Parte 2: echinacoside induz a morte de células cancerosas apoptóticas ao inibir a enzima sanitizante do pool de nucleotídeos MTh1

O echinacoside induz a morte apoptótica de células cancerígenas ao inibir a enzima sanitizante do pool de nucleotídeos MTh1

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Resultados

Identificação de Echinacoside como um inibidor de MTh 1

Para buscar compostos naturais capazes de inibir MTH1, usamos a reação enzimática catalisada por MTH1-como um alto rendimento no ensaio de triagem in vitro. Além dos nucleotídeos de purina oxidados, o MTH1 também pode hidrolisar o trifosfato de desoxiguanosina normal para gerar monofosfato e pirofosfato de desoxiguanosina. Na presença de excesso de pirofosfatase inorgânica, todos os pirofosfatos são convertidos em fosfatos inorgânicos, que podem ser quantificados usando um ensaio de absorbância à base de verde de malaquita,41 permitindo assim a medição indireta da atividade de MTH1.32 Para testar o sistema de ensaio, primeiro medimos o efeito de (S)-crizotinib, um composto com potência comprovada como um inibidor de MTH1.33 O resultado mostrou que (S)-crizotinib de fato inibiu potentemente MTH1 (Figura 1A) com um IC50 de 500 nM, que foi sete vezes maior do que o relatado por Huber et al (72 nM).33 Isso provavelmente ocorreu devido às diferenças nos métodos de detecção ou fontes de produtos químicos e enzimas. Adotamos uma abordagem cromogênica menos sensível, enquanto Huber et al usaram um método bioluminescente altamente sensível.33 Tendo isso em mente, selecionamos 12 compostos naturais comercialmente disponíveis (Tabela S1), cada um dos quais é um ingrediente principal de ervas tradicionais com potencial antitumoral atividade.Echinacoside, um composto purificado da planta medicinal parasita Cistanche salsa (Figura 1C), inibiu significativamente a reação (Figura 1B), com um IC50 de 7,01±2,13 μM (Figura 1D). A adição de 50 vezes mais pirofosfatase não teve impacto no resultado, enquanto a adição de cinco vezes mais proteína MTH1 diminuiu significativamente o grau de inibição, sugerindo queEchinacosideinibiu especificamente a atividade de MTH1 no ensaio enzimático in vitro.

O echinacoside inibiu o MTh 1 celular para aumentar o 8-oxog intracelular

A seguir, perguntamos seEchinacosidepode inibir a atividade intracelular de MTH1. A inibição de MTH1 celular resultará no aumento de 8-oxoG intracelular. Demonstrou-se que a avidina se liga a 8-oxoG com alta especificidade;42 portanto, usamos coloração imunofluorescente com avidina conjugada com Cy3-para comparar os níveis intracelulares de 8-oxoG em várias linhagens de células cancerígenas antes e depoisEchinacosidetratamento. Osteossarcoma humano MG{{0}}, SK-HEP-1hepatocarcinoma, MCF-7 câncer de mama e células de câncer colorretal SW480 foram tratados com 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, ou 80 μM Echinacoside por 5 horas, 12 horas ou 24 horas. A coloração com avidina conjugada com Cy3-revelou que o tratamento com Echinacoside 60 μM por 24 horas aumentou clara e significativamente o nível de 8-oxoG celular (substância reativa Cy3-avidina) nessas células cancerígenas ( Figura 2A e B). Maior concentração (80 μM) deEchinacosideresultou em coloração celular 8-oxoG mais forte (Figura 2B), sugerindo uma relação dose-resposta. Resultados semelhantes foram obtidos

por coloração imunofluorescente com um anticorpo monoclonal anti-8-oxoG de camundongo (Figura S1A).43 A concentração deEchinacoside(60 μM) necessário para um aumento significativo no 8-oxoG celular foi muito maior do que o IC50 (7,01 μM) do ensaio in vitro. Isto foi provavelmente devido à diferença de sensibilidade dos dois ensaios. A coloração imunofluorescente é muito menos sensível do que o ensaio enzimático in vitro; além disso, o número de moléculas inibidoras que podem atingir e interagir com o MTH1 celular é influenciado por processos biológicos complexos; adicionalmente, no ensaio in vitro, o dGTP menos favorito é usado como substrato e, portanto, pode ser mais fácil (tomar menos inibidores) inibir MTH1, resultando em uma IC50 mais baixa no ensaio in vitro.

oanticâncereantioxidanteefeitos deechinacosidea partir deCistanchedeserticola

O 8-oxoG celular é gerado por ROS, que é antagonizado por antioxidantes. Assim, um aumento de ROS celulares ou supressão da atividade de antioxidantes também resultaria em um aumento no nível de 8-oxoG celular.Echinacosideem si é um potente antioxidante44,45 e, portanto, deve aumentar, em vez de suprimir, a atividade dos antioxidantes. Para examinar se o nível de ROS celular foi alterado porEchinacosidetratamento, as mesmas células cancerosas foram tratadas com 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, ou 80 μM Echinacoside por 5 horas, 12 horas ou 24 horas e, em seguida, analisadas por citometria de fluxo após coloração com o fluorescente sonda diacetato de 2',7'-diclorofluoresceína. Os resultados mostraram que nenhum desses tratamentos alterou os níveis celulares de ROS (Figura 2C e D). Assim, o aumento do nível de 8-oxoG celular provavelmente resultou da inibição de MTH1 por Echinacoside.

echinacosidecausou extensos danos ao DNA especificamente em células cancerosas A incorporação de 8-oxoG no DNA estimulará BER e MMR, que geram quebras de fita simples (SSB) e lacunas.16,17 Normalmente, essas quebras e lacunas são seladas por mecanismos de reparo envolvendo preenchimento de lacunas e ligação por DNA polimerases e ligases.46,47 No entanto, aumentos rápidos no SSB celular podem saturar a capacidade de reparo celular, levando à formação de inúmeras quebras de DNA de fita dupla (DSB)18 e sinalização DDR. Para examinar se oEchinacosideO aumento induzido em 8-oxoG celular causou danos ao DNA, examinamos um dos marcadores iniciais de dano ao DNA, 53BP1, que se liga a locais de DSB como a resposta celular mais precoce a DSB.48 O MG-63, SK-HEP-1, MCF-7 e SW480 linhas de células cancerosas e as linhas de células não cancerosas fígado normal humano L-O2,49 rim embrionário humano HEK 293 e fibroblasto de camundongo NIH/ 3T3 foram tratados com 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM ou 80 μM Echinacoside por 5 horas, 12 horas ou 24 horas. A imunocoloração fluorescente mostrou que o tratamento com Echinacoside 60 μM por 24 horas aumentou especificamente o número de células com cinco ou mais focos nucleares 53BP1 fortemente corados em todos os cânceres, mas não em nenhuma das linhagens celulares não cancerosas (Figura 2E e F). Um aumento significativo no número de células 53BP1 plus foi observado tão cedo quanto 5 horas após o início do tratamento com Echinacoside (Figura 2F). Concentração mais alta (80 μM) de Echinacoside ou tempo de tratamento mais longo (12 horas e 24 horas) resultou em aumentos maiores tanto no número de células 53BP1 plus (Figura 2F) quanto no número de focos celulares 53BP1. Juntos, esses resultados sugerem que a inibição de MTH1 por Echinacoside causou acúmulo de 8-oxoG e danos extensos no DNA em células cancerígenas, mas não em células não cancerosas.

proliferação de células cancerígenas suprimidas por echinacoside

Em células cíclicas, quebras de fita de DNA não reparadas causarão um colapso das forquilhas de replicação de DNA, o que levará ao bloqueio da proliferação celular por indução de parada do ciclo celular e apoptose.50 Para verificar os efeitos daEchinacosideno crescimento e proliferação celular, primeiro analisamos o crescimento de células cancerígenas MG-63, SK-HEP-1, MCF-7 e SW480 tratadas com Echinacoside por um ensaio de formação de colônias. Os resultados mostraram que as células cancerosas tratadas com 60 μM ou 80 μMEchinacosideformaram muito menos colônias, e as colônias que se formaram eram muito menores (Figura 3A e B), indicando potencial de crescimento muito suprimido. Em seguida, analisamos a proliferação dessas células cancerosas, juntamente com as células não cancerosas L-O2, HEK 293 e NIH/3T3 por um ensaio MTT. Os resultados mostraram que o Echinacoside inibiu de forma dose-dependente a proliferação do câncer, mas não as células não cancerosas (Figura 3C). O estudo ao longo do tempo de células cancerosas tratadas com 60 μM de Echinacoside mostrou que após 5 horas, não houve diferença significativa entre os grupos sem tratamento e tratamento, mas após 12 horas, a proliferação de células cancerígenas foi significativamente inibida em 60 μMEchinacoside(Figura 3D).

etapas do ciclo celular por citometria de fluxo revelaram queEchinacosidetratamento dose-dependente reduziu a porcentagem de células em ambas as fases S e G2/M, enquanto a porcentagem de células na fase G1 aumentou (Figura 4C e D). Após o tratamento de 80 μM com Echinacoside de células MG-63 por 24 horas, as células na fase G2/M diminuíram de 15 por cento para quase zero, e as células na fase S diminuíram de 37 por cento para 17 por cento , enquanto as células na fase G0/1 aumentaram de 43% para 80% (Figura 4E). Esses resultados indicam que o tratamento comEchinacosideinduziu a parada do ciclo celular e bloqueou as células cancerosas na fase G1.

Apoptose induzida por echinacoside em células cancerosas

Consistente com as observações sobre a proliferação celular, a análise de Western blot mostrou que o tratamento com 60 μM e 80 μMEchinacosidepor 24 horas aumentou os níveis de caspase ativa-3 e proteínas clivadas de poli(ADP-ribose) polimerase nas células cancerosas (Figura 5A e B), sugerindo indução de apoptose dependente de caspase. Em seguida, examinamos vários marcadores celulares de apoptose. Em primeiro lugar, a morfologia nuclear deEchinacoside- células cancerosas tratadas foi revelada pela coloração com o corante de DNA DAPI, que mostrou que 24 horas de tratamento com 60 μM e 80 μMEchinacosideaumentou o número de marcas de apoptose, incluindo picnose e cromatina condensada (núcleos mais brilhantes) (Figura 5C). Em segundo lugar, o DNA extraído de células cancerosas tratadas de forma semelhante foi analisado por eletroforese em gel de agarose, que revelou um padrão de escada apoptótico típico (Figura S1B). Finalmente, a caspase ativa celular-3 foi detectada por coloração imunofluorescente, que revelou fortes sinais de caspase ativada-3 emEchinacosidecélulas cancerosas tratadas (Figura S1C).

Em seguida, a porcentagem de células apoptóticas foi medida por coloração dupla de Anexina V-FITC e PI e citometria de fluxo. Análise de células tratadas com 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, 80 μM ou 160 μMEchinacosidepor 2 horas, 5 horas, 12 horas ou 24 horas mostrou que concentrações de 60 μM ou superiores deEchinacosideinduziu apoptose significativa nas células cancerígenas MG-63, SK-HEP-1, MCF-7 e SW480 (Figura 6A), mas não nas células cancerígenas L-O2, HEK 293 e Células NIH/3T3 (Figura S2). Após o tratamento de células MG-63 com 60 μM, 80 μM ou 160 μMEchinacosidepor 24 horas, a porcentagem de células apoptóticas aumentou de 8,89% para 33,72%, 39,01% e 48,12%, respectivamente (Figura 6A). O estudo de curso de tempo mostrou que após 5 horas, não houve diferença significativa entre os grupos de não tratamento e tratamento, mas apoptose significativa foi observada após o tratamento com 60 μM ou concentrações mais altas de Echinacoside por 12 horas (Figuras 6B e S3).

Finalmente, a medição do potencial de membrana mitocondrial pelo corante fluorescente JC-1 mostrou claramente uma perda proeminente de potencial de membrana mitocondrial após o tratamento com 60 μMEchinacosidepor 12 horas (Figura 6C), mas não após 5 horas, indicando a ativação da via de apoptose intrínseca após os danos no DNA causados ​​por 8-oxodG elevado.

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Discussão

Echinacosideé um composto natural isolado das plantas medicinais Cistanche e echinacea.51,52 Tem demonstrado possuir propriedades versáteis de promoção da saúde e prevenção de doenças, incluindo proteção neural, hepatoproteção, anti-inflamação, antifadiga, antisenescência, antidiabetes e atividades antitumorais. 53–58 A bioatividade mais conhecida e aceita deEchinacosideé sua ação antioxidante e de eliminação de ROS;44,45 no entanto, também foi demonstrado que causa danos oxidativos no DNA em células cancerígenas, com os mecanismos subjacentes permanecendo obscuros.58 No presente estudo, usando um alto rendimento em uma triagem in vitro ensaio, descobrimos queEchinacosideinibiu efetivamente a reação enzimática catalisada por MTH1-. O aumento da quantidade da enzima MTH1 diminuiu o grau de inibição, enquanto o aumento da quantidade da pirofosfatase inorgânica não afetou a inibição, indicando que o Echinacoside inibiu especificamente a atividade de MTH1 no ensaio in vitro. O tratamento de diferentes linhagens celulares de câncer humano com Echinacoside causou elevação significativa do nível de 8-oxoG celular sem alterar o nível de ROS celular. Dado que o próprio Echinacoside é um potente antioxidante, esses resultados sugeriram que o aumento do nível de 8-oxoG intracelular foi provavelmente resultado da inibição de MTH1 celular pelo Echinacoside.

Tratamento comEchinacosidecausou extensos danos ao DNA e aumento significativo do bloqueador G1/S-CDK p21, que foram seguidos por morte celular apoptótica marcada e supressão da proliferação celular especificamente no câncer, mas não nas células não cancerosas. Além disso, uma perda proeminente do potencial de membrana mitocondrial após

Echinacosideo tratamento indicou ativação da via de apoptose intrínseca.EchinacosideDanos induzidos ao DNA e regulação positiva de p21 foram observados dentro de 5 horas de tratamento, enquanto apoptose de células cancerosas, ruptura do potencial de membrana mitocondrial e inibição de crescimento foram observadas 12 horas após o início do tratamento. Esses dados suportam que a apoptose de células cancerígenas e a inibição do crescimento foram os resultados dos extensos danos ao DNA causados ​​pela inibição de MTH1. Estudos recentes mostraram que uma redução no tamanho do pool de dNTP celular também pode induzir estresse de replicação do DNA e danos ao DNA. a possibilidade de um tamanho reduzido do pool de dNTP, e Bcl2, uma proteína que reduz o tamanho do pool de dNTP,60 foi significativamente diminuída em células cancerígenas SW480 tratadas com Echinacoside;58 além disso, nossos dados mostraram claramente que o Echinacoside inibiu diretamente o MTH1, o que poderia pelo menos ser parcialmente responsável pelos danos no DNA e efeitos celulares causados ​​pelo Echinacoside.

O pool de dNTP é um alvo crítico de ROS, e dNTPs oxidados são fontes importantes de danos oxidativos no DNA.3,10 SSBs e DSBs de DNA associados ao reparo podem levar à senescência e apoptose celular, que estão implicadas no envelhecimento e um alto grau de intratumor heterogeneidade e altas taxas de mutação em células cancerosas. Em contraste, a inibição de MTH1 tem como alvo um fenótipo que distingue a maioria das células cancerígenas das células normais e, portanto, representa uma nova estratégia anticâncer que não é limitada por adaptações genéticas. Curiosamente, antagonistas de moléculas pequenas da proteína antiapoptose Bcl266,67 e agonistas da proapoptose Bax68 foram desenvolvidos e demonstraram ser novos agentes anticancerígenos promissores. Dado seus mecanismos de ação complementares, a combinação de inibidores de MTH1 e produtos químicos promotores de apoptose criaria uma nova e excitante geração de drogas anticancerígenas.

Pela primeira vez, demonstramos uma nova função para Echinacoside como um composto natural anticancerígeno. No ensaio in vitro, Echinacoside inibiu MTH1 com um IC50 de 7,01 μM. Esse valor de IC50 é superior ao dos inibidores de MTH1 relatados até agora.32,33,69 Usando (S)-crizotinibe como controle positivo, mostramos que nosso ensaio é sete vezes menos sensível do que o usado por Huber et al.33 Assim , o IC50 real do Echinacoside provavelmente será menor. No entanto, para desenvolvê-lo como agente terapêutico, a eficácia da molécula natural de Echinacoside provavelmente precisará ser melhorada. Como um produto natural que tem sido usado como fitoterápico há muito tempo, o echinacoside pode servir como um bom andaime químico para o desenvolvimento de inibidores de MTH1 eficientes e provavelmente seguros.37,70 Dado que os produtos naturais têm sido uma rica fonte de novos andaimes químicos para o design racional de drogas baseado em estrutura,70 abordagens semelhantes ao que usamos aqui,

juntamente com os vastos interesses em produtos naturais para descoberta de medicamentos, será útil para encontrar novos medicamentos baseados em alvos, eficazes e seguros.

Cistancheechinacosidetemanticâncere efeitos de reforço imunológico