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O extrato de placenta suína aumenta os níveis celulares de NAD em queratinócitos epidérmicos humanos Ⅱ

Jun 25, 2023

Discussão

Muitos estudos mostraram que adiminuição do NADdevido ao envelhecimento está relacionado com adeclínio funcional dos tecidose adesenvolvimento de doenças relacionadas à idade e câncer11,22. Na epiderme, a irradiação UV, o fator extrínseco mais importante do envelhecimento da pele, causa depleção de NAD, bem comoenvelhecimento cronológico23. Uma vez que a pele está constantemente exposta à irradiação UV na vida diária, a aplicação tópica de agentes de aumento de NAD parece ser uma abordagem razoável para prevenir a redução de NAD e proteger a pele dos danos UV. De fato, o aumento do NAD na pele demonstrou prevenir o câncer de pele induzido por UV e a imunossupressão em camundongos24. Jacobson e outros. relataram que os derivados tópicos do ácido nicotínico aumentaram o conteúdo de NAD na pele e melhoraram a função de barreira25.

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Além disso, vários estudos clínicos demonstraram que a aplicação tópica do precursor NAD NAM reduzsinais de envelhecimento da pele26,27. Esses dados clínicos e in vivo suportam a possibilidade de que níveis elevados de NAD impeçamdanos à pele e retardar o envelhecimento. Também relatamos anteriormente que a manutenção de níveis adequados de NAD é essencial para a proteção das células epidérmicas humanas contra o estresse UV21. Neste estudo, demonstramos que o PPE aumenta os níveis intracelulares de NAD nos queratinócitos. Também descobrimos que seus ingredientes ativos têm LMW inferior a 3 kDa, o que é eficaz para modelos de cultura de epiderme monocamada e 3-dimensional. Esses achados sugerem que os ingredientes ativos do PPE podem ser absorvidos por via transdérmica e, portanto, destacam sua aplicação potencial como agente tópico para aumentar os níveis de NAD na pele.

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Figura 3. A fração ativa do LMW-PPE contém vários precursores de NAD. (A) LMW-PPE (1 mg) foi separado e monitorado no comprimento de onda múltiplo (200-600 nm) usando HPLC. (B) Os eluentes foram coletadospor 2 min e testado para atividade de recuperação de NAD em cada fração. (C) A fração 3 foi analisada usando LC–MS/EM. Todos os compostos foram detectados no modo de íon positivo.


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Tabela 1. Conteúdo do precursor NAD do EPI.

Na pele, a deficiência de NAD diminui a função das principais vias metabólicas energéticas, como a glicólise e a fosforilação oxidativa. A glicólise é indispensável para manter o equilíbrio entre proliferação e diferenciação dos queratinócitos28. A exposição aos raios UV diminui os níveis de NAD e, portanto, pode acelerar esse desequilíbrio. Observou-se que a proporção de diferenciação para proliferação é profundamente aumentada na pele exposta ao sol em comparação com a pele protegida do sol29. Tan et ai. descobriram que o tratamento com FK866 acelerou a diferenciação e diminuiu a atividade metabólica em NHEKs, e que o NAM reverteu esses eventos induzidos por FK866-restaurando os níveis celulares de NAD28.

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Figura 4. EPI tópico mostra atividade de recuperação de NAD, mas não afeta a atividade metabólica celular, em RHE. (A) Ilustração esquemática do modelo RHE. (B) PPE (2 mg/mL) foi aplicado ao lado do estrato córneo de RHE e incubado por 48 h na presença ou ausência de FK866 (5 nM). Os níveis totais de NAD dos tecidos foram determinados usando um kit de ensaio NAD plus/NADH. (C) PPE (0, 1, 2 ou 10 mg/mL) ou 1 por cento TX-100 (como controle positivo) foi aplicado ao lado do estrato córneo de RHE e incubado por 48 h . A atividade metabólica celular foi determinada pelo ensaio MTT. **p<0.01, the comparison to the control.

No presente estudo, descobrimos que o PPE restaurou a depleção de NAD induzida por FK866-. Portanto, determinar se o EPI pode sustentar a diferenciação e proliferação na epiderme com depleção de NAD pode fornecer uma melhorcompreensão de suamecanismo antienvelhecimento.

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Recentemente, Aioi et al. mostraram que o uso tópico de EPI reduziu muito as rugas faciais e melhorou a hidratação da pele17. Nosso teste clínico anterior mostrou que a aplicação tópica de creme EPI resultou em uma melhora significativa naparâmetros anti-envelhecimento da pele, comorugas,hidratação da pele, flacidez, e eyebags (dados não publicados). Os achados deste estudo podem contribuir para a compreensão do mecanismo subjacente pelo qual o EPI reduz as rugas e melhora a hidratação da pele. Um relatório anterior mostrou que os níveis intracelulares de NAD total estão positivamente correlacionados com a expressão de componentes da matriz extracelular, como procolágeno e elastina, em fibroblastos de pele humana30. O tratamento de fibroblastos com EPP resulta em aumento da produção de colágeno tipo I17. Combinado com esses fatos, o EPI pode promover a produção de colágeno, aumentando o conteúdo de NAD nos fibroblastos, o que pode levar ao alívio das rugas cutâneas observadas em ensaios clínicos. A hidratação da pele está intimamente associada à função de barreira da camada epidérmica. Vários estudos sugeriram que o NAD é um cofator essencial para manter a função de barreira da pele. Ming et ai. mostraram que a desacetilase dependente de NAD SIRT1 regula a expressão da filagrina, que desempenha um papel crítico como proteína precursora de fatores hidratantes naturais na integridade da barreira cutânea31. Além disso, um estudo clínico demonstrou que a aplicação tópica de um agente potencializador de NAD diminuiu acentuadamente a perda de água transepidérmica, juntamente com um aumento na espessura do estrato córneo na pele fotodanificada25. Esses relatórios sugerem que o EPI pode melhorar a função de barreira da pele, aumentando os níveis celulares de NAD na epiderme, provavelmente levando à melhora da hidratação da pele observada em ensaios clínicos.


Nos últimos anos, os reforços de NAD demonstraram ser úteis para aumentar os efeitos antioxidantes e anti-inflamatórios. Em modelos de camundongos diabéticos e sépticos, a administração de NR reduziu significativamente a inflamação cerebral induzida por dieta rica em gordura e preveniu o estresse oxidativo endotelial induzido por lipopolissacarídeo, respectivamente 32,33. Semelhante ao NR, a suplementação de NMN em camundongos idosos demonstrou reverter o perfil de expressão de mRNA pró-inflamatório na unidade neurovascular e melhorar a função cardiovascular por diminuir o estresse oxidativo34,35. Além disso, um ensaio clínico em homens idosos revelou que NR oral diminuiu os níveis de citocinas inflamatórias circulantes36. Tomados em conjunto, esses estudos in vivo e clínicos apóiam a ideia de que a aplicação de agentes de aumento de NAD fornece efeitos antioxidantes e anti-inflamatórios. A atividade aumentada de SIRT foi sugerida como um dos mecanismos plausíveis pelos quais esses reforços de NAD exercem efeitos anti-inflamatórios e antioxidantes. Os EPIs são conhecidos por apresentarem efeitos antioxidantes e anti-inflamatórios15; no entanto, uma exploração mecanística relativamente limitada foi realizada até o momento. O presente estudo fornece pelo menos uma explicação parcial dos efeitos do EPI.


O PPE é conhecido por conter abundantes proteínas promotoras do crescimento celular, como laminina, citocinas e fatores de crescimento. Estudos recentes, incluindo o nosso, implicaram que os níveis celulares de NAD estão associados ao crescimento celular em queratinócitos epidérmicos21,28. Portanto, especulamos que algumas dessas proteínas podem contribuir para o aumento do conteúdo de NAD. No entanto, ao contrário de nossas expectativas, descobrimos que uma porção contendo moléculas de baixo peso molecular de menos de 3 kDa promoveu a produção de NAD em queratinócitos. Curiosamente, o fracionamento da porção de PPE usando HPLC revelou que a produção de NAD foi observada apenas na fração 3. Também descobrimos que os precursores de NAD, como NMN, NR e NAM, estavam presentes nesta fração, sugerindo que eles poderiam explicar o efeito de EPI na produção de NAD, pelo menos em parte. No entanto, como cada constituinte contido no PPE foi detectado em concentrações muito baixas, parece difícil explicar que esses constituintes sozinhos sejam responsáveis ​​pela capacidade do PPE de promover o conteúdo de NAD nos queratinócitos. Relatórios recentes mostraram que as formas reduzidas desses precursores de NAD, NRH e NMNH, têm maior capacidade de produzir NAD do que NR e NMN37–40. Embora sejam necessárias mais análises para determinar se o PPE contém NRH e NMNH, a capacidade de aumentar o NAD do PPE observada neste estudo pode ser atribuída a vários potencializadores do NAD, incluindo NMN, NR, NMNH, NRH e outros precursores desconhecidos do NAD.

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Em conclusão, nossos achados abrem a possibilidade de usar EPI para melhorar várias doenças e sintomas, aumentando os níveis intracelulares de NAD, um cofator essencial envolvido em várias reações bioquímicas celulares.



Materiais e métodos

Preparação de EPI. PE foi isolado da placenta suína congelada. Após a remoção de todos os vestígios de sangue e cordão umbilical, a placenta suína foi lavada, homogeneizada e submetida a três ciclos de congelamento-descongelamento. O homogeneizado de tecido foi centrifugado a 120 × g por 1 min e o sobrenadante foi coletado e usado como EPI. Para calcular o teor de sólidos secos, o PPE foi concentrado e seco a 105 graus por 5 h. Depois de esfriar para o quarto

temperatura em um dessecador, o peso foi medido com uma balança de precisão. O teor de sólidos secos do PPE foi de 10,98 mg/mL.

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Culturas de células.

NHEKs (recém-nascido/masculino, Termo Fisher Scientifc, Waltham, MA, EUA) foram cultivados em meio EpiLife™ contendo 60 μM de cálcio suplementado com suplemento de crescimento de queratinócitos humanos (ambos da Termo Fisher Scientifc) a 37 graus em uma atmosfera umidificada com 5 por cento de CO2 . O meio foi trocado a cada dia alternado até que a cultura atingisse aproximadamente 50 por cento de confluência, após o que foi trocado a cada dia. As células foram passadas quando atingiram 80-90 por cento de confluência. Os NHEKs não foram usados ​​além da passagem 5.



Quantificação de NAD e ensaio de recuperação.

A quantidade de NAD foi medida usando o NAD plus /NADH Assay Kit-WST (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japão) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 1.0× 105 NHEKs foram semeados em 12-placas de poços. Após 24 h, as células foram tratadas com PPE em diferentes opções de concentrado (0, 0.25, 0,5 e 1 mg/mL) e cultivadas por 1–24 h na presença ou ausência de 5 nM FK866 (AdooQ Bioscience, Irvine, CA, EUA). As células foram lisadas com o tampão de extração NAD plus /NADH fornecido e ultrafiltradas usando um dispositivo de filtro centrífugo Ultracel-10 K (Merck, Darmstadt, Alemanha). Para calcular a concentração de NADH, metade dos filtrados foram incubados a 60 graus por 60 min para decompor o NAD plus. Todos os filtrados foram submetidos à reação enzimática a 37 graus por 1 h. Em seguida, a absorbância das amostras foi medida a 450 nm usando um leitor de placas Infinite 200 Pro (Tecan, Männedorf, Suíça). O conteúdo de NAD plus foi calculado subtraindo o conteúdo de NADH do conteúdo de NAD total. Os níveis de NAD mais /NADH foram normalizados para as respectivas concentrações de proteína determinadas usando o ensaio de proteína Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific).


Ensaio MTT. Os NHEKs foram semeados em uma placa de {{0}}poços a 0,5× 105 células por poço e incubados por 24 h. As células foram então tratadas com PPE (0,5, 1, 2 e 5 mg/mL) ou 0,2 por cento TX-100 por 24 h. As células foram incubadas

com 300 μL de solução de 1 mg/mL MTT (Thermo Fisher Scientific) a 37 graus e 5% de CO2 por 3 h. Após três lavagens com PBS, o formazan infiltrado nos NHEKs foi extraído com 200 μL de dimetil sulfóxido à temperatura ambiente por 2 h. A absorção óptica a 560 nm foi determinada usando um leitor de placas Infnite 200 Pro (Tecan).


Ultrafiltração de EPI. PPE (500 μL) foi aplicado a um dispositivo de filtro centrífugo Ultracel-3K (Merck Millipore) e centrifugado a 16.100 × g a 4 graus por 60 min. Os filtrados foram usados ​​como uma fração LMW de PPE. Para recuperar os resíduos no filtro, os dispositivos de filtro foram colocados de cabeça para baixo em um novo tubo de centrífuga e centrifugados a 1000 × g a 4 graus por 5 min. Os resíduos foram reconstituídos com 500 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e usados ​​como uma fração HMW de PPE.


Fracionamento de HPLC. Para o fracionamento de LMW-PPE, empregamos um sistema de gradiente HPLC equipado com um injetor de amostra de carregamento de seringa, bombas duplas, um detector MD-2010 multi-UV (Jasco, Tóquio, Japão) e
uma coluna de fase reversa C 18 (Inertsil ODS-3, 5 μm, 4,6 × 250 mm, GL Science, Tóquio, Japão). Para alta reprodutibilidade, uma coluna analítica foi usada para fracionamento em vez de uma preparativa. Solventes de HPLC
foram 0,05 por cento de ácido trifluoroacético em água (A) e acetonitrila de grau HPLC (B). Cem microlitros do LMW-PPE foram aplicados à coluna de HPLC e separados usando o seguinte gradiente a uma taxa de fluxo de 1 mL/

min: mantenha em 100 por cento de solvente A de 0 a 10 min, então um gradiente linear de 0 por cento B em 10 min a 95 por cento B em 30 min. Os eluentes foram coletados em tubos de amostra a cada 2 min e secos usando um evaporador centrífugo CVE-3100 (EYELA, Tóquio, Japão). Os resíduos foram reconstituídos com 100 μL de PBS e filtrados através de uma membrana de 0,22 μm antes de usar o ensaio de recuperação de NAD.


Análises de precursores de NAD.

NMN, NR e NAM foram detectados e quantificados por diluição de isótopos LC–MS/MS. As análises foram realizadas usando um sistema ACQUITY UPLC H-Class acoplado a um espectrômetro de massa triplo quadrupolo TQS-micro (Waters, Milford, MA, EUA) com ionização por electrospray operada no modo de íon positivo. Uma coluna Capcell Pak ADME HR (2 μm, 2,1 × 100 mm, Osaka Soda, Osaka, Japão) foi usada para separar cada amostra. As fases móveis A–B eram água–metanol (contendo {0}},1 por cento de ácido fórmico e 10 mM de formato de amônio). A condição de gradiente foi a seguinte: 0–0,5 min (99 por cento A), 0,5–3 min (99–60 por cento A), 3–5 min (60–2 por cento A) e 5–7 min (2 por cento A). A vazão foi de 0,2 mL/min. A tensão capilar era de 0,75 kV, a temperatura da fonte era de 150 graus e a temperatura de dessolvatação era de 500 graus. O fluxo de gás do cone foi de 50 L/h e o fluxo de gás de dessolvatação foi de 1100 L/h. Para quantificar cada precursor de NAD, NAM-13C6 foi adicionado às amostras em uma concentração de 78 nM como padrão interno. Os íons foram monitorados usando monitoramento de reação múltipla (MRM) com as seguintes transições: m/z 335→123 para NMN, m/z 255→123 para NR, m/z 123→80 para NAM e m/z 129→85 para NAM-13C6. O NMN foi adquirido da Oriental Yeast (Tóquio, Japão). NR e NAM-13C6 foram obtidos da Merck (Darmstadt, Alemanha). O NAM foi adquirido da Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Japão).



RH. O modelo RHE in vitro EpiDerm™ (EPI-200) foi adquirido da MatTek (Ashland, MA, EUA) e cultivado em meio EPI-100-ASY (MatTek) a 37 graus e 5% de CO2. Cem microlitros de EPI (1, 2 e 10 mg/mL) ou 1% de TX-100 foram aplicados no lado do estrato córneo do RHE. O RHE foi incubado por 48 h em meio EPI-100-ASY na presença ou ausência de FK866 (5 nM). Após a incubação, o RHE foi lavado três vezes com PBS. Para o ensaio de recuperação de NAD, os níveis totais de NAD em RHE foram quantificados usando o NAD plus /NADH Assay Kit-WST. Para o ensaio de atividade metabólica celular, o RHE foi transferido para uma placa de 24-poços e incubado com 300 μL de solução de 1 mg/mL de MTT (Thermo Fisher Scientific) a 37 graus e 5 por cento de CO2 por 3 h. Após três lavagens com PBS, o formazan infiltrado no RHE foi extraído com 2 mL de dimetil sulfóxido à temperatura ambiente por 2 h. A absorção óptica a 560 nm foi determinada usando um leitor de placas Infnite 200 Pro (Tecan). A absorbância com 1% de RHE tratado com TX-100 foi usada como controle positivo para o ensaio de atividade metabólica celular.

Análise estatística. Os dados são apresentados como a média±erro padrão da média de pelo menos três experimentos independentes. Todas as análises estatísticas foram realizadas com o software EZR versão 1.55 (Saitama Medical

Center, Jichi Medical University, Saitama, Japão). Antes da comparação dos dados, a normalidade da distribuição foi confirmada pelo teste de Shapiro-Wilk. A homogeneidade das variâncias foi avaliada com o teste F (dois grupos) e
Teste de Bartlett (grupos múltiplos). As diferenças entre grupos múltiplos foram determinadas usando ANOVA de uma via seguida pelo teste post hoc de Tukey. O teste t de Student foi usado para testar diferenças significativas entre os dois
grupos. A significância estatística foi estabelecida em p<0.05 and p<0.01. Asterisks and daggers indicate statistical significance compared to the control (*p<0.05, **p<0.01) and indicated (†p<0.05 and ††p<0.01) groups, respectively.
Aprovação ética. Não aplicável. As placentas suínas que foram colhidas e imediatamente congeladas dentro de 3 horas após o parto espontâneo dos fetos foram adquiridas de uma fazenda em Hokkaido, Japão, com o consentimento do proprietário. Nenhum animal vivo esteve envolvido neste estudo


Referências

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