Produção de Lipase por Yarrowia Lipolytica em Fermentação em Estado Sólido Usando Subprodutos de Frutas da Amazônia e Farelo de Soja Como Substrato Parte 1

Abstrato: A produção de ácidos graxos poliinsaturados a partir do óleo de peixe, que está relacionada a vários benefícios à saúde, incluindo efeitos contra doenças cardiovasculares, efeitos anti-hipertensivos, anticancerígenos, antioxidantes, antidepressivos, antienvelhecimento, antiartrite, entre outros, pode ser vantajosamente realizada por meio de aplicação de lipase. No entanto, o alto custo associado à produção de enzimas pode inviabilizar o processo e, portanto, substratos alternativos devem ser investigados para solucionar esses problemas. Esta pesquisa teve como objetivo produzir lipase por Yarrowia lipolytica IMUFRJ50682 em fermentação em estado sólido utilizando subprodutos da indústria de processamento de alimentos (torta de andiroba e farelo de soja) e verificar o potencial de aplicação na hidrólise inicial de óleo de peixe para produzir ainda mais ácidos graxos poliinsaturados em um processo adequado. Foi realizada triagem para análise das combinações de torta de andiroba e farelo de soja em diferentes proporções (0:1{{20}}0 a 100:0, respectivamente) às 48 h do processo de fermentação. Posteriormente, a matriz sólida composta por farelo de soja e torta de óleo de andiroba foi suplementada com óleo de soja e Tween 80 para melhorar a atividade da lipase. O extrato enzimático foi caracterizado pelo perfil protéico por eletroforese. Finalmente, o extrato enzimático e o biocatalisador sólido produzido foram aplicados para avaliar o potencial de hidrólise do óleo de peixe em um estudo inicial. A atividade lipolítica máxima (63,7 U·g −1 ) foi obtida com a torta de óleo de andiroba e farelo de soja (50:50) após 24 h de fermentação. O óleo de soja 1,5 por cento e Tween 80 (0,001 por cento ) em emulsão proporcionaram um aumento de 1,5-vez (82,52 U·g −1 ) na atividade enzimática. A análise eletroforética demonstrou uma banda entre 37 e 40 kDa que pode estar relacionada à lipase e uma banda de 75 kDa referente à subunidade da -conglicinina presente no farelo de soja. Após 48 h, o biocatalisador sólido apresentou maior grau de hidrólise (DH) (71,0 por cento ) do que o extrato enzimático (61,5 por cento ). O biocatalisador sólido permaneceu estável durante o armazenamento em temperatura ambiente por 7 meses. A produção de lipases utilizando subproduto da fruta amazônica e farelo de soja em fermentação em estado sólido é viável, bem como a aplicação do extrato e biocatalisador sólido na aplicação inicial para a hidrólise de óleo de peixe para posterior produção de ácidos graxos poliinsaturados de forma industrial. processo adequado.

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Palavras-chave: Carapa guianensis Aublet; produção de lipase; fermentação em estado sólido; sustentabilidade; Yarrowia lipolytica

1. Introdução

As frutas amazônicas apresentam alto potencial biotecnológico para pesquisa e aplicação em diversos setores da economia, como a indústria farmacêutica e alimentícia, devido à presença de macro e micronutrientes como proteínas, carboidratos, fibras, carotenoides, ácidos graxos poliinsaturados, vitaminas, entre outros. [1].

A andiroba (Carapa guianensis Aublet) é uma planta amazônica que produz frutos oleaginosos com potencial comercial para extração de óleo com propriedades medicinais como analgésico, anti-edematogênico e anti-inflamatório [2,3]. Além disso, apresenta propriedades tecnológicas interessantes para a indústria cosmética por ser rico em compostos emolientes, sendo fornecido como insumo para indústrias cosméticas em todo o mundo [4]. O fruto da andiroba é uma cápsula que pesa entre 90 e 540 g e é composto por 1 a 16 sementes marrons, pesando entre 1 e 70 g. Para obter o óleo, as sementes são quebradas em pequenos pedaços e secas em fornos até atingirem 8% de umidade. Em seguida, são prensados ​​em prensas metálicas do tipo expeller [5], produzindo o óleo de andiroba que apresenta grande interesse industrial e alto valor comercial, pois este produto pode ultrapassar os 50 dólares o litro, dependendo de suas características [6].

A produção anual de andiroba é de cerca de 122,16 toneladas [7] e a produção de óleo não ultrapassava 30% do peso do fruto [8]. Esses números significam que aproximadamente 36.648 toneladas de óleo e 85.512 toneladas de torta são geradas anualmente. O subproduto obtido após a exploração dessas frutas ainda pode conter lipídios (20 por cento ), cinzas (4,2 por cento ), proteínas (7,3 por cento ) e carboidratos (17 por cento ) e, devido a essa composição, seu uso em processos biotecnológicos é interessante [9]. Uma maneira de aplicar esses subprodutos é através da fermentação em estado sólido (SSF) para produzir compostos de alto valor agregado, como enzimas.

A fermentação em estado sólido é realizada usando uma matriz sólida na ausência de água livre, mas o sólido deve ter umidade suficiente para o crescimento microbiano [10]. O uso de SSF foi relatado para produzir compostos de aroma [11], antibióticos [12], ácidos orgânicos [13], biopesticidas [14], biosurfactantes [15], enzimas [16] e outros compostos. A produção de enzimas na FES requer o uso de microrganismos como fungos e bactérias que crescem em condições comumente utilizadas na FES. Dentre os microrganismos utilizados biotecnologicamente, destacam-se as leveduras, principalmente a Yarrowia lipolytica, devido ao seu potencial produtor de lipases [10].

Yarrowia lipolytica é uma levedura não convencional que tem uma temperatura máxima de crescimento de 32–34 ◦C e é incapaz de sobreviver em condições anaeróbicas. Y. lipolytica é classificado como geralmente reconhecido como seguro (GRAS) pela Food and Drug Administration (FDA) e isso permite seu uso seguro em processos/produtos alimentícios e farmacêuticos [9]. Esta levedura é reconhecida como produtora de lipases intracelulares, extracelulares e associadas à parede celular. A Yarrowia lipolytica pode produzir lipases usando uma variedade de fontes de carbono, incluindo óleos, ésteres metílicos e ácidos graxos. As características mencionadas tornam Y. lipolytic versátil para aplicações biotecnológicas, especialmente na produção de lipases.

Lipases (triacilglicerol acil hidrolases EC 3.1.1.3) são enzimas que catalisam a hidrólise de triglicerídeos em ácidos graxos livres e glicerol na presença de água [18]. As lipases podem ser aplicadas em vários setores, incluindo a indústria de alimentos, entre outros. O uso de lipases tem sido relatado na hidrólise de leite, gordura e amadurecimento de queijos, na modificação de gorduras de manteiga, na melhoria do aroma de bebidas e panificação, no tempero de alimentos e no desenvolvimento do sabor de carnes e peixes. [19]. Além disso, lipases já foram aplicadas na hidrólise de óleos para concentração de ácidos graxos poliinsaturados que podem ser utilizados na indústria alimentícia como suplemento enriquecido [20].

Vários estudos têm relatado a utilização de resíduos e subprodutos na produção de lipase, entre eles a casca de soja, casca de melancia, farelo de algodão, farelo de soja e torta de óleo de andiroba [9,21-26]. Entretanto, a combinação da torta de óleo de andiroba e farelo de soja em diferentes proporções para produção de lipase por Yarrowia lipolytica ainda não foi relatada. Esta pesquisa teve como objetivo produzir lipase de Yarrowia lipolytica por fermentação em estado sólido (SSF) utilizando subprodutos da indústria de processamento de alimentos (torta de óleo de andiroba e farelo de soja) para aplicar na hidrólise de óleo de peixe para posterior produção de ácidos graxos poliinsaturados.

2. Resultados e Discussão

A estratégia adotada para produção de lipase por Yarrowia lipolytica em FES utilizando a combinação de torta de óleo de andiroba e farelo de soja em diferentes proporções foi baseada no fluxograma apresentado na Figura 1.

2.1. Caracterização de subprodutos agroindustriais

A composição físico-química da torta de óleo de andiroba é apresentada na Tabela 1. A torta de óleo de andiroba apresentou 13,7 por cento de proteínas, 26,9 por cento de extrato etéreo, 0,4 por cento de carboidratos e 45,6 por cento de fibras insolúveis. Por outro lado, o farelo de soja apresentou 48,3 por cento de proteínas, 2,4 por cento de extrato etéreo, 14,0 por cento de carboidratos e 18,0 por cento de fibras insolúveis. Cada nutriente presente na torta tem um papel no metabolismo microbiano. O teor de nitrogênio é essencial para a síntese de proteínas, nucleotídeos e metabólitos secundários para o crescimento e metabolismo de microrganismos, bem como para a biossíntese de enzimas [25]. O teor de óleo residual (extrato etéreo) presente na torta de óleo de andiroba atua como fonte de carbono, participando da formação da biomassa e da produção de energia para o desempenho da função celular [26]. Adicionalmente, o óleo presente na torta de andiroba é um substrato hidrofóbico e pode atuar como indutor na produção de lipase, conforme relatado por Brígida et al. [17]. Inicialmente, a lipase ligada à célula do microrganismo hidrolisa o lipídio presente no meio e inicia o crescimento celular. Ao longo do processo, a disponibilidade de substrato diminui, de modo que o organismo secreta lipases extracelulares [27].

As cinzas quantificadas na torta de óleo de andiroba (4,5 por cento) e no farelo de soja (6,3 por cento) representam o teor de vários minerais e podem ser utilizadas no metabolismo do microrganismo; no entanto, alguns minerais, como íons de sódio e manganês, podem inibir o crescimento da Yarrowia lipolytica [17] e, portanto, é necessário avaliar adequadamente os subprodutos.

O conteúdo de carboidratos e fibras nas matérias-primas pode ser usado na nutrição microbiana de forma limitada, uma vez que a Yarrowia lipolytica não produz amilases ou celulases e hemicelulases [28,29], dificultando a quebra desses polissacarídeos e liberando compostos ricos em carbono para ser usado no metabolismo da levedura. Assim, sugere-se que o crescimento da levedura se deva principalmente à presença dos substratos hidrofóbicos na torta.

Os valores de porosidade da torta de andiroba e do farelo de soja são apresentados na Tabela 1. De acordo com a Tabela 1, a porosidade da torta de andiroba e do farelo de soja foram 0,425 e 0,412 m3 cama de ar m-3, respectivamente. Valores de porosidade mais altos estão associados a uma melhor transferência de massa e calor durante a fermentação, levando a uma melhor produção de enzimas. Além disso, a porosidade é um parâmetro importante para entender a umidade do meio: altos valores de umidade podem estar associados a baixos valores de porosidade, e isso afeta a aeração do meio e, consequentemente, a produção de lipase [22].

2.2. Produção de lipase por SSF

A utilização de subprodutos para produção de lipase por fermentação em estado sólido e produção de biocatalisadores sólidos estáveis ​​permite a aplicação da enzima diretamente no meio reacional, reduzindo custos associados à extração e purificação da enzima para posterior aplicação. Além disso, a utilização de subprodutos fornece nutrientes para o crescimento e desenvolvimento microbiano, atua como suporte físico para o microrganismo e reduz o custo do meio de cultura para o processo. Além disso, a fermentação em estado sólido permite o aproveitamento de resíduos e subprodutos agroindustriais, sendo uma alternativa para reduzir os problemas ambientais associados ao descarte inadequado de resíduos [30].

Após a caracterização, os subprodutos foram utilizados como substrato de matriz sólida na produção de lipase usando SSF, sendo monitorados quanto às atividades lipolítica e proteolítica, umidade e pH durante o processo de fermentação. A Figura 2 mostra os perfis das variáveis ​​de resposta medidas ao longo de 48 h de fermentação usando Y. lipolytica e a combinação de torta de óleo de andiroba e farelo de soja em diferentes proporções como substratos.

Com relação ao uso dos substratos individualmente, a atividade lipolítica máxima de 4,36 U·g −1 foi encontrada para o farelo de soja (0:100; Figura 2A) e 13,48 U·g −1 para torta de óleo de andiroba (100:0; Figura 2B), após 12 e 24 h, respectivamente. Após atingir o ponto de maior atividade da lipase, observou-se uma redução em seus valores, o que pode estar relacionado ao aumento da atividade da protease. Essa enzima tem afinidade por estruturas de proteínas e, devido a isso, pode atuar degradando a estrutura da lipase, reduzindo sua atividade [24,31,32].

A torta de andiroba e o farelo de soja utilizados em diferentes proporções de (25:75), (50:50) e (75:25) produziram os valores máximos de atividade da lipase de 57,21 U·g −1 após 12 h (Figura 2C), 63,70 U·g −1 (Figura 2D) e 40,13 U·g −1 (Figura 2E) após 24 h de fermentação, respectivamente, indicando que a mistura das matrizes pode melhorar a atividade da lipase. A melhora na atividade enzimática após a combinação da torta de andiroba com o farelo de soja pode ser explicada observando-se as composições físico-químicas de ambas as matérias-primas, conforme Tabela 1. O farelo de soja tem alto teor de proteína enquanto a torta de andiroba tem maior teor de óleo . Assim, a mistura de torta de andiroba e farelo de soja para produção de lipase se mostrou mais interessante do que o uso de cada um separadamente, o que favorece a não dependência de um único substrato, bem como a utilização de mais de um subproduto.

O pH inicial das matrizes é ácido devido à presença de ácidos graxos livres presentes na matriz oleaginosa, e esta condição favorece o crescimento da Yarrowia lipolytica, uma vez que esta levedura necessita de um meio levemente ácido para um bom crescimento [33], evitando uma etapa de tamponamento do meio. Há também um aumento gradual do pH ao longo do processo nas matrizes variando de 6,39 a 7,32 (Figura 2A), 5,69 a 6,82 (Figura 2C), 5,64 a 7,68 (Figura 2D) e 5,21 a 6,03 (Figura 2E). Na matriz contendo apenas torta de óleo de andiroba, observou-se uma queda gradativa do pH (4,8 para 4,26, Figura 2B) devido ao teor residual de óleo no meio sólido, uma vez que o óleo é inicialmente hidrolisado pela lipase, não sendo consumido pela levedura em nas primeiras horas, mantendo assim um pH ligeiramente ácido.

Com relação ao teor de umidade, não foram observadas variações ao longo da fermentação, demonstrando que o sistema de incubação com umidade saturada e as matrizes foram eficientes em reter a umidade. Um meio de fermentação capaz de manter um teor de umidade ideal é essencial para a produção de lipase por Yarrowia lipolytica [24], uma vez que este parâmetro pode afetar a aeração do sistema. Além disso, o teor de umidade ideal é necessário para fornecer a água necessária para o metabolismo do microrganismo e para solubilizar os nutrientes. Quando o teor de umidade está acima do ideal, pode ocorrer uma má difusão do oxigênio no sistema, ficando fora da faixa ideal para o microrganismo [34].

Alguns estudos relataram o uso de subprodutos como substratos na fermentação em estado sólido. No entanto, nesses estudos, há incorporação de fontes puras de carbono e/ou nitrogênio, como glicose, extrato de levedura, peptona e uréia [35-37] em quantidades que podem aumentar os custos do processo. A matriz ideal deve apresentar algumas características para a aplicação que incluem atuar como suporte, fornecer os nutrientes necessários para o crescimento do microrganismo e a secreção do produto biotecnológico de interesse. Encontrar todas essas características em um subproduto pode ser árduo, o que dificulta encontrar um sistema adequado para um processo de fermentação; assim, a busca por novas matérias-primas e sua combinação deve ser contínua [16].

Assim, a proporção de 50:50 entre torta de andiroba e farelo de soja foi escolhida para testes posteriores. A escolha dessa condição está associada à valorização de resíduos inexplorados da região amazônica.

2.3. Suplementação da Matriz de Fermentação

Na segunda parte deste trabalho, a torta de andiroba e o farelo de soja na proporção de 50:50 foram suplementados com 1,5 por cento de óleo de soja, conforme Figura 3. A suplementação foi realizada para verificar se a disponibilidade de uma fonte de carbono de mais fácil assimilação (óleo de soja) melhorou a produção de lipase sobre o teor de óleo residual presente na torta de andiroba. A atividade máxima da lipase de 56,32 U·g −1 foi obtida após 28 h de fermentação e a atividade da protease variou de 2,71 a 7,60 U·g −1. O pH variou de 5,63 a 7,63 e a umidade permaneceu sem grandes oscilações ao longo do período (53 a 58 por cento). Conforme apresentado anteriormente, a atividade lipolítica obtida após a suplementação foi inferior ao valor encontrado sem suplementação. A suplementação de matriz para produção de lipase foi estudada por Farias et al. [38] e Souza et al. [24]. Os autores encontraram uma atividade de lipase de 139 U·g −1 e 93,9 U·g −1 usando lodo e óleo de soja, respectivamente. No entanto, quando Souza et al. [24] realizaram fermentação utilizando apenas farelo de soja (sem suplementação), os autores encontraram 9,4 ± 0,3 U·g −1 de atividade de lipase após 10 h de fermentação, demonstrando que a suplementação aumentou a atividade de lipase na matriz de fermentação estudada.

Outro componente comumente relatado para suplementação do meio é o Tween 80. Isso é constantemente relatado na literatura, pois esse componente pode aumentar a atividade da lipase quando usado em fermentação submersa [39], mas não há relatos usando Tween 80 em fermentação em estado sólido. Tween 80 pode aumentar a produção de lipase extracelular durante o processo de fermentação devido à capacidade de emulsificação do substrato e, portanto, melhorar a acessibilidade do substrato para o microrganismo, bem como alterar a permeabilidade celular [40]. Assim, foi realizado um estudo combinando óleo de soja 1,5 ( por cento p/v) e Tween 80 0,001 por cento (p/v) em uma emulsão para complementar o meio sólido de fermentação, conforme mostrado na Figura 4.

Sobre a suplementação com Tween 80, verificou-se que após 14 h de fermentação, a atividade lipolítica foi de 57,6 U·g −1. O mesmo valor foi obtido anteriormente apenas com a suplementação de óleo de soja às 28 h de fermentação, o que prolonga o processo de fermentação e impacta a viabilidade. A atividade lipolítica máxima após 20 h de fermentação foi de 82,52 U·g −1, um aumento de 1,46-vez em relação à produção de lipase usando óleo de soja sozinho e uma redução de 8-h no tempo de processo.

Longos tempos de fermentação encarecem o processo, por isso é interessante a busca por um microrganismo binômio ideal – um meio que produza lipase em menor tempo (alta produtividade) e que utilize subprodutos como matrizes. Vários estudos na literatura relatam a produção de lipase via SSF para atingir condições adequadas e viabilizar a obtenção de lipases. Foi observada a utilização de diferentes matérias-primas, incluindo farelo de soja, canola, casca de melancia e torta de dendê, com atividades variando de 9 a 127 U·g −1[9,22,24].

Sales, Castro, Ribeiro e Coelho [22] estudando a produção de lipase por Y. lipolytica em fermentação em estado sólido utilizando farelo de soja suplementado com casca de melancia (5 por cento) obtiveram uma melhora na atividade da lipase em 31 por cento, valor correspondente a 75,22 U ·g−1. Souza e cols. [41] produziram lipase de Y. lipolytica por fermentação em estado sólido para aplicação na síntese de ésteres comerciais com valor para a indústria alimentícia, e os resultados mostraram que a melhor condição de fermentação para produzir o biocatalisador foi utilizando farelo de soja e óleo de soja ( 3 por cento p/p). A enzima produzida nessas condições permitiu a conversão de até 92,9 para sintetizar os ésteres de alto valor agregado úteis na indústria alimentícia.

Além das altas atividades enzimáticas obtidas no presente trabalho, podemos destacar as vantagens adicionais: (i) possibilidade de aproveitamento de subprodutos com baixo aproveitamento, com apelo de sustentabilidade para a região amazônica; (ii) a possibilidade de combinação de diferentes subprodutos, o que permite a complementação nutricional para o metabolismo microbiano; (iii) redução da pressão sobre componentes já amplamente utilizados na indústria de bioprocessos, como o farelo de soja; (iv) valorização econômica das regiões produtoras de subprodutos; (v) ampliação das opções de substratos para produção de lipases, e (vi) redução dos custos operacionais, entre outras vantagens.

2.4. SDS-PAGE

O extrato enzimático bruto obtido após fermentação utilizando matriz composta por torta de óleo de andiroba e farelo de soja (50:50) sem suplementação foi analisado em SDS-PAGE. A análise eletroforética mostrou as bandas proteicas contidas no extrato enzimático, conforme apresentado na Figura 5.

A Faixa 1 refere-se aos marcadores protéicos padrão e a Faixa 2 é a amostra obtida da combinação da torta de andiroba e farelo de soja na melhor proporção estudada (50:50). É possível visualizar uma banda em torno de 37–40 kDa no extrato enzimático bruto que pode estar relacionada à lipase e/ou esterase produzida pela Yarrowia lipolytica, conforme observado por Souza et al. [41], que também pode ser a principal lipase extracelular de Y. lipolytica (Lip2), que foi amplamente produzida em todos os nossos estudos. Além disso, é relatado que mesmo para enzimas que estão principalmente associadas à parede celular (Lip7 e Lip8) de Y. lipolytica, a mesma massa molecular foi observada (37-41 kDa) [42].

Adicionalmente, de acordo com resultados previamente publicados por nosso grupo de pesquisa, as mesmas bandas aqui apresentadas estavam relacionadas à atividade de esterase e lipase do zimograma revelado pelo acetato de -naftil como substrato [41], o que nos permitiu correlacioná-las. As bandas de 75 kDa referem-se à subunidade da -conglicinina presente no farelo de soja conforme encontrado por Sales et al. [22] e Cheng et al. [43] na fermentação do farelo de soja.

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