Análise proteômica e capacidades antivirais, anticancerígenas e antioxidantes in vitro dos extratos aquosos de cogumelos comestíveis Lentinula Edodes e Pleurotus Ostreatus

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Abstrato: Neste estudo, examinamos extratos aquosos dos cogumelos comestíveis Pleurotus ostreatus (cogumelo-ostra) e Lentinula edodes (cogumelo shiitake). A análise do proteoma foi realizada usando LC-Triple TOF-MS e mostrou a expressão de 753 proteínas por Pleurotus ostreatus e 432 proteínas por Lentinula edodes. Peptídeos bioativos: inibidor de dissociação de Rab GDP, superóxido dismutase, tiorredoxina redutase, serina proteinase e lectina, foram identificados em ambos os cogumelos. Os extratos também incluíam compostos bioativos promissores, incluindo fenólicos,flavonóides, vitaminas e aminoácidos. Os extratos mostraram-se promissoresatividades antivirais, com índice de seletividade (SI) de 4,5 para Pleurotus ostreatus contra adenovírus (Ad7), e uma leve atividade para Lentinula edodes contra herpes simplex-II(HSV-2). Os extratos não foram citotóxicos para células mononucleares de sangue periférico humano normal (PBMCs). Pelo contrário, eles mostraram citotoxicidade moderada contra várias linhagens de células cancerígenas. Além disso, a atividade antioxidante foi avaliada usando DPPHeliminação de radicais, eliminação de catiões radicais ABTS e ensaios ORAC. Os dois extratos mostraram potencialatividades antioxidantes, com a atividade máxima observada para Pleurotus ostreatus (IC50 ug/mL)=39,46 ± 1,27 para DPPH;11,22±1,81 para ABTS; e 21,40±2,20 para ensaios ORAC. Este estudo incentiva o uso desses cogumelos na medicina à luz de sua baixa citotoxicidade em PBMCs normais vis à vis suas capacidades antivirais, antitumorais e antioxidantes.

Palavras-chave: fungo da podridão branca; Pleurotus ostreatus; Lentinula edodes; shitake; antioxidante; antitumoral; antiviral

1. Introdução

Os cogumelos têm grandes perspectivas na medicina e na produção de nutracêuticos. Além de ter boas propriedades organolépticas e altos valores nutricionais, muitos cogumelos foram relatados como tendo uma infinidade de atividades farmacológicas [1-3]. Entre os cogumelos mais cultivados estão Lentinula edodes (cogumelo shiitake) e Pleurotus ostreatus (cogumelo-ostra). Shiitake vem em segundo lugar para Agaricus bisporus como o cogumelo comestível mais consumido em todo o mundo [4]. Este cogumelo tem promissores efeitos antibacterianos, antifúngicos, antivirais, hepatoprotetores, anti-hiperglicêmicos e imunomoduladores [5-7]. É rico em moléculas bioativas, sendo a mais estudada o “lentinan”, um polissacarídeo com ação contra bactérias, vírus e tumores, além do “lentinan”, que demonstrou auxiliar no controle da dislipidemia e da hiperglicemia [8]. Pleurotus ostreatus, a espécie mais comum do gênero Pleurotus [9], também conhecido como cogumelo ostra, é um decompositor de madeira e possui uma ampla gama de atividades biológicas [10]. Em comparação com outros cogumelos terapêuticos, os cogumelos ostra estão se tornando mais populares como promotores de saúde [11]. A presença de um grande número de componentes nutritivos como lectinas, polissacarídeos, vitaminas e minerais nos cogumelos ostra os torna capazes de possuir potencial anticancerígeno,antioxidante, propriedades antidiabéticas, antimicrobianas e anti-hipercolesterolêmicas [12,13]. Em comparação com outros cogumelos comestíveis, as ostras e os cogumelos shiitake têm um breve período de crescimento e podem ser colhidos durante todo o ano 14. Como resultado de sua facilidade de cultivo e teste, alto valor nutricional e benefícios medicinais promissores, esses cogumelos têm um enorme potencial nas indústrias alimentícia e farmacêutica [4,15]. De fato, Basidiomicetos superiores podem ser fontes alimentares multifuncionais promissoras.

Muitos compostos bioativos, incluindo açúcares, proteínas fisiologicamente ativas, ácidos graxos insaturados, fenólicos (ácidos fenólicos e polifenóis), flavonóides, terpenóides, glicoproteínas, policetídeos, esteróides e alcalóides, foram encontrados nesses dois cogumelos [16,17]. Esses compostos atuam única ou sinergicamente para provocar as amplas ações farmacológicas desses fungos. Os cogumelos shiitake e ostra são relatados como tendo atividades antibacterianas, antivirais, anti-hipertensivas, imunomoduladoras e antioxidantes [1,18,19]. Seo et ai. [20] resumiram os mecanismos da atividade antiviral de biomoléculas de cogumelos, indicando que a redução da infecção viral se dá principalmente pela interferência na captação do vírus nas células hospedeiras, sua replicação e sua síntese de proteínas e enzimas, além de estimular a resposta imune do hospedeiro [21]. Os antioxidantes são moléculas importantes frente às espécies reativas de oxigênio que estão por trás de muitos problemas de saúde. Uma vez que muitas bandeiras vermelhas foram levantadas contra o uso de antioxidantes sintéticos, o estudo de antioxidantes naturais tornou-se obrigatório [22]. O efeito antitumoral desses produtos de cogumelos foi relacionado a biomoléculas, incluindo glucanos, ergosterol, proteoglicanos e aminoácidos (arginina e glutamina) [23]. O mecanismo postulado subjacente a este efeito pode incluir a estimulação de linfócitos T, supressão da neovascularização e indução da morte de células cancerosas, além de desencadear a resposta imune contra células cancerosas [24,25].

A proteômica provou ser uma das ferramentas valiosas na biopesquisa, particularmente na pesquisa agrícola [26]. Lindequist et ai. [27]foram o primeiro grupo a esclarecer a importância do emprego da proteômica na pesquisa de cogumelos comestíveis. Eles enfatizaram a necessidade do uso de "ômicas" para o estudo de moléculas bioativas de fungos. A proteômica tem sido pouco usada na pesquisa de cogumelos comestíveis vis à vis fungos patogênicos [28]. Nesse sentido, os objetivos deste estudo foram analisar o proteoma de dois cogumelos comestíveis, Pleurotus ostreatus e Lentinula edodes, e investigar seu potencialantiviral, atividades antitumorais e antioxidantes.

2. Resultados

2.1.Análise de Proteção

A análise do proteoma foi conduzida usando a análise LC-Triple TOF-MS com uma taxa de descoberta falsa (FDR) de<5% and="" a"95%="" confidence="" of="" identification".="" for="" p.ostreatus,="" a="" total="" of="" 753="" proteins="" were="" identified,34="" of="" which="" were="" reversed="" hits.="" a="" total="" of="" 432="" proteins="" were="" detected="" in="" ledodes,="" 48="" of="" which="" were="" reversed="" hits.="" the="" recorded="" accession="" numbers="" of="" the="" proteins="" are="" included="" in="" tables="" s1="" and="" s2="" for="" p.="" ostreatus="" and="" l.edodes,="" respectively.="" in="" tables="" s1="" and="" s2,="" the="" ms-triple="" tof="" data="" were="" analyzed="" by="" proteinpilot="" with="" the="" paragon="" algorithm.="" proteins="" were="" identified="" with="" peptides="" that="" gave="" more="" than="" a="" 95%="" confidence="" of="" identification.="" bioactive="" proteins:="" rab="" gdp="" dissociation="" inhibitor,="" superoxide="" dismutase,="" thioredoxin="" reductase,="" serine="" proteinase,="" and="" lectin,="" were="" expressed="" in="" both="" p.ostreatus="" and="" l.edodes="" extracts="" [29-35].="" p.="" ostreatus="" also="" expressed="" osteolysis="" and="" pleurotolysin,="" whereas="" latch="" pin="" and="" valosin-containing="" protein="" were="" expressed="" by="" l.edodes.="" lc-triple="" tof-ms="" spectra="" of="" the="" mushroom="" extracts="" analyzed="" by="" analyst="" tf1.7.1="" (sciex="" software)="" are="" shown="" in="">

2.2. Total de Compostos Bioativos Conteúdo Total

Na avaliação dos teores totais, isso incluiu a avaliação dos carboidratos totais, proteínas, fenólicos e flavonóides. O extrato de P. ostreatus continha quase o triplo do número de carboidratos e o dobro do número de proteínas presentes no extrato de L.edodes; no entanto, mais flavonóides foram detectados no extrato de L.edodes do que no extrato de P. ostreatus (Tabela 1).

2.3. Moléculas Fenólicas e Flavonóides

Ambos os extratos de cogumelos continham catequina (detectada em um tempo de retenção de 26,48 min). P.ostreatus incluiu adicionalmente kaempferol e apigenina (detectado em tempos de retenção de 59,13 min e 59,56 min, respectivamente), enquanto L.edodes também continha quercetina (tempo de retenção=56.86 min; Tabela 2; Figura S1).

2.4.Vitaminas

Os teores de vitaminas solúveis em água e solúveis em gordura foram determinados por meio de HPLC (Tabela 3 e Figuras S2 e S3). Ambos os cogumelos são ricos em vitamina C, com quantidades detectáveis ​​de vitaminas B3, B6 e D. Não houve diferença significativa entre os dois cogumelos nas quantidades de vitaminas que possuem. Por outro lado, as vitaminas B1, B2, B9, A e E não foram detectadas em ambos os cogumelos.

2.5. Análise de aminoácidos

Um Sykam Amino Acid Analyzer foi usado para a análise de aminoácidos. Os teores de aminoácidos totais foram 5,14 e 4,35 em P.ostreatus e L.edodes, respectivamente, conforme mostrado na Tabela 4, e os dois cogumelos são ricos em ácido glutâmico. Enquanto a prolina foi detectada em uma concentração considerável (0,57 g/100g de proteína) no extrato de P. ostreatus, ela não foi detectada no extrato de L.edodes. Histidina e ácido aspártico não foram detectados em nenhum dos dois cogumelos.

2.6. Atividades biológicas

2.6.1. Atividade Antiviral

A atividade antiviral foi avaliada contra dois vírus: adenovírus e herpes simplex-II. Conforme mostrado na Tabela 5, o extrato de P.ostreatus mostrou uma atividade antiviral eficaz contra adenovírus, com um índice de seletividade tão alto quanto 4,5. Efeitos antivirais promissores também foram registrados para o extrato de P. ostreatus contra herpes simplex-II e para o extrato de L.edodes contra ambos os vírus. As Figuras S4 e S5 representam as curvas de dose-resposta.

2.6.2. Atividade citotóxica contra PBMCs humanos normais

Citotoxicidade mínima (IC50 ug/mL; 66,41±3,7 e 82,81±2,72, para P.ostreatus e L. edodes, respectivamente) foi registrada contra PBMCs humanos normais.

Contra Linhas Celulares de Câncer

Linhas celulares de câncer variadas foram usadas neste teste, incluindo câncer de próstata (DU-145 e PC3); carcinoma hepatocelular (HepG2); carcinoma colorretal (Colo-205); carcinoma do ceco (LS-513); câncer do colo do útero (HeLa); e adenocarcinoma de mama (MDA-MB-231 e MCF-7). A doxorrubicina foi usada como controle positivo (causou uma diminuição na viabilidade para 53% em HepG2;44% em MDA-MB-231;39% em PC3;35% em DU-145; 29% em MCF -7:25% em LS-513;23% em HeLa; e 19% em células Colo-205). Os resultados na Figura 2 mostram que o extrato de Ledodes e P. ostreatus diminuiu a viabilidade das linhagens de células cancerosas testadas de LS-513, HepG2, DU-145 e PC-3 em aproximadamente 20 por cento.

Contra Linhas Celulares de Leucemia e Linfoma

Extratos de cogumelos de P.ostreatus e L.edodes foram testados quanto à citotoxicidade contra células de leucemia (CCR-CEM, NB-4, THP-1) e linfoma (U937). A doxorrubicina foi o padrão positivo, causando uma diminuição na viabilidade celular para 29%, 25,5%, 20,3% e 19,1% nas células U937, NB4, CCRF-CEM e THIP1, respectivamente. O extrato de L.edodes diminuiu a viabilidade das células THP1 para 66,02 por cento, enquanto o extrato de P.ostreatus reduziu a viabilidade das células CCRF-CEM para 70,64 por cento (Figura 3).

2.6.3. Atividade antioxidante

Os resultados do efeito antioxidante foram estudados pelos três métodos de avaliação, a saber, DPPHeliminação de radicais, eliminação de catiões radicais ABTS e ensaios ORAC, em comparação com o padrão antioxidante, Trolox, são apresentados na Tabela 6 e na Figura S6a,b. Os resultados mostram que o extrato de P. ostreatus apresentou uma capacidade antioxidante mais potente do que o extrato de L.edodes, conforme indicado pelos três ensaios antioxidantes utilizados. A Figura 4 mostra o decaimento do sinal de fluoresceína induzido pelos extratos no ensaio ORAC.

3. Discussão

Os fungos da podridão branca têm despertado o interesse da comunidade científica devido às suas propriedades medicinais, que incluem modulação do sistema imunológico, atividade hipoglicemiante e antitrombótica, propriedades anti-hipertensivas, anti-inflamatórias, antimicrobianas e antitumorais, além da capacidade de reduzir os níveis de colesterol no sangue. 24,36-38]. Os dois fungos da podridão branca P. ostreatus e L.edodes são dois dos cogumelos comestíveis mais consumidos em muitos países [39]. Uma infinidade de proteínas bioativas são produzidas por esses dois cogumelos, e a análise de proteoma é atualmente a ferramenta mais eficaz para o perfil de proteínas [40]. No presente estudo, a análise do proteoma mostrou a expressão de proteínas bioativas, incluindo o inibidor de dissociação Rab GDP, tiorredoxina redutase, serina proteinase, superóxido dismutase e lectina nos dois cogumelos de testes. O inibidor de dissociação Rab GDP (Rab GDI) regula a função de Rab GTPases que desempenham um papel fundamental no tráfego de membrana em células tumorais. Assim, o uso de Rab GDI é uma estratégia anticancerígena promissora [29].

A serina proteinase contribui para aantiviralatividade de cogumelos comestíveis [30,31]. Além disso, Yap et al. (2018) relataram forte citotoxicidade seletiva da serina proteinase em face de uma linhagem de células de adenocarcinoma de mama humano (MCF7) e sugeriram que o mecanismo envolve o efeito colaborativo de mecanismos de morte celular extrínsecos e intrínsecos, além da estimulação de caspase{{ 4}} e-9 e inibição de Bcl-2 [41].

A ingestão deantioxidantesé uma estratégia profilática auspiciosa contra a fisiopatologia mediada por espécies reativas de oxigênio (ROS) [22]. Nossos resultados mostram a expressão de enzimas do sistema de defesa antioxidante por Pleurotus ostreatus e Lentinula edodes. Essas enzimas incluem superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase, que contrabalançam a produção de ROS [32]. A superóxido dismutase começa pela conversão do superóxido em peróxido de hidrogênio, que é, por sua vez, convertido pela catalase e glutationa peroxidase em água.

A expressão de lectina também foi detectada nos dois cogumelos. Muitos pesquisadores relataram os perfis biológicos notavelmente diversos da lectina com uma vasta gama de atividades que abrangem atividades anti-inflamatórias, antidepressivas, anticoncepcionais e vasodilatadoras [34,35,42]. Lectinas são proteínas de ligação a carboidratos com uma variedade de funções celulares, incluindo supressão in vitro e in vivo do crescimento tumoral através da ligação seletiva às membranas das células tumorais ou seus receptores, resultando na ativação de proteínas quinases ou modulação de respostas imunes através da produção de interleucinas. [43]. Além disso, as lectinas de cogumelos também têm um papel no desencadeamento de diferentes vias de morte celular, incluindo apoptose, necrose e/ou autofagia [42].

Nossos dados mostram a expressão tanto da osteólise quanto da pleurotolisina em Pleurotus ostreatus. Estas são proteínas formadoras de poros com atividades anticancerígenas altamente seletivas [44,45]. A ostreolisina é uma proteína citolítica de 15 kDa com capacidade de permeabilizar eritrócitos e outras células em concentrações submicromolares. Atua por mecanismo coloidosmótico e induz a formação de poros largos na membrana |46,47I. Nimri et ai. produziu pleurotolisina recombinante com potente atividade antitumoral contra células tumorais de cólon humano e de camundongo [48].

Em L.edodes, a proteína contendo valosina e o pino de trava foram expressos. A proteína contendo valosina foi previamente relatada como tendoantioxidantepropriedades que podem ajudar em síndromes neuronais, como doença de Alzheimer, esclerose lateral e demência [49-51]. A latcripina é um potencial agente anticancerígeno [50]. Riaz Ud Din et al. (2020) investigaram o mecanismo anticancerígeno do trinco contra linhas celulares de câncer de mama. Eles relataram sua capacidade de induzir a morte celular, bem como a autofagia, além de seu efeito inibitório na migração e invasão [52].

Uma gama de compostos bioativos foi quantificada em extratos de P.ostreatus e L.edodes. NPT's de 19,37 ± 0,39 e 24,14 ± 1.01 mg/g de extrato para P.ostreatus e L.edodes, respectivamente, foram detectados no presente estudo. Esses valores são superiores aos registrados por Rahimah et al., que utilizaram os testes de amônio e Shinoda para quantificar o teor total de flavonóides de P. ostreatus como 6,67 mg/g do extrato [53]. Além disso, nossos resultados são superiores aos encontrados por Montibus et al., que testaram o TPC em extratos de L edodes usando o método de Folin-Ciocalteu e encontraram 0.8-1,5 por cento de peso seco (PD) nas letras maiúsculas e 0.8-1,1 por cento dw nas letras [54].

Catequina foi detectada em extratos de P. ostreatus e L.edodes. A catequina é um metabólito fenólico secundário da planta, com potentes propriedades de eliminação de radicais livres. O extrato de L.edodes foi encontrado para conter o flavonóide quercetina. O efeito antioxidante da quercetina é mediado através da regulação dos níveis de glutationa e um aumento na produção de enzimas antioxidantes, incluindo glutationa transferase e Aldo-ceto redutase [56]. Além disso, a quercetina é relatada como tendo atividade antitumoral através da interrupção do ciclo celular e promoção da apoptose [57,58]. Lee et ai. relataram que a quercetina causa parada celular nas linhas celulares de câncer PC3, Du145 e U937 [59]. Nossos resultados também revelam que kaempferol e apigenina foram encontrados em P.ostreatus. Kaempferol e apigenina demonstraram ter atividades antioxidantes e antiproliferativas [60-62]. O ácido glutâmico foi considerado o aminoácido mais abundante em ambos os extratos de cogumelos. Na mesma linha, Chirinang et al. analisaram o teor de aminoácidos de P. ostreatus e P. major-caju e descobriram que o teor de ácido glutâmico foi o mais alto, seguido por ácido aspártico e depois arginina [63].

P.ostreatus e L. edodes mostraram atividades antivirais promissoras contra adenovírus e herpes simplex vírus-II, com o SI atingindo 4,5 para o extrato de P. ostreatus contra adenovírus. O SI foi utilizado para avaliar a eficácia e segurança dos extratos, pois estima a janela entre as atividades citotóxica e antiviral. Quanto maior o SI, mais seguro e eficiente o composto [64,65]. Dados relacionados foram mostrados recentemente por Urbancikova et al., onde suplementos à base de pleura (insolúvel -1,3/1,6-D-glucana isolado de P. ostreatus) reduziram significativamente a duração do vírus herpes simplex -I sintomas, com menor gravidade dos sintomas respiratórios, em pacientes herpes simplex vírus-I positivos do que o grupo placebo, sem efeitos colaterais significativos, propondo pleural para possível uso futuro no tratamento do herpes simplex vírus-I agudo [66].

O efeito antiviral dos cogumelos é principalmente devido à interferência na captação viral, replicação, atividade enzimática e peptídeos funcionais, além de potencializar o sistema imunológico do hospedeiro [67]. Seo e Choi (2021) propuseram que a -glucana na fração polissacarídica de P.ostreatus e L.edodes pode ser responsável por seu efeito anti-herpético através de efeitos pré e pós-tratamento [20]. O efeito anti-HIV dos extratos aquosos de P. ostreatus e L.edodes pode ser causado pela inibição da enzima transcriptase reversa pela proteína ubiquitina-like e leptina, respectivamente [68,69].

Os extratos aquosos de nossos cogumelos demonstraram inibir a viabilidade das linhagens de células cancerígenas testadas em aproximadamente 20%. Também observamos efeitos semelhantes contra linhagens celulares de leucemia e linfoma, com diminuição da viabilidade para 66% com o extrato de L.edodes contra células de leucemia THP1 e para 70,6% com o extrato de P.ostreatus contra células de leucemia CCRF-CEM. Extratos aquosos miceliais e de corpos frutíferos de L.edodes foram previamente relatados como exercendo ações antiproliferativas e apoptóticas em células de câncer de mama MCF-7[70]. A fração acetato de etila e -glucana de L.edodes foram os principais responsáveis ​​por essas ações[71,72]. No mesmo contexto, o extrato de P. ostreatus foi capaz de mostrar atividade antiproliferativa contra células de adenocarcinoma de mama MCF-7 e MDA-MB-231 [73], e os 6-glucanos ligados do extrato potencializou a citotoxicidade natural killer contra células de câncer de mama e pulmão [74]. Recentemente, Jakopovic et al. descobriram que as preparações de cogumelos medicinais consistindo de 6 e 10 cogumelos, incluindo L.edodes e P. ostreatus, exibiram efeitos antiproliferativos e pró-apoptóticos significativos em linhagens de células tumorais colorretais (HCT-116, SW620) [75]. Pelo contrário, os autores notaram que o efeito em uma linha celular de fibroblastos humanos (WI-38) era proliferativo, mostrando a especificidade dessas preparações de cogumelos para linhas celulares tumorais. Da mesma forma, detectamos citotoxicidade mínima excretada por nossos cogumelos contra PBMCs humanos normais. Essa descoberta também sugere o uso seguro de nossos cogumelos.

A citotoxicidade dos cogumelos tem sido atribuída a uma ampla gama de moléculas, incluindo x- e -glucanos, proteínas, glicoproteínas, ácidos graxos, antagonistas de nucleosídeos, terpenóides e compostos fenólicos. Abdala et ai. (2012) propuseram que os extratos de cogumelos suprimiam a proliferação de células de câncer de mama inibindo a atividade da aromatase [77]. Imam et ai. (2021) isolaram um ácido indol-3-láctico de Ledodes que inibiu a divisão de células de adenocarcinoma pulmonar [78]. Yukawa et ai. (2012) sugeriram que o efeito apoptótico direto dos micélios de L edodes nas células HepG2 é através da ativação das vias do receptor de morte de caspase-3 e -8 [79]. Wu et al.(2011) estudaram o efeito citotóxico do extrato proteico de P. ostreatus em células de adenocarcinoma colorretal humano (SW480) e uma leucemia monocítica humana, THP-1(células), e relataram geração de ROS, exaustão da glutationa, alteração do potencial de membrana mitocondrial e desintegração do DNA oligonucleossômico, resultando em apoptose das células SW480 [80].

Como os antioxidantes não atuam por meio de um único mecanismo, a avaliação da capacidade antioxidante geralmente é realizada por mais de um método [81]. Neste estudo, três métodos de avaliação foram utilizados, a saber, ensaios DPPH, ABTS e ORAC. O mecanismo antioxidante SET (transferência de um único elétron) foi avaliado através do ensaio DPPH, enquanto os ensaios ABTS e ORAC foram utilizados para reações HAT (transferência de átomos de hidrogênio) [81]. O ensaio ORAC fornece estimativas mais precisas, pois combina o tempo de inibição e o grau de inibição em um único termo [82]. Enquanto o ensaio de fosfomolibdato é comumente usado para expressar a capacidade antioxidante total (TAC), todos os três métodos usados

neste manuscrito foram relatados para avaliar o TAC. Munteanu e Apetrei (2021), em sua revisão dos métodos usados ​​na determinação da atividade antioxidante, descreveram o ensaio de eliminação de radicais ABTS como um "método simples e conveniente usado para medir a capacidade antioxidante total (TAC)" [83]. Em seu estudo comparativo, Csepregi et al. (2016) compararam quatro métodos utilizados para avaliação do TAC, que foi a capacidade antioxidante equivalente de Trolox (TEAC), o potencial antioxidante redutor férrico (FRAP), o 2,2-difenil-1-picrilhidrazil(DPPH) ensaio de eliminação de radicais e reatividade do reagente Folin-Ciocalteu (FCR)[84]. Em 2013, Ou et al. introduziram ORAC como um novo método para avaliação do TAC[85]. ) classificou o ensaio ORAC como um dos métodos diretos para a determinação do TAC, juntamente com o TEAC [86]. Os resultados dos ensaios ABTS e ORAC mostram que os extratos de P. ostreatus e L.edode possuem capacidades antioxidantes superiores às do antioxidante padrão, Trolox.

O efeito antioxidante dos dois cogumelos pode ser atribuído à presença de muitos componentes bioativos, incluindoflavonóides, fenólicos, peptídeos bioativos e vitamina C [87]. Gaber et ai. compararam os ensaios ABTS, DPPH, poder antioxidante redutor férrico (FRAP) e ORAC para avaliar a capacidade antioxidante de extratos de goiaba e relataram uma correlação positiva entre os poderes antioxidantes, determinados pelos quatro métodos, e o teor de vitamina C e NPT. Por outro lado, eles registraram uma correlação negativa com o teor de carotenóides [88]. DPPH(1,1-Difenil-2-picril-hidrazil) é um radical livre estável que tem um elétron de valência desemparelhado em um átomo da ponte de nitrogênio; assim, a eliminação do radical DPPH é a base do popular ensaio antioxidante DPPH[89]. O cátion radical 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato) (ABTS) perde sua cor azul quando reduzido por um antioxidante, e a alteração de cor pode ser quantificada espectrofotometricamente [90]. O ensaio ORAC mede a degradação oxidativa da sonda de fluorescência pelos radicais livres que são interrompidos pela substância antioxidante. Assim, quanto mais forte a capacidade antioxidante, menor o tempo necessário para extinguir a fluorescência [91]. Além disso, uma vez que os extratos testados mostraram efeitos antioxidantes promissores quando testados através dos métodos mencionados acima, pode-se concluir que eles atuam através deeliminação de radicais livres. No entanto, os cogumelos testados continham teores totais de flavonóides consideráveis ​​e, como os flavonóides foram associados à ativação do fator de transcrição Nrf2 (2017), isso pode ser adicionado como um mecanismo putativo [92].

4. Materiais e Métodos

4.1.Preparação de Espécies de Cogumelos e Subcultura

Os cogumelos P. ostreatus e L.edodes previamente identificados foram obtidos, como desova e/ou corpos de frutificação, da coleção de cultura do Centro de Pesquisa Agrícola, Cairo, Egito [93,94]. Lâminas cirúrgicas foram utilizadas para cortar o fruto assepticamente para subcultivo de corpos de frutificação de cogumelos. Os micélios internos foram colhidos usando agulhas estéreis e subcultivados em placas estéreis de Potato Dextrose Agar (PDA) (Merck, Darmstadt, Germany)95]. Para subcultivar as ovas fúngicas, foram utilizadas pinças estéreis para colher as sementes e transferi-las assepticamente para placas estéreis de PDA, que foram então incubadas a 28 graus por 7 dias, e os corpos de frutificação de cada linhagem foram lavados separadamente. Cada isolado (500 g) foi deixado por 48 h em temperatura ambiente para secar ao ar, moído manualmente em um moedor de cozinha e armazenado em temperatura ambiente em uma área bem arejada para uso futuro.

4.2. Extração aquosa de Pleurotus Ostreatus e Lentinus Edodes

Os frutos secos de cada isolado foram moídos em um pó de 500 g usando um liquidificador doméstico, depois macerados três vezes em 7L de água destilada em temperatura ambiente por três dias, ultrassônicos (limpador ultrassônico, Inglaterra, Reino Unido) e depois filtrados. O processo de maceração e filtração foi repetido até o esgotamento do líquido. O etanol foi usado para armazenar o rendimento. Após a evaporação do etanol a 45 graus, um total de 500 mL de cada isolado foi liofilizado para produzir aproximadamente 20 g de resíduo seco de cada extrato [96].

4.3. Análise proteômica

A análise proteômica foi realizada na unidade de proteômica e metabolômica do Children's Cancer Hospital Egypt 57.357(CCHE), Cairo, Egito. Cerca de 600 uL de 8 M de ureia em 500 mM Tris (pH8,5) e 60 uL de ultraproteases completas (Roche , Mannheim, Alemanha) foram adicionados a cada amostra e, em seguida, as amostras foram agitadas vigorosamente e centrifugadas a 10,000 RPM por 30 min. Os sobrenadantes foram coletados e frações (1 ug/10 μL) foram injetadas usando o sistema NanoLC. O sistema TOF triplo de espectrometria de massa (Sciex TripleTOF 5600 plus , AB SCIEX, Concord) foi acoplado a cromatografia líquida (LC) (3 um, ChromXP C18 CL, 120 A, 150 × 0,3 mm), consistindo de um amostrador automático Eksigent nanoLC400 acoplado a uma bomba Ekspert nanoLC425, com vazão de 10 μL/min por 55 min, para cada amostra [97]. A análise dos dados foi realizada pelo ProteinPilot (versão 5.0.1.0,4895) e pelo Algoritmo Paragon (versão 5.0.1.0,4874). As sequências de proteínas foram alinhadas contra sequências no banco de dados Swiss-Prot e TrEMBL (Pleurotus sp. contendo 14.792 entradas para P. ostreatus e Lentinula sp. contendo 12603 entradas para L.edodes)[98]. Proteínas comumente identificadas entre as espécies de cogumelos foram ilustradas usando o software Venny2.1.0.BioinfoGP [99] (Kingston upon Hull, Inglaterra, Reino Unido).

4.4. Caracterização de Compostos Bioativos

Conforme relatado anteriormente, o teor de carboidratos solúveis totais foi determinado usando a técnica de ácido sulfúrico de fenol [100]. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (DP), e os experimentos foram realizados em triplicata.

O conteúdo fenólico total (TPC) e o conteúdo total de flavonóides (TFC) foram determinados conforme relatado por Ryan et al. [101]. As amostras foram preparadas na concentração de 20 mg/mL em água. O ácido gálico (solução estoque de 1 mg/mL) foi preparado em metanol. Rutina (solução estoque de 1 mg/mL) foi preparada em metanol. Padrões e amostras de ácido gálico foram pipetados nos poços da placa em seis réplicas e medidos a 630 nm. Cada um dos 10 padrões e amostras de rutina em seis réplicas foi medido a 420 nm.

A análise por HPLC de fenólicos totais e flavonóides foi realizada de acordo com o método de Singh et al. [102]. Cada uma das amostras e 10 soluções padrão diferentes foram dissolvidas em metanol e filtradas usando filtros de seringa de 0,22 um e, em seguida, 100 μL de cada amostra e 10 uL de cada padrão foram injetados usando uma coluna de HPLC, Waters 2690 Alliance HPLC sistema equipado com um detector de arranjo de fotodiodos Waters 996. Coluna C18 Inertsil ODS3:4,6×250 mm,5 um; fase móvel: tampão (0,1 por cento de ácido fosfórico em água); o modo de eluição do metanol foi gradiente com uma taxa de fluxo de 1 mL/min a um comprimento de onda de 280 nm.

Para análise de vitaminas solúveis em água, os extratos de cogumelo testados (50 mg/mL), padrões de referência (10 mg em 10 mL de hidróxido de sódio 0,05 M) de cada um dos as sete vitaminas hidrossolúveis (tiamina HCl, ácido ascórbico, riboflavina, ácido nicotínico, nicotinamida, piridoxina HCl e ácido fólico)[103] e das vitaminas lipossolúveis, soluções (50 mg/mL) dos três extratos de cogumelos e uma solução padrão em metanol de três vitaminas lipídicas: E, D3 e A, a 806,2, 114 e 400 UI/mL, respectivamente, foi preparada. As soluções foram então diluídas para 100 ug/mL, filtradas usando um filtro de seringa de 0,22 um e 100 μL foram injetados em uma coluna de HPLC, sistema Waters 2690 Alliance HPLC (Milford, CT, EUA) equipado com um detector de matriz de fotodiodos Waters 996. Coluna Inertsil ODS 3∶4,6×250 mm,5 μm; fase móvel: tampão (0,85 g de sal de sódio de ácido hexano sulfônico em 1000 mL de água e o pH foi ajustado para 3 com ácido ortofosfórico); a eluição do metanol foi gradiente a uma taxa de fluxo de 1 mL/min a um comprimento de onda de 210 nm [104].

4.5. Análise de proteínas e aminoácidos

A composição de aminoácidos dos extratos de cogumelos foi avaliada usando um Sykam Amino Acid Analyzer (Sykam GmbH, Alemanha) equipado com um sistema de entrega de solvente, S 2100 (bomba quaternária com faixa de fluxo {{ 24}}.01 a 10.00 mL/min e pressão máxima de até 400 bar), um amostrador automático, S5200, um módulo de reação de aminoácidos, S4300 (com filtro duplo integrado fotômetro a 570 nm) e um organizador de reagentes refrigerado, S4130. Um grama de cada extrato de cogumelo foi misturado com 5 mL de hexano e deixado macerar por 24 h, e então a mistura foi filtrada usando Whatman no. 1 papel filtro. O resíduo foi colocado em um tubo de ensaio contendo 10mL6N HCl e incubado em estufa a 110 graus por 24 h. Após a incubação, a filtração foi realizada usando Whatman no. 1 papel filtro, seguido de evaporação em rotaevaporador. O resíduo foi dissolvido completamente em 2 mL de tampão de diluição (citrato trissódico desidratado 0,06 M, ácido cítrico 0,03 M, fenol 0,02 M, tiodiglicol 1,4 por cento, HCL 32 por cento), diluído 1000- vezes no mesmo tampão e então carregado em uma coluna de filtro de amônia (LCA, K04/Na, 4,6×100 mm, Sykam GmbH, Erasing, Alemanha) equipada com um analisador automático de aminoácidos (Sykam) [105].

4.6. Culturas de células

Células de câncer cervical (HeLa), leucemia monocítica aguda (Thpl), carcinoma colorretal (Colo-205) e carcinoma ceco (LS-513) foram mantidas em meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (Lonza, Colônia, Alemanha) suplementado com 100 mg/mL de estreptomicina, 100 unidades/mL de penicilina e 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor. Outras linhagens celulares: leucemia humana (CCRF-CEM); leucemia promielocítica aguda (NB-4); linfoma humano (U937); câncer de próstata (DU-145 e PC3); carcinoma hepatocelular (HepG2); adenocarcinoma de mama (MCF-7 e MDA-MB-231); Vero; e Hep{15}}, foram subcultivadas em Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; Invitrogen, Califórnia, EUA), e a incubação foi realizada a 37 graus em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2. As linhagens celulares foram obtidas da Nawah Scientific Inc. (Mokatam, Cairo, Egito), enquanto as células mononucleares primárias do sangue periférico (PBMCs) e células humanas normais (ATCC PCS-800-011TM) foram adquiridas da Viscera, Cairo, Egito. Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Farmácia da Universidade Ain Shams (Aprovação nº 294).

4.7. Atividade Antiorial

Atividade antiviralfoi testado contra adenovírus tipo 7 (Ad7) e vírus herpes simplex tipo II (HSV-2) (Nawah Scientific, Mokattam, Egito). A atividade antiviral foi avaliada conforme descrito anteriormente [106]. As células Vero e Hep-2 foram semeadas em uma placa de cultura 96-poço a uma densidade de 2×10* células/poço um dia antes da infecção. O meio de cultura de células (Seção 4.6) foi removido no dia seguinte e solução salina tamponada com fosfato (PBS) foi usada para lavar as células. A infectividade do adenovírus humano e do vírus herpes simplex tipo II foi determinada usando o método sulforrodamina B(SRB), que monitorou os efeitos citopáticos (CPE) e calculou a porcentagem de viabilidade celular [107]. A atividade antiviral foi calculada com base na capacidade dos extratos de cogumelos de inibir os CPEs virais, onde a concentração citotóxica de 50% (CC5o) e a concentração inibitória de 50% (IC50) foram determinadas usando o software GraphPad PRISM (Graph-Pad Software, San Diego , CA, EUA). O índice de seletividade (SD) foi calculado conforme afirmado por Dogan et al. [108] de acordo com a equação (1) Índice de Seletividade (SI)=CC50/IC50

4.8. Citotoxicidade contra PBMCs usando o ensaio MTT

A citotoxicidade foi avaliada usando o ensaio MTT【109】. Alíquotas（100 μL） de suspensões celulares (densidade celular 1.2-1.8×10* células/poço) foram plaqueadas em 96-placas de poço, meio completo foi adicionado e as células foram incubadas por 24 h. Em seguida, as células foram tratadas com diluições seriadas de extratos de cogumelos por 48 h. A solução de MTT (5 mg/mL) em PBS foi adicionada aos poços e incubada por 4 h, e a absorbância a 570 nm foi lida usando um leitor de microplacas. As células não tratadas foram usadas como controles negativos e as células tratadas com doxorrubicina (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemanha) serviram como controle positivo.

4.9.Eoaluation de Atividade Citotóxica UIsing SRB contra Linhagens de Células de Câncer

Citotoxicidade contra o câncer de próstata (DU{0}} e PC3); carcinoma hepatocelular (HepG2); carcinoma colorretal(Colo-205); carcinoma do ceco(LS-513); câncer do colo do útero (HeLa); e adenocarcinoma de mama (MDA-MB-231 e MCF-7) foram avaliadas usando ensaio colorimétrico de sulforrodamina B (SRB) [110]. Suspensões de células em meio completo (4.6) foram incubadas em 96-placas de poços por 24 h. Em seguida, várias concentrações (0 a 100 ug/mL em meio completo) de extratos de cogumelos foram adicionadas e incubadas por 72 h. As células não tratadas foram usadas como controles negativos e as células tratadas com doxorrubicina serviram como controle positivo.

4.10. A viabilidade de linhagens celulares de leucemia e linfoma usando o ensaio WST-1

A citotoxicidade contra leucemia humana (CCRF-CEM), leucemia promielocítica aguda (NB4), leucemia monocítica aguda (THP1) e linfoma humano (U937) foi determinada pelo ensaio de sal de tetrazólio solúvel em água (WST-1) usando Abcamkit ( ab155902 WST-1 Cell Proliferation Reagent, Reino Unido). As suspensões celulares foram incubadas por 24 h e então tratadas com diferentes concentrações (0 a 100 ug/mL em meio completo) de extratos de cogumelos por 48 h. As células foram então tratadas com 10 μL de reagente WST-1 por 1 h, e A450 foi lido usando um leitor de microplacas [111]. As células não tratadas foram usadas como controle negativo e as células tratadas com doxorrubicina (Sigma-Aldrich, Alemanha) serviram como controle positivo.

4.11. Atividade Antioxidante

4.11.1. Atividade de eliminação de radicais DPPH

O ensaio de eliminação do radical DPPH foi realizado de acordo com o método de Lu et al. [112]. A redução resultante na cor DPPH foi medida a 540 nm.Atividade antioxidantefoi expresso como a porcentagem de inibição com referência à curva de calibração (R2=0.9903). Os dados são representados como média±DP de acordo com a Equação (2):(Porcentagem de atividade antioxidante=[(abs-blank-abs-amostra)/abs-blank]×100)

(2) em que abs-blank e abs-sample se referem à absorbância do branco e da amostra, respectivamente. A concentração da amostra necessária para inibir metade dos radicais livres (IC50) foi estimada.

4.11.2.ABTS (2,2'-Azinobis-(3-etilbenztiazolina-6-ácido sulfônico))Atividade de eliminação de cátions radicais

O ensaio foi realizado conforme descrito anteriormente 【113】. Extratos de cogumelos（10 μL de soluções de 0 a 100 ug/mL）foram misturados com 190μL de ABTS (Sigma-Aldrich Germany) recém-preparados em 96-placas de poços e incubados no escuro à temperatura ambiente por 2h. Cada amostra foi testada em quatro réplicas e a absorbância foi medida a 734 nm. A atividade antioxidante foi expressa como uma porcentagem de inibição (Equação (1)) com referência à curva de calibração (R{10}}.9948).

4.11.3. Ensaio de Capacidade de Absorção Radical de Oxigênio (ORAC)

A análise foi realizada conforme determinado anteriormente [62], com pequenas modificações. Resumidamente, 12,5 μL dos extratos de cogumelos, em triplicata, foram incubados com 75 μL de fluoresceína (10 nm) por 30 min a 37 graus. A medição de fluorescência (485 EX, 520 EM, nm） foi realizada por três ciclos （tempo de ciclo=90 s）. Depois, 12,5 μL de solução de 240 mm recém-preparada de 2,2'-Azobis 2- dicloridrato de amidinopropano (AAPH) (Ab-cam, Cambridge, UK) foi adicionado a cada poço imediatamente e a medição de fluorescência continuou por 2,5 h (85 ciclos, a cada 90 s). O ensaio mede a perda de fluorescência de fluoresceína ao longo do tempo como resultado da formação do radical peroxil pela quebra do AAPH. Trolox(6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-ácido carboxílico), uma vitamina E solúvel em água análogo, serviu como um controle positivo inibindo o decaimento da fluoresceína de forma dose-dependente.A atividade antioxidante foi expressa como uma porcentagem de inibição (Equação(1) com referência à curva de calibração (R2= 0.9957).

4.12. Análise Estatística

Ensaios químicos triplicados foram conduzidos e os resultados foram expressos como média ± desvio padrão. As análises estatísticas foram realizadas por ANOVA de uma via.

A significância das diferenças entre as médias foi avaliada com o teste de comparações múltiplas de Tukey-Kramer. Um valor de p menor ou igual a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. A avaliação estatística foi determinada usando o software GraphPad PRISM (Graph-Pad Software, San Diego, CA, EUA).

5. Conclusões

Os cogumelos P. ostreatus e L.edodes contêm uma ampla gama de compostos bioativos. A análise do proteoma mostrou a expressão de múltiplas moléculas bioativas com inúmeras atividades biológicas. Os extratos aquosos dos cogumelos têmantiviralatividades contra adenovírus tipo 7 e vírus herpes simplex tipo II.CPEs foram detectadas contra linhas de células cancerosas, mas não contra PBMCs humanos normais. O presente estudo incentiva o uso desses cogumelos para fins farmacológicos devido à sua baixa citotoxicidade em PBMCs normais, além de suas capacidades antivirais, antitumorais e antioxidantes.

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