Parte Um|A decocção de Jia-Jian-Di-Huang-Yin-Zi exerce efeitos neuroprotetores em neurônios dopaminérgicos e seu microambiente

Parte Um|Como a fitoterapia chinesa, como Cistanche, desempenha um efeito neuroprotetor e melhora a memória?

Jingsi Zhang1, Zhennian Zhang2, Wen Zhang1, Xiangting Li1, Ting Wu1, Tingting Li3, Min Cai1, Zhonghai Yu1, Jun Xiang1 & Dingfang Cai1Como prescrição clássica da medicina tradicional chinesa, o Jia-Jian-Di-Huang-Yin-Zi ( JJDHYZ) tem sido usada há muito tempo para tratar distúrbios do movimento. O presente estudo avaliou os efeitos de JJDHYZ em neurônios dopaminérgicos (DA) e seu microambiente que aumenta a sobrevivência, bem como os possíveis mecanismos envolvidos usando um modelo de camundongo deParkinsondoença. Em camundongos com lesão de MPTP, uma alta dosagem de JJDHYZ (34g/kg/dia) atenuou a perda de neurônios DA, reverteu a depleção de dopamina e melhorou a expressão do fator neurotrófico derivado da glia (GDNF) em comparação com o grupo modelo não tratado. JJDHYZ também protegeu a ultraestrutura da barreira hematoencefálica (BBB) ​​e proteínas de junção apertada, inibindo a ativação de microglia e astrócitos, além do aumento de três tipos de metaloproteinases de matriz na substância negra. Em conclusão, o grupo de alta dosagem de JJDHYZ (JJDHYZ-H) exibiu a neuroproteção dos neurônios DA, e o mecanismo subjacente pode estar relacionado ao microambiente de melhoria da sobrevivência dos neurônios DA.

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ParkinsonA doença é um distúrbio progressivo do movimento relacionado à idade, que também é amplamente conhecido como o distúrbio neurológico frequente dos gânglios da base. A degeneração progressiva da dopaminérgicaneurôniosna substância negra pars compacta (SNpc) leva ainda à perda da neurotransmissão dopaminérgica no corpo estriado; seguido por uma série de profundas alterações funcionais dos gânglios da base, bem como movimentos voluntários1. Tremor, rigidez, acinesia e bradicinesia são considerados as principais características dos distúrbios do movimento. Estresse oxidativo, apoptose, neuroinflamação e disfunção mitocondrial são as principais causas2. Recentemente, os pesquisadores se concentraram na unidade neurovascular (NVU), que é composta principalmente porneurôniose células não neuronais, incluindo células endoteliais, pericitos, astrócitos, microglia e células do músculo liso vascular. As células da glia desempenham fisicamente um papel neuroprotetor. Os astrócitos envolvem mais de 99% do endotélio da BBB, modulam a estrutura das células endoteliais e participam do desenvolvimento da BBB. Em condições patológicas, a estimulação adversa faz com que a glia produza numerosas neurotoxinas e, assim, contribua para o dano da neuroinflamação3,4. Microglia ativada foi observada em tecidos SNpc postmortem e modelos de DP5. Em um sistema de co-cultura de células endoteliais microvasculares/microglia do cérebro de rato, o lipopolissacarídeo (LPS) induz a ativação da microglia, diminui a resistência elétrica transendotelial (TEER), aumenta o transporte paracelular de fluoresceína de sódio e danifica a função da BHE produzindo reações espécies de oxigênio6,7. TNF- secretado pela microglia ativada aumenta a permeabilidade do BBB8, enquanto citocinas pró-inflamatórias, como IL-1 , IL-4 e IFN , promovem a expressão de ICAM-1 para quebrar o estrutura normal da NVU9. Uma análise transversal, comparando 38 idosos normais com 100 pacientes com DP, revelou angiogênese anormal. Aumento de células endoteliais e vasos sanguíneos foram encontrados na área SNpc de pacientes com DP e primatas parkinsonianos10. A quebra de BBB também foi detectada11. Cada componente da NVU parece estar intimamente ligado e promove a progressão daParkinsondoença. Como adiar o procedimento de neurodegeneração regulando a NVU é uma questão instigante.

1Departamento de Medicina Integrativa, Hospital Zhongshan, Universidade Fudan, Xangai, 200032, China. 2Departamento de Neurologia, Hospital de Medicina Tradicional Chinesa de Nanjing, Nanjing, 210000, China. 3Departamento de Neurologia, Hospital Shuguang, Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Xangai, Xangai, 201203, China. Jingsi Zhang, Zhennian Zhang e Wen Zhang contribuíram igualmente para este trabalho. Correspondências e solicitações de materiais devem ser endereçadas à JX

Os tratamentos existentes, como o Madopar, aliviam os sintomas motores, mas são inválidos na prevenção da neurodegeneração; agonistas da dopamina e inibidores da MAO-B podem aumentar os efeitos colaterais da produção motora anormal, então o estudo de ervas suplementares é essencial12. A literatura que mostra a identificação de pacientes com DP foi relatada pela primeira vez em 1,000 BC na Índia. As civilizações antigas usavam Mucuna pruriens para aliviar os sintomas. Nos últimos anos, extratos naturais e monômeros como taninos, polifenóis, flavonóides, antocianinas e terpenos têm sido amplamente investigados nas ciências médicas13. A Medicina Tradicional Chinesa (MTC) tem sido usada clinicamente há mais de 3.000 anos. A decocção Jia-Jian-Di-Huang-Yin-Zi (JJDHYZ), que deriva de uma prescrição clássica no tratamento de distúrbios motores e de linguagem, foi eficaz em nossos ensaios clínicos anteriores em que tanto o UnifiedParkinsonOs escores da Escala de Avaliação da Doença (UPDRS) e a dosagem de Madopar foram reduzidos em pacientes com DP14. Radix Rehmanniae, Fructus Corni, Radix Morinda Officinalis, Herba Cistanches, Radix Angelicae Sinensis, Radix Asparagi, Radix Paeoniae Alba estão incluídos na prescrição com uma proporção de 1:0.6:1:1:1:1: 1. E os principais compostos químicos dessas ervas brutas são: Rubiadina (PubChem CID: 124062); Peoniforina (PubChem CID: 442534); Albiforina (Pubchem CID: 24868421); ácido ferúlico (Pubchem CID: 445858); Catalpol (Pubchem CID: 91520); Verbascose (Pubchem CID: 441434); Cistanosídeo D (PubChem CID: 5315930); Echinacoside (PubChem CID: 5281771); Remaniosídeo A (PubChem CID: 6325881); Rehmaniosídeo D (PubChem CID: 92044472) e ácido ursólico (PubChem CID: 64945). JJDHYZ mostrou recuperação do comportamento e proteção dos neurônios dopaminérgicos por inibir a apoptose associada às vias mitocondrial e ER caspase 12 em nosso estudo anterior15. No presente estudo, imitamos os sintomas de DP em um modelo de camundongo subagudo usando MPTP e investigamos se JJDHYZ desempenhava um papel regulador em relação aos neurônios DA e seu meio circundante.

Resultados

A dosagem alta de JJDHYZ (JJDHYZ-H) melhorou a expressão do fator neurotrófico derivado da glia (GDNF) em camundongos com lesão de MPTP.

Em nosso estudo anterior, JJDHYZ-H (34 g/kg/dia) foi verificado como a dosagem ideal para melhorar o desempenho comportamental de camundongos com DP, reduzir a perda de neurônios DA e restaurar o conteúdo de dopamina e seus metabólitos relevantes15. Para esclarecer ainda mais o papel neuroprotetor de JJDHYZ, avaliamos as expressões do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e GDNF usando imunofluorescência, PCR em tempo real e análise de Western blot. Não foram observadas diferenças significativas no número de células positivas para BDNF, gene BDNF ou expressão de proteínas entre os grupos (Fig. 1). No entanto, MPTP diminuiu significativamente o número de células GDNF-positivas (P<0.01, fig.="" 1a),="" gdnf="" mrna,="" and="" protein="" expression="" compared="" to="" that="" of="" the="" control="" group=""><0.05, fig.="" 1b,="" c).="" jjdhyz-h="" and="" selegiline="" reversed="" the="">

de células GDNF-positivas e expressão em comparação com as do grupo MPTP-lesionado (P<0.01). although="" jjdhyz-l="" improved="" the="" levels="" of="" gene="" expression="" of="" gdnf=""><0.05, fig.="" 1c),="" no="" neuroprotective="" effect="" was="" detected="" using="" immunostaining="" and="" western="" blot="" (fig.="" 1a,="">

JJDHYZ-H inibiu a ativação da microglia e astrócitos no SN.

Detectamos ativação microglial e astrócitos na substância negra dos grupos controle, modelo e JJDHYZ-H. GFAP foi usado como biomarcador de astrócitos, enquanto Iba-1 e Tmem119 foram usados ​​para marcar a micróglia. Poucas células gliais, indicadores de neuroinflamação, foram observadas em condições físicas normais (A–C na Fig. 3a,c,e). No entanto, numerosas micróglias e astrócitos foram ativados após a administração de MPTP no grupo modelo (GE). A invenção de JJDHYZ-H inibiu a ativação de microglia e astrócitos até certo ponto em comparação com os do grupo modelo, embora os resultados ainda fossem diferentes do grupo controle (IJ).

JJDHYZ-H atenuou as alterações ultraestruturais na BBB.

Os efeitos neuroprotetores de JJDHYZ-H podem potencialmente se correlacionar com as alterações no BBB em modelos de camundongo subagudos de DP. As alterações ultraestruturais do BBB foram detectadas usando um microscópio eletrônico de transmissão (TEM). Os microvasos no SN do grupo controle eram normais com lâmina basal contínua, pés terminais astrocíticos e células endoteliais normais (Fig. 4A). No entanto, as células endoteliais inchadas e os pés terminais astrocíticos derrotaram os lúmens capilares, e o edema ao redor dos microvasos foi distintamente visível no grupo lesionado com MPTP (Fig. 4B). JJDHYZ-H aliviou o inchaço dos pés astrocíticos. Microvasos com membrana basal contínua e integridade do endotélio também foram observados (Fig. 4C).

JJDHYZ-H manteve a expressão de claudina-5 e ocludina e permeabilidade BBB no SNpc.

Nós investigamos o efeito de JJDHYZ-H em duas proteínas transmembrana de junção apertada significativas, claudina-5 e ocludina. A análise de imunocoloração de claudina-5 e ocludina revelou alterações na expressão após a injeção de MPTP. Uma perda significativa de claudina-5- e células positivas para ocludina foram encontradas no SNpc (P<0.001,><0.05, respectively,="" fig.="" 5b,="" c),="" and="" this="" loss="" was="" associated="" with="" an="" increase="" in="" bbb="" permeability=""><0.05, fig.="" 5e)="" in="" the="" mptp="" group="" compared="" to="" that="" in="" the="" control="" group.="" jjdhyz-h="" ameliorated="" the="" loss="" of="" both="" claudin-5=""><0.01) and="" occludin=""><0.05), but="" no="" obvious="" changes="" in="" bbb="" permeability="" were="" observed="" using="" the="" evans="" blue="">

JJDHYZ-H reduziu o aumento anormal de microvasos no SNpc.

CD31 foi usado para identificar microvasos. Descobrimos que havia poucos microvasos CD31(plus) no SN do grupo controle (Fig. 6A). No entanto, a administração de MPTP aumentou significativamente a ocorrência de microvasos CD31 (mais) (Fig. 6B), e JJDHYZ-H reduziu o número de microvasos anormais em comparação com o grupo modelo (P<>

JJDHYZ-H regulou negativamente a expressão de metaloproteinase de matriz (MMP)2, MMP3 e MMP9 na substância negra.

MMP2, MMP3 e MMP9 foram marcados por imunofluorescência (Fig. 7). A expressão de todas essas três MMPs foi aumentada no grupo modelo em comparação com a do grupo controle (P<0.001) and="" the="" optimal="" jjdhyz="" group=""><0.01). although="" down-regulation="" was="" observed,="" mmp3="" and="" mmp9="" expression="" were="" nevertheless="" different="" between="" the="" jjdhyz-h="" and="" the="" control="" group=""><0.05, fig.="">

JJDHYZ-H regulou as expressões de IL-23, CCL2 e CCL4.

Volcano plots are commonly used to analyze the mRNA expressions of microarray. Each point in the scatter plot represents a gene16. Based on published manuscripts and reviews, we listed the most studied 29 factors in Table 1, analyzed their gene expressions with PCR array, and presented the result with volcano plots. The genes with fold-change (FC) >2 ou<−2, besides=""><0.05 were="" considered="" as="" significant="" changed="" and="" marked="" as="" the="" blue="" points="" out="" of="" the="" two="" perpendicular="" lines="" (fig.="" 8a,="" b).="" compared="" with="" the="" control="" group,="" the="" mptp="" model="" group="" down-regulated="" the="" expressions="" of="" ccl2,="" ccl4,="" and="" il-23="" as="" well="" as="" improved="" the="" expressions="" of="" ccl5,="" bfgf,="" nt-3,="" and="" leukotrinens="" c4="" (fig.="" 8a).="" similar="" to="" the="" control="" group,="" jjdhyz-h="" reversed="" the="" inhibitory="" effects="" of="" mptp="" on="" ccl2,="" ccl4,="" and="" il-23;="" but="" it="" also="" up-regulated="" the="" other="" 8="" cytokines'="" expressions="" (fig.="" 8b).="" ten="" of="" the="" gene="" changes="" were="" processed="" with="" ingenuity="" pathway="" analysis="" (ipa).="" ipa="" maps="" molecules="" from="" the="" ingenuity="" pathway="" knowledge="" base.="" the="" computing="" methods="" of="" fold-changes="" per="" gene="" were="" similar="" to="" the="" volcano="" plot.="" the="" statistically="" significant="" difference="" was="" assessed="" by="" right-tailed="" fisher's="" exact="" test17.="" the="" genetic="" interaction="" network="" (fig.="" 8c,="" d)="" showed="" the="" molecular="" interactions="" under="" this="" experimental="" condition.="" in="" general,="" red="" color="" stands="" for="" the="" up-regulation="" of="" genes,="" green="" stands="" for="" the="" down-regulation.="" te="" more="" significantly="" changed="" genes="" were="" marked="" with="" the="" darker="" colors.="" the="" lines="" and="" arrows="" annotated="" the="" types="" of="" molecular="" interactions.="" interactions="" that="" have="" not="" been="" predicted="" are="" marked="" with="" a="" gray="" color.="" we="" verified="" the="" result="" with="" a="" multi-analyte="" elisa="" array.="" expressions="" of="" ccl2,="" ccl4,="" and="" il-23="" were="" significantly="" inhibited="" in="" the="" model="" group=""><0.05), while="" no="" statistical="" differences="" were="" observed="" among="" the="" other="" cytokines="" or="">