Extrato de placenta suína aumenta os níveis celulares de NAD em queratinócitos epidérmicos humanos

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Nicotinamida adenina dinucleótido(NAD) é um cofator clássico para muitas reações redox e está presente em todas as células vivas nas formas oxidada (NAD plus ) e reduzida (NADH). NAD plus também é conhecido como um co-substrato essencial para enzimas consumidoras de NAD plus, como sirtuína (SIRT) e poli ADP-ribose polimerase (PARP). Como essas enzimas desempenham um papel central em vários processos biológicos, incluindo reparo do DNA, metabolismo mitocondrial e resistência ao estresse, a homeostase de NAD desequilibrada afeta seus processos essenciais1. Os níveis de NAD nos tecidos/órgãos diminuem com a idade, resultando em desequilíbrio na homeostase do NAD2–6. Portanto, existe hoje um consenso de que a manutenção dos níveis de NAD leva à prevenção e ao tratamento do envelhecimento e das doenças relacionadas à idade7. O NAD é biossintetizado por uma variedade de vias, incluindo a biossíntese de novo do triptofano, a via Preiss-Handler do ácido nicotínico e a via de resgate da nicotinamida (NAM)8. Em mamíferos, a via de resgate é a principal via para a manutenção dos níveis celulares de NAD9. Nesta via, o NAM é convertido em mononucleotídeo de nicotinamida (NMN) pela NAM fosforibosiltransferase (NAMPT) e é então convertido em NAD pelas NMN adenililtransferases. O ribosídeo de nicotinamida (NR) é convertido em NMN por NR quinases e então integrado na via de resgate. Metabólitos intermediários de NAD, como NMN e NR, demonstraram elevar os níveis de NAD em várias células e tecidos e melhorar doenças relacionadas à idade10,11.

O extrato placentário (PE) tem sido amplamente utilizado na medicina tradicional para cicatrização de feridas. PE é uma rica fonte de numerosos componentes bioativos, incluindo aminoácidos, ácidos nucléicos, ácidos graxos, minerais, vitaminas, hormônios, peptídeos bioativos, citocinas e fatores de crescimento. Sabe-se que possui várias atividades farmacológicas, como efeitos anti-inflamatórios, antioxidantes, regenerativos e imunomoduladores12. Assim, injeções subcutâneas e intramusculares de PE humana (HPE) têm sido clinicamente utilizadas para o tratamento de diversas doenças, incluindo sintomas da menopausa e doença hepática crônica13. Além disso, o HPE é usado clinicamente como agente antirrugas principalmente em países asiáticos devido aos seus efeitos no crescimento celular e na síntese de colágeno14. Como o uso de HPE é restrito a aplicações médicas em alguns países, como o Japão, o PE suíno (PPE) foi desenvolvido recentemente como uma alternativa ao HPE e usado como matéria-prima em alimentos saudáveis ​​e cosméticos. Um estudo in vivo usando um modelo de dermatite de contato em camundongos mostrou que o EPI tópico tem efeitos anti-inflamatórios e antioxidantes na pele15. Estudos clínicos relataram que o EPI tópico é benéfico para o tratamento de feridas crônicas que não cicatrizam e para prevenir a formação de rugas16,17. Além disso, um ensaio clínico randomizado, duplo-cego e controlado por placebo foi conduzido em mulheres adultas saudáveis ​​para validar os benefícios cutâneos da ingestão oral de EPI e mostrou que a condição da pele do grupo de ingestão de EPI melhorou significativamente18. Esses relatórios suportam o conceito de que o tratamento com EPI pode aliviar ou prevenir o envelhecimento da pele.

PE tem sido convencionalmente usado como umagente antienvelhecimento, e numerosos estudos clínicos estabeleceram suapropriedades antienvelhecimento. No entanto, o mecanismo subjacente aos efeitos antienvelhecimento da PE permanece incerto. Este relatório mostrou que o PPE contém vários precursores de NAD, como NMN e NR, e aumenta os níveis intracelulares de NAD em queratinócitos epidérmicos humanos normais (NHEKs). Nossas descobertas fornecem novos insights sobre o mecanismo pelo qual o PE exerce seus efeitos antienvelhecimento, mantendo a homeostase do NAD intracelular.

Resultados

O EPI aumenta os níveis intracelulares de NAD. Para investigar se o PPE altera os estados de NAD celular, cultivamos NHEKs em um meio suplementado com PPE e quantificamos seus níveis intracelulares de NAD plus e NADH. Os resultados mostraram que o PPE aumentou significativamente a quantidade de NAD plus e NADH em NHEKs de maneira dependente da dose (Fig. 1A). O nível total de NAD (NAD mais mais NADH) das células tratadas com 1 mg/mL de PPE foi aproximadamente 1,5 vezes maior do que o das células não tratadas (Fig. 1A). Além disso, em um experimento de curso de tempo, foi observada elevação significativa dos níveis de NAD plus, NADH e NAD total após 4 h de tratamento com 1 mg/mL de PPE (Fig. 1B). O ensaio {{1{16}}}}(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) confirmou que {{20} },5–2 mg/mL de PPE não teve efeito na atividade metabólica celular, enquanto 5 mg/mL de PPE ou o controle positivo (0,2 por cento Triton X-100 [TX-100]) exibiram toxicidade celular significativa (Fig. 1C). Como o NAD dificilmente foi detectado no próprio PPE (dados não mostrados), o efeito de produção de NAD do PPE não parecia ser devido ao influxo de NAD derivado do PPE nos NHEKs. Assim, esses resultados sugerem que o PPE pode aumentar os níveis intracelulares de NAD. Os ingredientes ativos do EPI são pequenas moléculas, não proteínas. Para determinar se o PPE aumenta a biossíntese de NAD celular por meio da reação NAMPT na via de recuperação de NAD, realizamos um ensaio de recuperação de NAD usando o inibidor de NAMPT FK866 (Fig. 2A). FK866 reduziu consideravelmente os níveis totais de NAD 24 h após a adição (Fig. 2B).

Curiosamente, apesar da ausência de atividade NAMPT dentro de NHEKs, o PPE suprimiu a depleção induzida por FK {{0}} de NAD de maneira dependente da dose (Fig. 2B). Muitos relatos mostram que a PE contém proteínas como citocinas e fatores de crescimento13,19,20. Portanto, presumimos que algumas proteínas bioativas ou NAMPT suína contidas no PPE podem aumentar a biossíntese intracelular de NAD em NHEKs. Para confirmar nossa hipótese, separamos o PPE em frações de alto e baixo peso molecular (HMW, LMW) usando um dispositivo de filtro centrífugo (corte: 3 kDa). Como o ensaio de recuperação de NAD usando FK866 mostrou o efeito do PPE na biossíntese de NAD mais claramente do que na ausência de FK866 (Figs. 1A e 2B), passamos a identificar os ingredientes ativos no PPE usando este ensaio. Inesperadamente, o HMW-PPE exigiu uma alta concentração de 1 mg/mL para restauração significativa dos níveis de NAD, enquanto o LMW-PPE claramente melhorou a depleção de NAD induzida por FK866- mesmo em uma baixa concentração de 0,25 mg/mL (Fig. .2C e D). Assim, esses resultados sugerem que os princípios ativos primários do PPE são pequenas moléculas com menos de 3 kDa, em vez de proteínas como fatores de crescimento e citocinas.

O PPE contém precursores de NAD, como NMN e NR. Fracionamos ainda mais o LMW-PPE em 12 frações usando cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) de fase reversa e investigamos qual fração contribuiu para a restauração da depleção de NAD induzida por FK866-. Um cromatograma HPLC típico do LMW-PPE é mostrado na Fig. 3A. O ensaio de recuperação de NAD mostrou que apenas a fração 3 aumentou nitidamente os níveis de NAD em NHEKs tratados com FK866-(Fig. 3B). Precursores de NAD, como NMN e NR, elevam os níveis intracelulares de NAD sem intervenção NAMPT em várias linhagens celulares, incluindo NHEKs10,21. Como o LMW-PPE ainda aumentou o conteúdo de NAD em NHEKs, mesmo quando o NAMPT foi inibido por FK866, levantamos a hipótese de que os precursores de NAD contidos no PPE aumentam a produção intracelular de NAD. Para testar essa hipótese, analisamos a fração 3 usando cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) para detectar os precursores de NAD. Os resultados mostraram que três picos de íons consistentes com NMN (m/z 335→123), NR (m/z 255→123) e NAM (m/z 123→80) foram detectados na fração 3 ( Fig. 3C). As análises de quantificação revelaram que as concentrações de NMN, NR e NAM contidas no EPI inteiro foram de 0,22, 17,62 e 0,14 ng/mg, respectivamente (Tabela 1). Esses resultados sugerem que pelo menos três precursores de NAD, NMN, NR e NAM, estão presentes no PPE e participam do aumento intracelular de NAD.

Figura 2. PPE melhora o esgotamento de NAD por FK866 em NHEKs. (A) A via de recuperação da biossíntese de NAD. Os NHEKs foram pré-tratados com FK866 por 30 min e incubados com todo-PPE (B), HMW-PPE (C) ou LMW-PPE (D) nas concentrações indicadas por 24 h. Os níveis totais de NAD foram determinados usando o kit de ensaio NAD plus /NADH. †p<0.05 and ††p<0.01, in comparison with the indicated groups.

A administração tópica de EPI na epiderme humana reconstruída aumenta os níveis de NAD dos tecidos. Os principais ingredientes ativos no efeito de aumento de NAD do PPE são pequenas moléculas, das quais se pode esperar que tenham maior capacidade de absorção transdérmica do que proteínas maiores, como fatores de crescimento. Portanto, a aplicação tópica de EPI na pele parece ser uma opção adequada para aumentar os níveis de NAD nos tecidos da pele. Para investigar se a administração tópica de EPI afeta os níveis de NAD na epiderme abaixo do estrato córneo, a epiderme humana 3-dimensional reconstruída (RHE) foi tratada com EPI no lado do estrato córneo e cultivada em um meio com a presença ou ausência de FK866 (Fig. 4A). A aplicação tópica de EPI aumentou os níveis de NAD em 9,1 por cento (não significativo) ou 7,3 por cento (signifcativo) na ausência ou presença de FK866, respectivamente (Fig. 4B). O PPE não teve efeito na atividade metabólica celular quando testado até 10 mg/mL, enquanto 1 por cento de TX-100 reduziu acentuadamente (Fig. 4C). Esses resultados sugerem que os ingredientes ativos do EPI podem infiltrar a pele subcórnea e aumentar os níveis de NAD da pele sem causar efeitos nocivos.

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