PARTE 2 Como o echinacoside induz o relaxamento venoso?

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Discussão

Até onde sabemos, este é o primeiro estudo avaliando o efeito deECHsobre o tônus ​​vascular da artéria pulmonar de rato. Nós achamos issoECHinduziu vasorelaxamento da artéria pulmonar de rato pré-contraída com NE de maneira concentração-dependente, e tais efeitos podem ser observados tanto no endotélio intacto quanto nos anéis desnudados com endotélio. Na artéria pulmonar, a ECH atenuou tanto o influxo de cálcio extracelular quanto a liberação de cálcio intracelular, a via NO-cGMP e a abertura de K^maiscanais (grande condutância Ca^{2 mais}-K ativado^maiscanais e retificador interno K^maiscanais) pareciam desempenhar um papelECHvasorelaxamento induzido da artéria pulmonar de rato. Em PASMCs de ratos,ECHpode reduzir diretamente a concentração de cálcio intracelular. Estudos anteriores também sugeriram queECHpoderia mediar a ação vasodilatadora dependente do endotélio em anéis de aorta torácica de ratos através da via NO-cGMP^[7].

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ECHO vasorelaxamento induzido pode ser observado tanto no endotélio intacto quanto nos anéis sem endotélio. No entanto, a remoção do endotélio resultou em uma redução significativa na resposta máxima e um aumento no EC₅₀em relação aos anéis de endotélio intactos. Tem sido sugerido que NO-cGMP e PGI₂As vias de AMPc desempenham um papel fundamental na regulação do relaxamento vascular dependente do endotélio^[9]. Para explorar esta questão, adicionamos 100 μmol/L deL-NAME, um inibidor da síntese de NO em células endoteliais. Os resultados mostraram queL-NAME atenuou significativamente a vasodilatação deECH, sugerindo que o NO provavelmente desempenha um papel no vasorelaxamento deECH. Também descobrimos que o IMT, um inibidor da ciclo-oxigenase (uma chave PGI₂sintetase), não teve tal efeito, indicando que PGI₂é improvável que esteja envolvido no vasorelaxamento da ECH. Portanto, a ECH pode aumentar a produção de NO a partir deL-arginina no endotélio vascular e ativa a guanilato ciclase, catalisando assim a conversão de GTP em cGMP. Após o protocolo experimental, os anéis apresentaram o platô sustentado de alta porcentagem de contração induzida por NE (1 μmol/L), o que indicou que os anéis foram pré-tratados comECH(30 a 300 μmol/L) apresentou boa atividade (Figura 2A e 2B).

O tônus ​​vascular é regulado pelo Ca intracelular^{2 mais [12]}. Descobrimos que a ECH (100 e 300 μmol/L) reduziu significativamente a contração fásica induzida por NE em anéis arteriais pulmonares desprovidos de endotélio em Ca^{2 mais}solução de KH livre, e esse efeito foi mais pronunciado com a maior concentração de ECH (300 μmol/L), indicando que o efeito inibitório de ECH na contração induzida por NE dos anéis arteriais pulmonares foi mediado pela interferência na capacidade de IP3 para promover a liberação de Ca intracelular^{2 mais}. A NE atua no -receptor para mediar a contração vascular, aumentando assim a

Níveis de Ca2 mais ([Ca2 mais ]i) através da via de transdução de sinal de fosfatidilinositol acoplada à proteína G[13]. Uma vez ativado, desencadeia a formação do segundo mensageiro IP3 e diacilglicerol induzido pela fosfolipase C[14]. O IP3 pode rapidamente mobilizar e liberar Ca2+ do retículo sarcoplasmático para causar um aumento transitório de [Ca2+] I, que pode estar associado à contração fásica induzida por NE em anéis arteriais pulmonares em meio livre de Ca2+. Para investigar o efeito de ECH no influxo de cálcio extracelular, CaCl2 (2,5 mmol/L) foi adicionado sob condições livres de Ca2 plus. A adição de ECH (30, 100 e 300 μmol/L) reduziu significativamente a contração máxima, com o efeito mais significativo observado com 300 μmol/L ECH. Isso sugeriu que a ECH inibe a liberação de cálcio intracelular e o influxo de cálcio extracelular em PASMCs. No entanto, mais estudos são necessários para elucidar a relação entre ECH e inibidores dos canais de cálcio do tipo L. Para investigar o papel do cálcio, Fluo 4-AM foi usado para determinar as concentrações de cálcio intracelular em PASMCs de ratos. Como a adição de NE (1 μmol/L) resultou em uma rápida mudança na tensão dos anéis de vasos (Figura 2), os PASMCs de rato foram carregados primeiro com Fluo 4-AM e, em seguida, NE e ECH foram adicionados. Os resultados mostraram que 1 μmol/L NE pode aumentar a concentração de cálcio intracelular, o que está de acordo com estudos anteriores, e a intensidade de fluorescência média foi menor no grupo NE mais ECH100 do que no grupo NE. Assim, concluiu-se que a ECH pode reduzir a concentração de cálcio intracelular em PASMCs de ratos pré-tratados com NE. Como é preferível detectar a concentração de cálcio intracelular em tempo real, mais pesquisas estão sendo conduzidas para observar as mudanças em tempo real da concentração de cálcio intracelular usando microscopia confocal.

canais também têm sido propostos como potenciais alvos terapêuticos para doenças cardiovasculares devido à sua capacidade de regular o tônus ​​vascular [22, 23]. Descobrimos que o TEA, um inibidor dos canais BKCa, fez com que a curva de concentração-resposta se deslocasse para cima e aumentasse significativamente a EC50. Também descobrimos que o relaxamento induzido por ECH foi significativamente mais fraco na maior concentração de ECH nos anéis após o tratamento com TEA (1 mmol/L) em comparação com o controle. A vasodilatação induzida por NO é devida em parte a uma ativação mediada por proteína quinase G dependente de cGMP dos canais BKCa[24]. Portanto, assumimos que a ECH induziu vasorelaxamento da artéria pulmonar de ratos através dos canais NO-cGMP-PKG-BKCa, o que levou a uma diminuição nos níveis intracelulares de Ca2+ e ao relaxamento de PASMCs. Uma observação interessante foi que diferentes concentrações de ECH reduziram a contração máxima induzida pelo influxo de cálcio extracelular e encurtaram a contração sustentada, o que pode estar relacionado à abertura dos canais de BKCa.

Os canais KIR são os canais mais simples, com apenas dois domínios transmembranares. Eles estão envolvidos na regulação da força motriz para a entrada de cálcio nas células endoteliais vasculares pulmonares; portanto, eles têm sido implicados na regulação da permeabilidade vascular[25] e respostas ao estresse de cisalhamento[26]. Neste estudo, mostramos que o inibidor de KIR causou o deslocamento da curva concentração-resposta para cima e um aumento significativo na EC50 e que o relaxamento induzido por ECH (300 μmol/L) foi significativamente mais fraco em comparação com o controle. Todos esses resultados indicaram que a ECH teve um efeito vasorrelaxante na artéria pulmonar através dos canais KIR. No entanto, dado o papel complexo dos canais de K+ na regulação do tônus ​​vascular, mais estudos são necessários para elucidar esta questão. Recentemente, foi sugerido que os canais K+ participam do remodelamento vascular regulando a proliferação celular e a apoptose [18]. A hipóxia global, como ocorre em grandes altitudes, causa vasoconstrição pulmonar ou remodelação vascular e aumenta a resistência vascular pulmonar[27]. Canais de K+ prejudicados (KATP, KCa, VK e KIR) nas células do músculo liso vascular também estão relacionados ao desenvolvimento de inibição hipóxica de canais de K+ resulta em despolarização da membrana, ativação de canais de Ca2+ (Cav) dependentes de voltagem, Ca2 extracelular mais influxo e Ca2 mais liberação intracelular, resultando assim em um aumento de [Ca2 mais] I, seguido de vasoconstrição pulmonar e proliferação de PASMCs[29]. A abertura dos canais de K+ contribui para a regulação da vasoconstrição pulmonar hipóxica e remodelação vascular. Assim, a ECH pode abrir os canais de K+, atenuando a vasoconstrição pulmonar hipóxica e reduzindo o remodelamento vascular. de hipertensão [22, 28].

Conclusão A ECH induz vasorrelaxamento em artérias pulmonares de ratos pré-contraídas com NE, e tal efeito pode ser observado tanto em endotélio intacto quanto em anéis desprovidos de endotélio. Isso provavelmente está relacionado à abertura dos canais NO-cGMP-PKG-BKCa e à redução dos níveis intracelulares de Ca2+, relaxando assim os PASMCs (Figura 8).

Agradecimentos

Agradecemos a Liang YANG e seu laboratório (Centro de Biologia e Medicina Mitocondrial, The Key Laboratory of Biomedical Information Engineering of Ministry of Education, School of Life Science and Technology e Frontier Institute of Science and Technology, Xi'an Jiaotong University, Xi'an , China) por sua ajuda na detecção da concentração de cálcio intracelular de PASMCs de rato. Este projeto é apoiado pelo Programa Nacional de Projeto de Pesquisa Básica da China (nº 2012CB518200), o Programa de Cooperação Internacional em Ciência e Tecnologia da China (nº 2011DFA32720), a Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 31160219), os Laboratórios-Chave Programa de Desenvolvimento da Província de Qinghai (Não 2013-Z-Y05, Não 2014-ZY-30 e Não 2014-ZY-07), Chave de Pesquisa Conjunta Qinghai-Utah Lab for High Altitude Medicine, a National Natural Science Foundation of China (No 81160012), o Ministério da Educação New Century Outstanding Talents Support Program of China (No NCET-12-1022) e a Natural Science Foundation of Qinghai (No {{ 17}}Z-915Q).

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Contribuição do autor

Ri-li GE e Xiang-Yun GAI desenharam o estudo; Xiang-Yun GAI, Yu-hai WEI, Ta-na WUREN, Ya-ping WANG, Zhan-Qiang LI e Yi ZHOU realizaram a pesquisa; Wei ZHANG e Yu-hai WEI contribuíram com novos reagentes e ferramentas analíticas; Xiang-yun GAI e Shou LIU analisaram os dados; Xiang-Yun GAI escreveu o artigo, e Lan MA e Dian-Xiang LU modificaram o artigo.

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