para todas as proteínas identificadas em relação ao seu valor p −log (10) (Figura 3b). Diferenças significativas entre os níveis de abundância de proteínas podem ser visualizadas no mapa de calor com valores individualizados de acordo com as áreas da biblioteca espectral, e seu nível de agrupamento na análise do mapa de calor do cluster (Figuras 3c e S4). Esses clusters detectados pela análise SWATH-MS nos ajudam a identificar aquelas amostras separadas qualitativamente, a serem consideradas para a análise quantitativa (Figura S5). Uma análise estatística multivariada não supervisionada foi realizada utilizando análise de componentes principais (PCA) para comparar os dados entre as amostras (Figura S6). Os dados do mapa de calor e do PCA demonstraram reprodutibilidade entre as triplicatas da amostra, já que as três réplicas se agruparam em ambas as análises. Podemos observar tanto no PCA quanto na análise de cluster do mapa de calor (Figuras S5 e S6) como algumas amostras não se agruparam corretamente, sobrepondo-se entre os dois clusters. No entanto, podemos ver a tendência de separar os dados nos clusters Wild Type e Mutant. O menor número de proteínas com diferenças significativas em p14 vs p12 poderia ser justificado pelos diferentes graus de gravidade (Figura 2), sugerindo que o número de proteínas e vias aumenta com base na gravidade e no estado da doença do fenótipo cístico.
3.3. Agrupamento, Enriquecimento de Via e Análise de Interação Proteína-Proteína da Expressão Gênica em PLD
Para estabelecer a função relacionada às proteínas diferencialmente expressas identificadas pela análise SWATH-MS, utilizamos diversas ferramentas de bioinformática e formas de análise. As análises de termos e caminhos da Gene Ontology (GO) foram realizadas usando FunRich [39,40], String [41] e Reactome [42]. As proteínas foram classificadas na análise de enriquecimento genético FunRich. Em relação ao processo biológico, o grupo de proteínas mais enriquecido para o grupo p14 (cístico leve) estava relacionado ao transporte de ácidos graxos e à biossíntese de prostaglandinas, e para o grupo p12 (cístico grave) com atividade de fibrinogênio/fibrina, adesão célula-célula/matriz e metabolismo. processo (Figura 4a, painel superior). ANXA2 e o complexo de fibrinogênio foram os dois componentes celulares mais enriquecidos nos grupos p14 e p12, respectivamente. Além disso, o espaço extracelular foi o componente celular com maior percentual de proteínas em ambos os grupos (Figura 4a, painel inferior). Da mesma forma, a mesma análise foi estabelecida com a análise de strings, identificando diferentes processos metabólicos como o principal processo biológico, e o espaço extracelular como o componente celular mais enriquecido; consistente com os resultados do GO (Figura S7a). Finalmente, repetimos a análise com a plataforma Reactome, descobrindo que o metabolismo e o sistema imunológico eram as vias mais enriquecidas (Figura S7b).
A análise proteína-proteína ou cluster baseada na análise de strings também foi realizada para investigar possíveis interações proteína-proteína (interações com evidências experimentais). Numerosas interações proteicas foram identificadas em diferentes grupos (Figura S8), mas um cluster em p14 e outro em p12 foram os mais relevantes com base no número de interações entre proteínas e no nível de expressão (Figura 4b). O cluster p14- contém proteína anexina A2 (ANXA2_P07356) associada a diversas funções celulares, como fibrinólise, motilidade celular (em células epiteliais), uma proteína relacionada à actina interações citoesqueleto e célula-matriz [43], interagindo com duas outras proteínas envolvidas no transporte lipídico intracelular (FABP1_P12710 e FABP5_Q05816). Curiosamente, outro grupo relevante de proteínas foi identificado no p12-cluster com uma interação proteína-proteína muito forte entre vários fibrinogênios (FGL1_Q71KU9, FIBB_Q8K0E8, FIBA{{22 }}E9PV24 e FIBGG_Q8VCM7). Os fibrinogênios estão envolvidos no crescimento de hepatócitos e medeiam a disseminação de plaquetas sanguíneas, colágeno intersticial e lesões fibróticas [44]. Além disso, descobriu-se que proteínas adicionais interagem com fibrinogênios (Figura S8), como o componente p amilóide sérico (SAMP_P12246), hemopexina (HEMO_Q91X72) ou hidroxiácido oxidase 2 (HAOX{ {37}}Q9NYQ2). Consistentemente com os resultados das sequências, os complexos ANXA2 e fibrinogênio também foram os componentes celulares mais enriquecidos identificados pela análise FunRich (Figura 4a). Curiosamente, ao comparar os dados obtidos pela análise DDA e SWATH, confirmamos que várias proteínas identificadas pelo SWATH também foram identificadas pela análise DDA, incluindo várias relacionadas às proteínas do complexo de fibrinogênio (SAMP/Apcs e S10A9/S100a9; Tabela S3).
3.4. Validação da análise SWATH-MS revela o complexo de fibrinogênio como um novo mecanismo molecular relacionado ao PLD
Com base nesses dados, selecionamos a partir da análise SWATH-MS (Figura S9) as proteínas alteradas relacionadas ao complexo de fibrinogênio nos estágios p12 e p14 para validação in vivo com RT-qPCR, Western blotting e imunohistoquímica, para estabelecer sua confirmação como possível alvos da doença. Oito de 10 dessas proteínas selecionadas foram validadas em nível de mRNA por RT-qPCR (Figura 5); um regulado positivamente no estágio 14-(ANXA2_P07356) e no grupo p12-(SAMP_P12246, FGL1_Q71KU9, ILK{{ 17}}O55222, S10A9_P31725, FIBB_Q8K0E8, HEMO_Q91X72, FIBA_E9PV24 e FIBG_Q8VCM7) e um down- regulamentado no grupo p12 (HAOX2_Q9NYQ2). Curiosamente, a expressão gênica das duas proteínas com maior distância ou menos interações com o grupo do fibrinogênio (ILK e S10A9) foram as únicas que não foram validadas (Figura 5c).
A regulação positiva do complexo de fibrinogênio (proteínas ANXA2, SAMP, FIBB, FIBA, FIBG e HAOX2) foi ainda confirmada por análise de Western blotting (WB) (Figura 6). No geral, a expressão gênica e o WB foram altamente consistentes com os dados proteômicos do SWATH-MS. Por fim, também realizamos validação imuno-histoquímica do complexo fibrinogênio em amostras de fígado mutante e policístico (Figura 7). A coloração de fibrinogênio foi fortemente regulada positivamente nas células epiteliais do revestimento de cistos e nas dilatações dos ductos biliares (Figura 7a). Estes resultados desmascaram, pela primeira vez, o complexo de fibrinogênio como uma possível via relacionada à cistogênese hepática e como um possível futuro alvo terapêutico para PLD.
Figura 5. Validação de possíveis alvos de PLD por RT-qPCR. Expressão gênica de 8 a 10 alvos selecionados correlacionados com dados SWATH-MS. RT-qPCRs de anexina A2 alvo p14 selecionada regulada positivamente (Anxa2) (a); p12 regulado positivamente tem como alvo o componente amilóide p, soro (Apcs, gene SAMP), semelhante ao fibrinogênio 1 (Fgl1), cadeia beta de fibrinogênio (Fgb), hemopexina (Hpx), cadeia alfa de fibrinogênio (Fga), cadeia gama de fibrinogênio (Fgg) (b), quinase ligada à integrina (Ilk) e proteína de ligação ao cálcio S10{{30}} A9 (S100a9) (c); e hidroxiácido oxidase 2 alvo p12 regulado negativamente (Hao2) (d). n=6 foi usado para cada grupo de proteínas. Gapdh foi usado como gene doméstico. As barras representam médias ± SEM. Foi utilizado o teste t de Student bicaudal e um valor de p < 0,05 foi considerado significativo. ns: não significativo (p maior ou igual a 0,05), * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.
Figura 7. O complexo de fibrinogênio é regulado positivamente no epitélio cístico. (a,b) Imagens representativas da imuno-histoquímica do fibrinogênio no ducto biliar (painel superior) e parênquima hepático (painel inferior) (a) e sua quantificação (b). n=6 foi usado para cada grupo. A análise imuno-histoquímica mostrou uma regulação positiva do fibrinogênio através do epitélio cístico. As amostras corresponderam ao grupo p12. Barras de escala representam 100 µm. Bd significa ducto biliar. As barras representam médias ± SEM. Foi utilizado o teste t de Student bicaudal e um valor de p < 0,05 foi considerado significativo. *** p < 0,001.
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