Ação promitótica de Oenothera Biennis em fibroblastos dérmicos humanos senescentes, parte 1

Abstrato: O acúmulo de fibroblastos dérmicos senescentes leva ao envelhecimento da pele. A reativação da proliferação é uma estratégia para modular a senescência celular. Recentemente, relatamos a composição química exata do extrato hidrofílico de culturas de células de Oenothera biennis (ObHEx) e mostramos suas propriedades antienvelhecimento da pele. Este trabalho visa avaliar seu efeito biológico especificamente na senescência celular. A ação ObHEx foi avaliada em fibroblastos dérmicos humanos normais submetidos à senescência prematura induzida por estresse (SIPS) por meio de uma análise proteômica ultraprofunda, levando ao proteoma associado à senescência mais global até agora. Os dados de espectrometria de massa mostram que o tratamento com ObHEx restabelece os níveis de proteínas mitóticas cruciais, fortemente reguladas negativamente em células senescentes. Para validar nossas descobertas proteômicas, provamos que ObHEx pode, em parte, restaurar a atividade da 'β-galactosidase associada à senescência', a marca registrada mais comum das células senescentes. Além disso, para avaliar se a regulação positiva dos níveis de proteína mitótica se traduz em uma reentrada no ciclo celular, experimentos FACS foram realizados, demonstrando uma reativação pequena, mas significativa, da proliferação de células senescentes por ObHEx. Em conclusão, o perfil do proteoma global associado à senescência profunda publicado aqui fornece um painel de centenas de proteínas desreguladas pelo SIPS que podem ser usadas pela comunidade para entender melhor a senescência e o efeito de novos moduladores em potencial. Além disso, a análise proteômica apontou para um efeito pró-mitótico específico de ObHEx em células senescentes. Assim, sugerimos o ObHEx como um poderoso adjuvante contra a senescência associada ao envelhecimento cutâneo.

O glicosídeo de cistanche também pode aumentar a atividade de SOD nos tecidos do coração e do fígado e reduzir significativamente o conteúdo de lipofuscina e MDA em cada tecido, eliminando efetivamente vários radicais reativos de oxigênio (OH-, H₂O₂, etc.) e protegendo contra danos ao DNA causados por radicais OH. Os glicosídeos feniletanóides cistanche têm uma forte capacidade de eliminação de radicais livres, uma capacidade redutora maior do que a vitamina C, melhoram a atividade de SOD na suspensão de esperma, reduzem o conteúdo de MDA e têm um certo efeito protetor na função da membrana espermática. Os polissacarídeos Cistanche podem aumentar a atividade de SOD e GSH-Px em eritrócitos e tecidos pulmonares de camundongos experimentalmente senescentes causados ​​por D-galactose, bem como reduzir o conteúdo de MDA e colágeno no pulmão e no plasma e aumentar o conteúdo de elastina, têm um bom efeito de eliminação no DPPH, prolonga o tempo de hipóxia em camundongos senescentes, melhora a atividade de SOD no soro e retarda a degeneração fisiológica do pulmão em camundongos experimentalmente senescentes Com degeneração morfológica celular, experimentos mostraram que Cistanche tem boa capacidade antioxidante e tem potencial para ser um medicamento para prevenir e tratar doenças de envelhecimento da pele. Ao mesmo tempo, o echinacoside em Cistanche tem uma capacidade significativa de eliminar os radicais livres DPPH e pode eliminar espécies reativas de oxigênio, prevenir a degradação do colágeno induzida por radicais livres e também tem um bom efeito de reparo nos danos causados ​​pelos radicais livres da timina.

Clique em Suplemento Cistanche Tubulosa

【Para mais informações:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Palavras-chave: Extrato hidrofílico de Oenothera biennis; senescência; fibroblastos; proteômica; espectrometria de massa; diaPASEF; mitose; envelhecimento da pele

1. Introdução

A senescência é a principal causa do envelhecimento e das doenças relacionadas à idade. As células senescentes sofrem interrupção da proliferação como resposta à erosão fisiológica dos telômeros (senescência replicativa) ou a gatilhos de estresse, incluindo danos ao DNA, estresse oxidativo, estirpe de organelas e ativação de oncogenes (senescência prematura induzida por estresse, SIPS) [1]. Apesar da interrupção do crescimento induzida pela resposta ao dano do DNA (DDR), as células senescentes exibem um alto estado metabólico e atividade lisossômica, crucial para o aumento da atividade secretora, conhecido como fenótipo secretor associado à senescência (SASP) [2,3]. Os fatores SASP incluem várias famílias de proteínas solúveis (interleucinas, quimiocinas, fatores de crescimento, proteases secretadas) e insolúveis (proteínas insolúveis secretadas e componentes da matriz extracelular) que afetam negativamente o tecido circundante, gerando um estado inflamatório crônico de baixo grau.

O acúmulo de fibroblastos senescentes na derme leva ao envelhecimento da pele, prejudicando a integridade da matriz extracelular (MEC) e a função das células endoteliais microvasculares vizinhas, melanócitos epidérmicos e queratinócitos [4-6]. As três principais estratégias para neutralizar a senescência incluem (i) a eliminação de células senescentes pela indução de apoptose ou ativação imune; (ii) a modulação do SASP e (iii) a reativação da proliferação celular. De fato, embora a senescência tenha sido originalmente descrita como uma parada irreversível do ciclo celular, as evidências atuais sugerem que a proliferação pode ser restaurada [7-9].

Nesse cenário, ingredientes capazes de prevenir e/ou modular a senescência celular são de grande interesse no campo cosmético como armas valiosas para combater o envelhecimento da pele. Em particular, extratos derivados da espécie Oenothera biennis (O. biennis, Evening Primrose), pertencente à família Onagraceae, são tradicionalmente utilizados para aplicações cosméticas devido às suas atividades anti-inflamatórias e antioxidantes [10]. Os extratos metanólicos preparados a partir de partes aéreas e extratos aquosos de folhas contêm principalmente ácidos fenólicos e flavonoides, enquanto os extratos metanólicos obtidos de raízes contêm principalmente esteróis e triterpenos [11]. Embora as atividades biológicas dos extratos alcoólicos e hidroalcoólicos da parte aérea tenham sido demonstradas [12–14], os extratos mais utilizados de O. biennis são os óleos obtidos das sementes, que são extremamente ricos em ácidos graxos. De fato, devido ao seu alto teor de ácido linoléico (LA) e ácido -linolênico (GLA), os óleos de sementes de O. biennis melhoram o bom funcionamento da pele e, em particular, demonstraram efeitos benéficos em pacientes com dermatite crônica [11, 15].

Mais recentemente, extratos obtidos de culturas de células de O. biennis foram propostos para substituir totalmente os extratos de plantas espontâneas, pois são biossustentáveis, livres de contaminantes e misturas padronizadas de metabólitos secundários [16]. É precisamente a combinação dos compostos com seu efeito sinérgico que é responsável pela atividade global dos extratos botânicos [17].

Aqui, focamos no extrato hidrofílico de culturas de células de O. biennis (ObHEx), rico em lignanas e triterpenos, pois mostrou propriedades antienvelhecimento da pele quando testado em modelos in vitro e ex vivo [18]. A caracterização química baseada em espectrometria de massa deste extrato revelou que ele contém várias classes de metabólitos secundários interessantes. Eles pertencem a lignanas (salvadoraside e liriodendron) e triterpenos (ácido muriático, ácido arjunólico, ácido aspártico e hederagenin), alguns dos quais foram previamente associados à produção de pró-colágeno I em fibroblastos humanos [19,20]. Em particular, já provamos que o ObHEx promove a contração do colágeno da matriz, a polimerização da actina e a produção de proteínas ECM, melhorando assim a firmeza e a elasticidade da pele, por meio de um aumento na expressão do gene da quinase da cadeia leve da miosina (MYLK).

Até o momento, os mecanismos moleculares dos efeitos do ObHEx no envelhecimento da pele e na senescência celular, em particular, não foram investigados. Este trabalho visa explorar a atividade ObHEx em fibroblastos dérmicos humanos senescentes. Usamos uma abordagem proteômica ultraprofunda de espectrometria de massa independente de dados para obter dicas do mecanismo de ação e métodos bioortogonais para validá-lo e investigá-lo (Figura 1).

2. Resultados

A senescência prematura induzida por estresse (SIPS) foi realizada em fibroblastos dérmicos humanos normais (NHDF) por tratamento com peróxido de hidrogênio (H2O2). Células senescentes induzidas por estresse oxidativo são um excelente modelo in vitro para pesquisa de envelhecimento e o H2O2 é amplamente utilizado para alcançá-lo [21,22].

Para entender as vias biológicas alteradas por ObHEx em células senescentes de NHDF, usamos uma abordagem proteômica ultraprofunda. As células SIPS e controle foram tratadas ou não por 48 h com o extrato a 00,01 por cento (p/v), pois, a partir do ensaio MTT relatado em [18], isso resulta na maior concentração que não causa qualquer toxicidade celular após 48 h de incubação.

Os lisados ​​celulares foram então submetidos a digestão tríptica e análise nano-UPLC MS/MS. Para obter a profundidade ideal do proteoma, os dados de espectrometria de massa foram adquiridos no modo Data Independent Acquisition (DIA), que permitiu a quantificação robusta de 9.650 proteínas (Tabela S1), com integridade de dados de 98%. Nosso estudo relata a análise de proteoma mais completa de células senescentes até o momento.

2.1. Avaliação de Senescência Prematura Induzida por Estresse (SIPS)

Em primeiro lugar, verificamos se a indução de senescência em NHDF foi bem-sucedida, analisando o proteoma global de NHDF2-tratado com H2O por espectrometria de massa (MS) e examinando sua morfologia por citometria de fluxo.

2.1.1. Avaliação de SIPS por espectrometria de massa (MS)

Para avaliar a indução de SIPS, comparamos o proteoma total de células NHDF tratadas com H2O2- versus células não tratadas. Entre as 3256 proteínas desreguladas, vários biomarcadores de senescência foram significativamente alterados (Figura 2A, B). Em primeiro lugar, observamos a regulação positiva do biomarcador de células senescentes mais amplamente utilizado, a 'β-galactosidase associada à senescência' (SA- -gal, GLB1). Os níveis aumentados das enzimas lisossômicas GLB1 e alfa-L-fucosidase tecidual (FUCA1), que também foram superreguladas pela EM, refletem o incremento característico no conteúdo lisossômico das células senescentes [23,24]. De fato, os lisossomos favorecem os processos catabólicos, que fornecem energia e matérias-primas necessárias para a secreção associada à senescência [25].

Em segundo lugar, o nível de proteína de serina/treonina-proteína quinase ATR e serina-proteína quinase ATM, ambos envolvidos na sinalização DDR, também foi encontrado aumentado [26]. A DDR é ativada por danos no DNA nuclear, geralmente associados ao estabelecimento da senescência celular, e converge para a ativação do supressor tumoral p53. Além disso, a regulação positiva das variantes da histona 2A MACROH2A1 e MACRO2A2 também foi observada. Essas proteínas participam da formação dependente de ATR dos focos de heterocromatina associados à senescência (SAHFs), estruturas de cromatina densas e repressivas características de células senescentes [1,2,27].

Por fim, os níveis desregulados do inibidor 1A ou p21 da quinase dependente de ciclina (CDK1NA) e da proteína marcadora de proliferação Ki-67 (MKI67) refletem a parada do ciclo celular senescente na fase G2 [28,29]. De fato, p21 aumenta os níveis, promovidos por uma via p53 induzida por danos no DNA, e inibe o complexo CDK2-ciclina E. Isso causa a desfosforilação da proteína do retinoblastoma (RB), que em seu estado hipofosforilado sequestra E2F, fator de transcrição que favorece a progressão do ciclo celular [2].

Além desses marcadores de senescência já conhecidos, uma análise mais ampla de enriquecimento de vias das proteínas mais reguladas em células tratadas com H2O2 versus células de controle aponta para a ativação da via p53/p21 induzida por danos no DNA (Figura 2C, Tabela S2). Em vez disso, as proteínas associadas à proliferação e à mitose são reguladas negativamente, apontando para a consequente parada da proliferação (Figura 2D, Tabela S3).

2.1.2. Avaliação de SIPS por Citometria de Fluxo

A SIPS também foi confirmada por análise de citometria de fluxo. Observamos um aumento na granularidade citoplasmática de células tratadas com H2O2-(Figura S1A, B), devido ao aumento no número e tamanho dos lisossomos em células senescentes. Este é o resultado do equilíbrio entre o acúmulo gradual de lisossomos disfuncionais e a produção de novos [25]. Além disso, também detectamos um acúmulo intra-lisossomal de agressomos de lipofuscina: esse crescimento, associado a um incremento de autofluorescência no canal passa-banda 525/50 nm do citômetro de fluxo, é outro marcador de senescência relacionado a um mau funcionamento lisossômico (Figura S1C, D) [30].

2.2. Proteínas mitóticas parcialmente restauradas ObHEx diminuídas em células senescentes de NHDF

O tratamento com ObHEx foi capaz de restaurar parcialmente os níveis de 71 proteínas desreguladas na condição senescente (teste ANOVA de duas vias q-valor < 0,05). Mais precisamente, 46 proteínas foram reguladas negativamente pelo extrato e 25 foram reguladas positivamente (Figura 3A, Tabelas S4 e S5).

A análise do enriquecimento reativo das 46 proteínas cujos níveis foram diminuídos pelo ObHEx sugere que o extrato pode reduzir a ativação da via p53 e afetar o metabolismo do fosfatidilinositol e a sinalização Hedgehog, cujas alterações foram encontradas no envelhecimento [31,32] (Figura 3B, Tabela S6).

Em relação às 25 proteínas suprarreguladas, a análise de enriquecimento aponta para a reativação da via do ciclo celular mitótico e, em particular, para o desenrolamento e replicação do DNA, condensação cromossômica e resolução das cromátides irmãs (Figura 3C, Tabela S7).

Uma análise aprofundada mostra que 18 das 25 proteínas restauradas se agrupam fortemente (Figura 4A). Neste cluster, é possível discernir CDK1, todas as subunidades do complexo condensina I (SMC2, SMC4, NCAPD2, NCAPH e NCAPG), três proteínas relacionadas ao cinetócoro (KNTC1, NUF2 e TRIP13), todas as seis subunidades do complexo replicativo de manutenção do minicromossomo (MCM) (MCM2-7) juntamente com IQGAP3, PBK e DHFR.

A capacidade do ObHEx de restaurar parcialmente os níveis dessas proteínas é bem mostrada nos gráficos de perfil da Figura 4B: os níveis de expressão da proteína permaneceram praticamente inalterados nas células proliferativas tratadas ou não com o extrato, diminuíram nas células senescentes e aumentaram parcialmente após Tratamento ObHEx.

2.3. Ensaios biológicos confirmaram o mecanismo de ação promitótico ObHEx

A característica mais comum das células senescentes é o aumento da atividade SA{{0}}gal que pode ser avaliada por um ensaio de coloração. Nossos resultados mostram que o tratamento com H2O2 induziu um aumento significativo no número de células SA- -gal positivas (azul), de 4,7 por cento para 22,9 por cento (Figura 5A, B). A incubação ObHEx reduziu significativamente a atividade SA- -gal com uma diminuição de 38,4 por cento (p <0,01).

Além disso, para avaliar se a restauração da expressão da proteína mitótica por ObHEx se traduz na reativação do ciclo celular, as células controle e senescentes foram tratadas ou não com o extrato por 72 h e experimentos de Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) foram realizados. Os resultados das células senescentes mostraram um bloqueio nas fases G2/M do ciclo celular (36,8 por cento ), enquanto apenas uma fração muito menor das células controle (7,2 por cento ) encontravam-se nessas fases, pois atingiram a confluência, de acordo com a literatura [ 33] (Figura 5C, D). O tratamento de células senescentes com ObHEx foi capaz de reduzir a população G2/M em 4,3 por cento (p < 0,05). É importante notar que, quando relacionado à porção de células senescentes após SIPS (22,9 por cento), o escape G2/M pode ser estimado em 18,9 por cento. O mesmo tratamento ObHEx por 48 h foi realizado, mas os resultados não foram estatisticamente significativos.

【Para mais informações:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】