Parte Um|Um inibidor de NF-κB e um agonista de AMPK: previsão de rede e integração multi-ômica para derivar vias de sinalização para acteosídeos contra a doença de Alzheimer

Parte Um|Acteósidos: como tratar a doença de Alzheimer como um dos ingredientes eficazes do Cistanche?

Ying-Qi Li1†, Yi Chen1†, Si-Qi Jiang1, Yuan-Yuan Shi2, Xiao-Li Jiang1, Shan-Shan Wu1, Ping Zhou1, Hui-Ying Wang1, Ping Li1* e Fei Li1,2 * 1 chave de estado Laboratório de Medicamentos Naturais, China Pharmaceutical University, Nanjing, China, 2 College of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Urumqi, China

A doença de Alzheimer (DA) é o tipo de demência mais frequente.Acteosídeo (AJA) é um composto isolado deCistanche tubulosa, que possui excelentes propriedades neuroprotetoras. No entanto, o mecanismo subjacente deAJAna regulação da polarização da microglia permanece mal definida. Portanto, um modelo de rede computacional foi estabelecido para identificar os alvos de condução deAJAe prever seu mecanismo integrando vários bancos de dados disponíveis. O modelo de DA induzida por AlCl3-em larvas de peixe-zebra foi constituído com sucesso para demonstrar a eficácia terapêutica do ACT. Subsequentemente, as células BV-2 induzidas por LPS descobriram o papel positivo do ACT na polarização M1/M2. As vias NF-κB e AMPK foram ainda confirmadas por análise transcriptômica, análise metabolômica, técnicas de biologia molecular e docking molecular. A pesquisa forneceu um mecanismo infusivo de ACT e revelou a conexão entre metabolismo e polarização da microglia do ponto de vista da função mitocondrial. Mais importante, ele forneceu uma abordagem sistemática e abrangente para a descoberta de alvos de drogas, incluindo as mudanças em genes, metabólitos e proteínas.

Palavras-chave: acteósido, células BV-2, metabolismo, RNA-seq, mitocôndrias, neuroinflamação

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INTRODUÇÃO

Com o envelhecimento e o rápido crescimento da população, o número de casos de demência no mundo tem apresentado uma tendência ascendente.doença de Alzheimer(DA) é uma doença neurodegenerativa comum acompanhada de comprometimento cognitivo e discinesia (Perea et al., 2020), que é o tipo mais frequente de demência. É caracterizada por perda neuronal grave, placas senis e emaranhados neurofibrilares (Shiao et al., 2017). A patogênese daDoença de Alzheimeré multidimensional e está ligado à neuroinflamação. A neuroinflamação é impulsionada pela ativação de células gliais, que está intimamente relacionada à ocorrência e desenvolvimento da DA (Hanslik e Ulland, 2020; Linnerbauer e Rothhammer, 2020). Durante a progressão e exacerbação da neuroinflamação, a microglia é considerada um fator chave. Microglia são as células imunes primárias no sistema nervoso central, que estão intimamente associadas a uma cascata de processos, como desenvolvimento cerebral, manutenção do ambiente neural, bem como respostas a lesões e reparos (Perea et al., 2020). Além disso, a microglia pode ser estimulada para um fenótipo M1 e aumentar a expressão de citocinas pró-inflamatórias quando ocorrem doenças relacionadas à neuroinflamação, como a DA (Tsukahara et al., 2020). Estudos também demonstram que a polarização para o fenótipo M1 é frequentemente acompanhada de distúrbios metabólicos (Li L. et al., 2020), levando ao desequilíbrio do metabolismo energético e disfunção mitocondrial (Agrawal e Jha, 2020). Essas mudanças adversas são derivadas da neurodegeneração, até mesmo da doença de Alzheimer.

Acteosídeo (ACT), a glicosídeo feniletanoide, é derivado principalmente deCistanche tubulosa. Evidências crescentes sugerem que o ACT possui inúmeras atividades farmacológicas, incluindoneuroprotetor(Wei et al., 2019),anti-inflamatório(Lai et al., 2019), eantioxidante(Ji et al., 2019). Em particular, foi comprovado que o Acteoside podemelhorar o aprendizado e a memóriacomprometimento e regulação positiva do metabolismo energético em ratos induzidos por estreptozotocina (Chen J. et al., 2020). Além disso, também pode inibir a morte celular apoptótica neuronal e o dano mitocondrial nos camundongos de encefalomielite autoimune experimental (Li W. et al., 2020). No entanto, o efeito do ACT na polarização da microglia M1/M2 e seu mecanismo são raramente relatados. Até agora, os mecanismos como o reparo da função das mitocôndrias e a regulação do metabolismo celular não são claros e são necessárias mais pesquisas científicas para esclarecer o mecanismo exato.

O objetivo do presente relatório é investigar a eficácia terapêutica do ACT, bem como o mecanismo molecular subjacente do ACT na DA. Aqui, um método sistemático in silico de identificação de alvos de drogas é estabelecido com base nas bases de dados consolidadas. Investigamos ainda os possíveis mecanismos de ACT no nível biológico molecular integrando o sequenciamento de RNA (RNA-seq) com métodos metabolômicos e técnicas de biologia molecular. A combinação de estratégias de triagem sistemática in silico, in vivo e in vitro fornece um novo protocolo para descobrir objetivamente compostos multialvo da medicina tradicional chinesa.

MATERIAIS E MÉTODOS

Modelagem de rede

Quatro plataformas online foram combinadas para prever e descobrir os alvos deActeosídeo, ou seja, GeneCards1, abordagem de conjunto de similaridade (SEA2), SwissTargetPrediction3 e PharmMapper4. Todas as associações de genes de AD foram coletadas independentemente de DisGeNET5 e GeneCards. Após a análise da interação alvo-alvo realizada pelo banco de dados String6, a rede foi ainda integrada pelo software Cytoscape (Versão 3.8.2). A análise de enriquecimento GO e KEGG foi realizada no banco de dados DAVID7 para anotar e minerar a rede.

Animais e Agrupamento de Modelos

O peixe-zebra do tipo selvagem (estirpe AB, 4 meses de idade) foi escolhido neste estudo (Nanjing Qi Wu Biotechnology Co., Ltd.). Eles foram mantidos sob um ciclo claro/escuro de 14/10-h a 28◦C, seguindo o método anterior (Li YQ et al., 2020). Todos os experimentos com zebrafish foram realizados sob a supervisão do Comitê de Ética Animal da China Pharmaceutical University. As larvas de peixe-zebra foram divididas em seis grupos e tratadas de 3 dias pós-fertilização (dpf) a 7 dpf: grupo controle, grupo modelo, grupo modelo mais cloridrato de donepezil (DPZ, Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.) e grupo modelo maisActeosídeo(pureza HPLC maior ou igual a 98 por cento, Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd.). O grupo controle foi mantido no meio com 0,2 por cento de DMSO e o grupo modelo foi tratado com 150 µM de AlCl3 (pH 5,8). O grupo modelo mais DPZ foi co-tratado com AlCl3 e DPZ 8 µM. O modelo maisActeosídeoos grupos foram co-tratados com AlCl3 e diferentes concentrações de ACT (200, 100 e 50 µM).

Análise Comportamental

Os movimentos das larvas do peixe-zebra foram registrados por um analisador comportamental ViewPoint (Zebralab, 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) a 28◦C. Resumidamente, os parâmetros comportamentais e o processamento de resultados foram consistentes com o método que estabelecemos anteriormente (Li YQ et al., 2020). Aqui, velocidade média (AS), mudança de velocidade (1S), taxa de recuperação de discinesia (DRR) e eficiência de resposta (RE, percentual) foram selecionados para avaliar a recuperação de discinesia em peixe-zebra.

Determinação da Actividade da Acetilcolinesterase e da Colina Acetiltransferase

Após o tratamento de 3 a 7 dpf, as larvas do peixe-zebra foram coletadas para medir as atividades da Acetilcolinesterase (AChE) e da Colina Acetiltransferase (ChAT). Com base no protocolo do fabricante, a atividade foi detectada pelos kits de ensaio imunoenzimático (ELISA) (MLBIO Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China)

Culturas de células e tratamentos

A linhagem celular BV-2 foi adquirida da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, Estados Unidos). Eles foram cultivados em DMEM (KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanjing, China). O meio foi suplementado com 10% de FBS (Gibco, Grand Island, NY, Estados Unidos), 100 U/ml de penicilina e 100 mg/ml de estreptomicina, acompanhados de 95% de ar/5% de CO2 a 37◦C. As células BV-2 foram incubadas com ACT (50, 25 e 12,5 µM) ou estimuladas com lipopolissacarídeo (LPS, 1 µg/ml; Sigma Aldrich, St Louis, MO, Estados Unidos) por 24 h. As células foram observadas ao microscópio invertido (Nikon ECLIPSE Ti2, Japão).

Ensaio de Viabilidade Celular

O ensaio Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, China) foi usado para avaliar a viabilidade celular. Resumidamente, a absorbância foi medida em 450 nm com um leitor de microplacas (Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, Estados Unidos).

Ensaio de Produção de Óxido Nítrico

O óxido nítrico (NO) foi determinado medindo os níveis de nitrito no sobrenadante da cultura BV-2 usando reagente de Griess. Resumidamente, o meio (100 µl) foi transferido para uma nova placa de 96-poço, o mesmo volume de reagente de Griess foi adicionado a cada poço e reagiu por 15 min no escuro. A absorção a 540 nm foi determinada por um leitor de microplacas.

Níveis de citocinas inflamatórias no sobrenadante

As concentrações de TNF- , IL-1 e IL-10 no sobrenadante de células BV-2 foram determinadas por kits de ELISA de acordo com as instruções do fabricante.

Determinação do Metabolismo Celular por Análise de HPLC-Q-TOF-MS

As células BV{{0}} foram semeadas em um prato de seis poços separadamente (n=6/grupo). Após o tratamento, o meio foi removido e as células foram lavadas três vezes com PBS frio. Eles foram então imediatamente expostos ao nitrogênio líquido para suprimir o metabolismo celular. As células foram colhidas com 8{{30}} por cento de metanol frio. Para facilitar a precipitação de proteínas, as células foram vigorosamente agitadas em vórtex por 1 min e centrifugadas a 13,000 rpm (15 min, 4◦C). A suspensão de células foi seca sob uma corrente de nitrogênio. O resíduo seco foi reconstituído em 150 µl de acetonitrila a 25% pré-resfriada. Para garantir a estabilidade e a precisão da análise de sequência, cada amostra de célula com volume igual (1{60}} µl) foi combinada como amostras de controle de qualidade. Durante a detecção de metabólitos, essas amostras foram injetadas a cada seis amostras para confirmar sua estabilidade. Uma alíquota de 1-µl foi injetada para HPLC-Q-TOF-MS. A análise foi realizada em um sistema de HPLC Agilent 1290 conectado ao espectrômetro de massa Agilent 6530 Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Estados Unidos). A separação foi realizada em uma coluna ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1 min × 100 mm, 1,7 µm). A fase móvel foi composta por 0,1 por cento de ácido fórmico-água (v/v; A) e acetonitrila (B). A taxa de companheiro foi fixada em 0,4 ml/min com a seguinte condição de eluição de gradiente ideal: 0 a 2 min, 5 por cento B; 2 a 20 min, 5 a 95 por cento B (modo de íon positivo); 0 a 2 min, 5 por cento B; 2 a 20 min, 5 a 95 por cento B (modo de íon negativo). Os parâmetros de operação do espectrômetro de massa foram definidos da seguinte forma: temperatura do gás, 320◦C; gás de secagem, 10 L/min; nebulizador, 35 psi; VCap, 4,000 V; fragmento, 120 V. Os dados brutos foram operados sob o MassHunter Workstation Software versão B.07.00 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Estados Unidos). Os dados brutos foram pré-processados ​​pela plataforma XCMS. A análise de componentes principais (PCA) e a análise discriminante parcial dos mínimos quadrados (PLS-DA) dos dados normalizados foram realizadas com o MetaboAnalyst8. Combinados com a literatura, os metabólitos diferenciais (VIP > 1, teste t p < 0,05)="" foram="" identificados="" no="" hmdb9.="" finalmente,="" a="" análise="" de="" vias="" foi="" realizada="" com="" o="">

Medição do Potencial de Membrana Mitocondrial

O potencial de membrana mitocondrial (MMP) foi detectado usando a sonda fluorescente FL JC-1 (Beyotime, China) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células de diferentes grupos foram lavadas com PBS e incubadas com solução de coloração JC-1 por 20 min a 37◦C. Após a coloração, as células foram lavadas duas vezes com tampão de coloração. Em seguida, os sinais fluorescentes FL foram detectados por citometria colega (BD Accuri C6).

Medição de adenosina mitocondrial 50 -trifosfato

A concentração de adenosina 50 -trifosfato (ATP) nas mitocôndrias foi detectada por um ATP Assay Kit (Beyotime, China). Resumidamente, o meio de cultura de células BV-2 de diferentes grupos foi descartado e as células foram homogeneizadas com tampão de lise em gelo. O sobrenadante obtido após centrifugação (12,000 g, 5 min) foi usado para determinar a concentração de ATP. A luminescência foi detectada pelo EnVision Multimode Microplate Reader (PerkinElmer).

Medição do Nível de Espécies de Oxigênio Reativo Intracelular

O kit de ensaio de espécies reativas de oxigênio (ROS) (Beyotime, China) foi usado para medir os níveis de ROS. As células dos diferentes grupos foram incubadas com DCFH-DA (10 µM) por 20 min a 37◦C. Após o carregamento da sonda, as células foram lavadas três vezes com DMEM. Em seguida, os sinais fluorescentes FL foram detectados por citometria colega (BD Accuri C6).

Microscopia Eletrônica de Transmissão

As células BV-2 foram semeadas em uma placa de seis poços. O meio foi removido e 1 ml de glutaraldeído a 2,5 por cento foi rapidamente adicionado a cada poço. Em seguida, as células foram recolhidas e fixadas com novo glutaraldeído a 2,5 por cento a 4◦C durante a noite. Após fixação, desidratação e incorporação, as células foram observadas com um microscópio eletrônico de transmissão HT7800 (Hitachi, Tóquio, Japão).

RNA-Seq e Análise de Dados Bioinformáticos

O RNA total das células BV-2 foi extraído usando o reagente Trizol (Vazyme Biotech, China). Todas as amostras analíticas foram enviadas para Majorbio (Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co., Ltd.) para o ensaio de sequência de RNA. Os dados foram analisados ​​na plataforma online da Majorbio Cloud Platform10. RSEM11 foi usado para quantificar a abundância de genes. Essencialmente, a expressão diferencial

a análise foi realizada usando o DESeq2/DEGseq/EdgeR com valor Q menor ou igual a 0.05; DEGs com|log2FC| > 1 e valor Q menor ou igual a 0.05 (DESeq2 ou EdgeR)/valor Q menor ou igual a 0,001 (DEGseq) foram considerados genes expressos significativamente diferentes. Além disso, análises de enriquecimento funcional, incluindo GO e KEGG, foram realizadas para identificar quais DEGs foram significativamente enriquecidos em termos e vias de GO no valor de p corrigido de Bonferroni menor ou igual a 0,05 em comparação com o fundo do transcriptoma completo. Os dados da sequência original foram submetidos ao banco de dados do NCBI Sequence Read Archive.

Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa em Tempo Real

O RNA total das células BV-2 foi colhido usando o RNA-easyTM Isolation Reagent (Vazyme Biotech, China), e a reação de transcrição reversa foi conduzida com FastKing-RT SuperMix (TIANGEN Biotech, China). As reações foram realizadas de acordo com o protocolo do fabricante. O cDNA foi submetido a ensaios quantitativos de reação em cadeia da polimerase em tempo real (qRT-PCR) com primers específicos e TransStart TOP Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech, China). Os primers estão listados na Tabela Suplementar 1 e -actina foi usada como controle interno. O método 22 1 1 CT foi usado para análise quantitativa.

Análise Western Blot

As células BV-2 foram lisadas por tampão de lise RIPA (KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanjing, China) contendo 1 por cento de coquetel inibidor de protease (Thermo Fisher) para obter proteína total. As proteínas foram separadas por SDS-PAGE a 10 por cento e transferidas para membranas NC. Após o bloqueio com 5% de leite desnatado/BSA, as membranas foram incubadas com AMPK (Proteintech), p-AMPK (Affiffinity Biosciences), PGC-1 (Proteintech), NF-κB (Proteintech), p-NF-κB (ABclonal) ou GAPDH (ABclonal) em 5% de TBST a 4◦C durante a noite. As membranas foram incubadas com um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (ABclonal) à temperatura ambiente durante 1 h. O substrato de Western blotting ECL de alta sig (Tanon, China), sistema de imagem em gel (Tanon, China) e software ImageJ foram usados ​​para visualização e quantificação.

Ancoragem molecular

A análise de encaixe molecular foi realizada usando o software Autodock (Versão 4.2). A afinidade entre ACT e proteínas foi observada pelo software AutodockTools. As estruturas proteicas tridimensionais (3D) de AMPK (PDB ID: 5g5j) e NF-κB (PDB ID: 4q3j) foram recuperadas do Protein Data Bank12.

Análise estatística

Todos os dados são expressos como média ± desvio padrão e analisados ​​pelo GraphPad Prism Software (Versão 8.0.1). As diferenças entre os grupos foram analisadas pela análise de variância unidirecional (ANOVA), seguida do teste de comparação múltipla de Tukey. p < 0,05="" foi="" considerado="" estatisticamente="">

RESULTADOS

O ACT-AD visa a rede de interação e a previsão de caminhos

Através da consolidação de múltiplas bases de dados, foram adquiridos 253 alvos de ACT, enquanto foram reunidos um total de 1.697 alvos relacionados com AD. Após o mapeamento da rede de destino, um total de 70 destinos foram absorvidos pela rede de interação de destino do ACT-AD (Figura 1A). A análise de enriquecimento KEGG implicou que o ACT poderia ter um efeito de amplo espectro e alvo múltiplo (Figura 1B). Também sugeriu que o ACT tem várias vias, pontos-alvo e elementos no tratamento da DA. Classifique essas vias para obter uma interpretação precisa dos mecanismos. O ACT pode se correlacionar principalmente com a transdução de sinal, o sistema endócrino, o sistema imunológico e o crescimento e morte celular para desempenhar um papel de confronto contra a DA (Figura 1C). Vale ressaltar que a grande maioria dessas vias está relacionada a reações inflamatórias. Especula-se que a ação anti-inflamatória do ACT pode ser uma parte inextricável de seu papel de confronto contra a DA.

ACT aliviou a discinesia e melhorou a função do sistema colinérgico em larvas de peixe-zebra AD

Para verificar o modelo de rede, o modelo de AD induzido por AlCl3-em larvas de peixe-zebra foi usado para demonstrar o efeito do ACT. O movimento das larvas do peixe-zebra dentro dos ciclos claro/escuro foi observado, e suas trilhas de natação foram registradas (Figura 1D). Os resultados mostraram que o ACT aumentou efetivamente o AS e 1S do peixe-zebra, e o efeito sinérgico aumentou com o aumento das doses (Figura 1E). DRR e RE descobriram uma comparação mais intuitiva de ACT e DPZ (Figura 1F). Assim, o ACT aliviou a discinesia, exibindo efeitos semelhantes ao DPZ. É geralmente aceito que o sistema colinérgico desempenha um papel importante nos processos de aprendizagem e memória. Assim, as atividades de AChE e ChAT foram usadas para revelar o efeito do ACT. A exposição AlCl3 em peixe-zebra foi processada com alteração colinérgica cerebral (Figura 1G). Foi significativo que o tratamento com ACT suprimiu a atividade da AChE. Além disso, a atividade de ChAT exibiu uma diminuição após o tratamento com ACT. Portanto, ACT mostrou um profundo impacto em larvas de peixe-zebra AD induzidas por AlCl3-.

Polarização M1 suprimida por ACT e polarização M2 promovida em células BV induzidas por LPS-2

Para confirmar ainda mais a rede, o efeito anti-inflamatório do ACT foi estudado in vitro usando células microgliais BV-2. Após o tratamento com LPS por 24 h, a viabilidade das células BV-2 diminuiu significativamente. Felizmente, o ACT aumentou a viabilidade celular de células BV-2 induzidas por LPS (Figura 2A). Além disso, foi observada a morfologia das células BV-2. Após 24 h de estimulação com LPS, mostrou que as células BV-2 sofreram um estado de polarização M1. As alterações morfológicas foram prevenidas pelo co-tratamento com ACT (Figura 2B).

Além disso, os resultados indicaram que, ao contrário das células BV-2 estimuladas por LPS, as células BV-2 co-tratadas com ACT suprimiram significativamente as expressões de TNF-, IL-1 e NO (Figura 2C) no sobrenadante celular. Estas são citocinas pró-inflamatórias clássicas como indicadores da polarização da microglia M1. Semelhante aos resultados do ELISA, os resultados do qPCR descobriram que as expressões de mRNA de TNF-, óxido nítrico (iNOS), IL-1 e CD86 foram significativamente inibidas pelo tratamento com ACT em comparação com o grupo LPS (Figura 2D). Além disso, medimos o nível de polarização da microglia M2 por ELISA (Figura 2C) e qPCR (Figura 2E), e os resultados indicaram que o ACT aumentou significativamente os níveis de expressão de marcadores relacionados à microglia M2 (IL-10, CD206, TGF- e Arg-1). Em uma palavra, esses resultados mostraram queAJAsuprimiu a polarização da microglia M1 e promoveu o fenótipo M2.

Polarização M1/M2 Regulada por ACT através da Inibição da Via NF-κB

A análise transcriptômica foi realizada por RNA-seq para explorar o mecanismo de ACT em células BV-2 de um nível geral. PCA ilustrou que os grupos de controle, LPS e ACT podem ser bem distinguidos (Figura 3A). Revelou 899 genes diferencialmente expressos (DEGs) entre o grupo controle e o grupo LPS, e 49 DEGs entre o grupo LPS e o grupo ACT (Figura 3B). Consistentemente, GO (Figura 3C) e análise de enriquecimento KEGG (Figura 3D) descobriram que o efeito de ACT estava envolvido na via NF-κB. O conjunto de genes associados à via do NF-κB foi ainda confirmado, e sua homeostase certamente foi afetada pelo LPS. Como esperado, ACT afetou significativamente suas expressões (Figura 3E). A via NF-κB é uma via clássica para regular a progressão da inflamação, resultando na liberação de fatores pró-inflamatórios. Para obter suporte mecanicista, a proteína chave da via NF-κB foi avaliada por Western blot. A estimulação com LPS levou à ativação do NF-κB, associado à promoção da polarização M1. Consistente com a análise de RNA-seq, ACT inibiu a fosforilação de NF-κB estimulada por LPS (Figura 3F). Portanto, o ACT pode aliviar a polarização M1 induzida por LPS através da via NF-κB em células BV-2.

ACT Prejudicou a biossíntese de arginina, bem como a biossíntese de pantotenato e CoA

A previsão de rede de ACT revelou que estava relacionada ao metabolismo da arginina (Arg) e da prolina (Figura 1B). A sequência de RNA demonstrou que as vias afetadas pelo ACT também incluíam a biossíntese de Arg, bem como a biossíntese de pantotenato e CoA (Figura 3D). Tem sido sugerido que os distúrbios do metabolismo das células BV-2 induzidos pela estimulação de LPS estão associados à polarização M1 (Orihuela et al., 2016). Assim, um metaboloma celular não direcionado por HPLC-Q-TOF-MS foi usado para identificar o efeito de ACT no metabolismo celular. PCA e PLS-DA (Figura 3G) ilustraram que os grupos controle, LPS e ACT podem ser bem distinguidos com base em metabólitos intracelulares. Os níveis de vários metabólitos em células BV induzidas por LPS{11}} foram alterados após o tratamento com ACT (Figura 3H). Em comparação com o grupo controle, houve 11 metabólitos que mudaram significativamente no grupo LPS (Tabela Complementar 2), enquanto 14 metabólitos foram distintamente alterados após o tratamento de ACT (Tabela Complementar 3), envolvendo 11 vias metabólicas (Figura 3I). O efeito do ACT consistiu principalmente na regulação do metabolismo de aminoácidos, metabolismo de nucleotídeos, metabolismo de energia e metabolismo de cofatores e vitaminas. Curiosamente, as vias metabólicas obtidas pelo metaboloma foram consistentes com a previsão de rede e RNA-seq, incluindo a biossíntese de Arg, bem como a biossíntese de pantotenato e CoA. O acima mostrou que o ACT pode regular a biossíntese de Arg, bem como a biossíntese de pantotenato e CoA em células BV - 2 estimuladas por LPS.

AJADisfunção Mitocondrial Induzida por LPS mitigada-2

As mitocôndrias estão no centro das vias metabólicas. Evidências em evolução mostram que as mitocôndrias são uma peça chave na polarização microglial M1/M2. Uma visão geral do status das mitocôndrias na morfologia e distribuição celular foi julgada por TEM. Após a estimulação com LPS, a cromatina das células BV-2 foi condensada e o citoplasma e as mitocôndrias diminuíram (Figura 4A). Além disso, as cristas mitocondriais do grupo LPS estavam desarranjadas ou até mesmo desaparecidas, exibindo cristólise parcial, redução de tamanho e morfologia arredondada. Curiosamente, o tratamento com ACT pode aliviar as alterações morfológicas induzidas por LPS nas mitocôndrias. Por sua vez, examinamos a função mitocondrial de células BV-2 tratadas com LPS, incluindo a produção de MMP e ATP. A produção de MMP (Figura 4B) e ATP nas mitocôndrias (Figura 4C) foi significativamente melhorada no grupo ACT em comparação com as do grupo LPS. A disfunção mitocondrial pode estar relacionada ao aumento do nível de ROS na célula. A análise de citometria de fluxo revelou que o conteúdo de ROS estava sobrecarregado no grupo LPS (Figura 4D). Felizmente, o ACT eliminou o ROS excessivo. Isso sugere que o ACT pode restaurar a função das mitocôndrias eliminando ROS.

ACT restaurou a função das mitocôndrias por meio da regulação positiva de PGC-1 e UCP-2

O coativador de receptor ativado por proliferação de peroxissomos-1 (PGC-1) desempenha um papel importante na biogênese mitocondrial (Bi et al., 2019). A estimulação de LPS diminuiu a expressão de PGC-1 , exibindo disfunção mitocondrial. Notavelmente, o mRNA do gene PGC-1 e a expressão da proteína foram significativamente revertidos pelo tratamento com ACT em células BV-2 tratadas com LPS (Figura 4E).

A proteína de desacoplamento mitocondrial-2 (UCP-2) também era conhecida por regular a função mitocondrial. Como uma proteína a jusante de PGC-1, pode controlar a despolarização de MMP induzida por LPS e a produção de ROS. Relatórios recentes indicam que é central para o processo de ativação microglial, com regulação oposta da polarização M1 e M2 (De Simone et al., 2015). Os resultados de Western blot mostraram que o nível de proteína UCP-2 foi diminuído após a estimulação com LPS. O co-tratamento de LPS e ACT poderia regular a expressão de UCP-2 em comparação com o tratamento com LPS. O nível de expressão de mRNA de UCP{10}} também mostrou alterações semelhantes (Figura 4F). Para resumir, o ACT restaurou a função das mitocôndrias através da regulação positiva de PGC-1 e UCP-2.

ACT Reprimido Microglia M1

Polarização via ativação AMPK

Como um sensor chave de energia celular, a proteína quinase ativada por AMP (AMPK) desempenha um papel importante na manutenção do equilíbrio do metabolismo celular. Ao mesmo tempo, PGC-1 é uma proteína a jusante de AMPK. Como mostrado na análise do modelo de rede,AJApode regular a via AMPK (Figura 1B). Os resultados revelaram que o LPS inibiu a ativação da AMPK, resultando em distúrbios do metabolismo celular e disfunção mitocondrial. Vale ressaltar que o ACT pode aumentar de forma dose-dependente a expressão proteica de p-AMPK (Figura 5A). Sugere-se que o ACT pode aumentar a expressão de PGC-1 e restaurar a função mitocondrial ativando a via de sinalização AMPK. Neste estudo, investigar se a ativação da AMPK contribuiu para o efeito regulador daAJAna polarização M1/M2, o composto C (CC) foi empregado para inibir o efeito da AMPK. Em contraste com o nível de NO regulado negativamente no grupo de tratamento com ACT, o CC bloqueou parcialmente o efeito de ACT no nível de NO (Figura 5B). Com base nesses resultados, o ACT pode regular a polarização M1/M2 de células BV-2 pela ativação de AMPK.

AJALigado e inibido NF-κB, bem como AMPK ativado

O docking molecular foi aplicado para confirmar se o ACT se liga às proteínas NF-κB e AMPK. Os resultados demonstraram que a energia de ligação deAJAe NF-κB foi -8,4 kcal/mol, enquanto o deAJAe AMPK foi -10,8 kcal/mol. Afinidades significativas verificaram que o ACT está ligado diretamente ao NF-κB e AMPK (Figuras 5C, D, F, G). Subsequentemente, os possíveis modos de ligação e interações dentro das bolsas de aminoácidos foram ainda mais explorados, incluindo 11 resíduos de aminoácidos de NF-κB (Figura 5E), bem como 12 resíduos de aminoácidos de AMPK (Figura 5H). Esses resultados indicaram que o ACT pode afetar diretamente NF-κB e AMPK para atenuar a polarização M1 da microglia BV{10}} e promover o fenótipo M2.