Parte 2 Detecção de Cistanches Herba (Rou Cong Rong) Medicamentos Usando Assinaturas Nucleotídicas Específicas da Espécie

Ao buscar as assinaturas de nucleotídeos desenvolvidas neste estudo, descobrimos que 15 dos 31 medicamentos de patente chinesa rotulados como contendoCistanches Herbaem vez disso, continha adulterantes, incluindo oito ingredientes falsificados e sete adulterantes (Tabela 2). Por exemplo, seis lotes foram substituídos por Cy. songaricum, incluindo três lotes de pílulas Shihu Yeguang, um lote de pílulas Kangguzhi Zengsheng, um lote de cápsulas Sanbao e um lote de partículas Wenweishu.

Além disso, diferentes lotes do mesmo fabricante produziram resultados um pouco diferentes. Por exemplo, entre três lotes de um fabricante (ZCY16, ZCY69 e ZCY71), um lote continha uma mistura de Ci.deserticolae Ci. songaricum, um lote compreendia uma mistura deCi. deserticolaeCi. tubulosae um lote continha apenasCi. tubulosa. Dois lotes de outro fabricante (ZCY44 e ZCY70) também diferiram: um lote continha Cy. songaricum, enquanto o outro lote continhaCi. deserticolaeCi. tubulosa.

Cistanches Herbafoi detectado em 23 dos 31 medicamentos de patente chinesa testados (Tabela 2), e apenas 16 amostras eram autênticas, por exemplo, sem adulterantes ou ingredientes falsificados.Ci. tubulosafoi detectado em 16 lotes de medicamentos de patente chinesa, e Ci. deserticola foi detectada em 10 lotes. O. coerulescens não foi detectado em nenhum dos produtos (Tabela 2).

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DISCUSSÃO

A necessidade de desenvolver um novo método de monitoramento de medicamentos comercialmente disponíveis contendoCistanchesErva

Cistanches Herbaé um tônico que é amplamente utilizado em medicamentos restauradores de patente chinesa e outros produtos medicinais. No entanto, o controle de qualidade dos medicamentos patenteados chineses apresenta um grande desafio devido à diversidade e complexidade dos ingredientes. Devido à falta de supervisão regulatória, há oportunidades consideráveis ​​para adulteração ou falsificação de produtos. Além disso, todos os produtos devem ser processados ​​de acordo com a Farmacopeia ou outras normas; adulteração ou falsificação não é permitida durante o processamento. Assim, foram estabelecidas variedades de métodos de controle de qualidade, como cromatografia líquida bidimensional multi-coração (Yao et al., 2015), espectroscopia de refletância no infravermelho próximo (Zhang e Su, 2014; Zhang et al., 2015 ) e cromatografia líquida-espectrometria de massa (Wang et al., 2016b). No entanto, os métodos de química analítica atualmente na Comissão de Farmacopeia Chinesa (2015) não podem ser usados ​​para autenticar todos os ingredientes em medicamentos de patente chinesa ou para detectar a presença de ingredientes adulterantes. Além disso, estudos mostraram que metabólitos direcionados em plantas são alterados durante o processamento do produto, resultando em considerável variabilidade nos resultados dos testes ou falha completa dos métodos de teste (Ananingsih et al., 2013). Assim, ferramentas moleculares, como assinaturas de nucleotídeos específicas da espécie, estão prontas para reforçar os sistemas de controle de qualidade contra o risco de substituição e adulteração fraudulenta de produtos e inclusão de ingredientes não rotulados.

Embora o ITS/ITS2 seja considerado uma ferramenta de alta eficiência para a identificação de fitoterápicos, essas sequências não podem ser amplificadas a partir de amostras altamente processadas (Newmaster et al., 2013; de Boer et al., 2015). Wang et ai. relataram que ITS2 não poderia ser amplificado a partir de extrato de Angelicae Sinensis Radix ou decocções fervidas por mais de 120 min (Wang et al., 2016a). De acordo com as tecnologias tradicionais e a Comissão de Farmacopeia Chinesa (2015), a Cistanches Herba é sempre altamente processada para aumentar a sua eficácia medicinal; esses processos incluem secagem em estufa, salga e vaporização com vinho (Zou et al., 2017), que levam à degradação do DNA. Além disso, vários excipientes são adicionados durante o processamento, como mel, amido e dextrina. Se esses excipientes não forem removidos completamente, a pureza do DNA será afetada. Por exemplo, o seguinte processo de fabricação é usado para gerar cápsulas Sanbao contendo Cistanches Herba: "Cozinhe as fatias medicinais por 1,5 h duas vezes, combine as decocções e filtre a mistura. Concentre o filtrado a uma densidade relativa de 1,20 ~ 1,25 (a 80 ◦C). Adicione outros pós moídos e combine-os para obter uma mistura homogênea. Em seguida, seque a mistura a 60◦C e, em seguida, triture-a em uma massa fina

pó." No entanto, após o processo de produção descrito acima, pode haver dificuldades durante a extração de DNA de medicamentos patenteados chineses, e fragmentos longos podem não ser amplificados a partir do DNA degradado, o que impediria a identificação de adulterantes. qualidade e pureza do DNA, adicionamos etapas adicionais antes da extração do DNA genômico, incluindo lavagem com tampão de pré-lavagem e eluição de dez tubos paralelos em um tubo para cada lote.

Embora todos os medicamentos patenteados chineses usados ​​no presente estudo contivessem de 6 a 25 ingredientes, os pares de primers desenvolvidos poderiam amplificar especificamente as sequências dos adulterantes nesses medicamentos patenteados chineses. O sequenciamento direto dos produtos de PCR mostrou arquivos de rastreamento limpos. Assim, este método de assinatura de nucleotídeos é capaz de identificar ingredientes de espécies autênticas e adulterantes e deve ampliar a aplicação de ferramentas de diagnóstico molecular baseadas em DNA para supervisão de mercado.

lesão renal e doença podem ser tratadas por cistanche

Assinaturas de Nucleotídeos para a Identificação Eficaz de Produtos Cistanches Herba

Ferramentas moleculares que utilizam a tecnologia PCR são muito promissoras para autenticação de medicamentos em sistemas de controle de qualidade. A aplicação bem sucedida dos primers para identificar adulterantes degradados de DNA da Cistanches Herba sugere que um método de detecção baseado em PCR poderia ser amplamente utilizado. No mercado de fitoterapia chinesa, o preço dos ingredientes autênticos da espécie Cistanches Herba é mais de cinco vezes maior do que os preços de seus adulterantes. Nossos resultados mostraram que Cy. songaricum é o adulterante mais comum de Cistanches Herba no mercado, seguido por Ci. Sinensis. Ci. songaricum foi adicionado porque esses medicamentos compartilham características morfológicas semelhantes. Além disso, a composição química do Ci. sinensis é semelhante ao de Cistanches Herba. Como marcadores de controle de qualidade paraCistanches Herbaextratos, echinacoside e acteoside podem ser extraídos de Ci. sinensis. Assim, algumas fábricas farmacêuticas usam Ci. sinensis como substituto na produção de extratos de Cistanches Herba. Em conjunto, os resultados deste estudo indicam que existe uma fraude considerável no mercado dos medicamentos.

A adulteração na medicina de patente chinesa é semelhante à encontrada em outros países. Níveis semelhantes de adulteração foram registrados na América do Norte (Newmaster et al., 2013), Europa (Raclariu et al., 2017) e Ásia (Cheng et al., 2014; Shanmughanandhan et al., 2016; Gao et al. , 2017). Neste estudo, a taxa de adulteração de medicamentos com patente chinesa foi de aproximadamente 48,4%, com apenas 16 das 31 amostras sendo autênticas Cistanches Herba. Além disso, especulamos que os diferentes resultados produzidos em produtos do mesmo fabricante poderiam ser atribuídos a diferenças nas qualidades dos diferentes lotes de materiais da medicina chinesa. Portanto, para controlar a qualidade dos medicamentos patenteados chineses, as matérias-primas devem ser autenticadas antes de serem transformadas em produtos.

Adulteração deCistanches Herbatem sido tradicionalmente associado a questões de oferta e demanda de matérias-primas.Ci. deserticolaeCi. tubulosasão as duas plantas originais atualmente usadas para formularCistanches Herba. No entanto, Ci. deserticola é a única espécie original em Cistanches Herba tradicional autêntica listada na Comissão de Farmacopeia Chinesa (2000), na qual Ci. tubulosa é identificado como um adulterante. Devido à escassez de Ci. recursos deserticola,Ci. tubulosafoi listado como suplemento na Farmacopeia Chinesa desde 2005 (Jiang e Tu, 2009). Até recentemente, os preços dessas ervas diferiram acentuadamente; Ci. tubulosa tem sido muito mais barato do que Ci. deserticola porque há uma oferta muito maior do primeiro. Aqui, nossos resultados mostraram que Ci. tubulosa é mais amplamente utilizado em produtos Cistanches Herba comercialmente disponíveis.

Em conclusão, as assinaturas de nucleotídeos e a base de PCR

Os métodos desenvolvidos neste estudo podem servir como ferramentas úteis para a indústria de medicamentos autenticar ingredientes e detectar adulterantes emCistanchesProdutos Herba. De acordo com o resultado de sensibilidade, mesmo que a proporção de adulterante fosse de um em dez mil, ele pode ser detectado via qRT-PCR. Isso significa que uma vez que uma assinatura de nucleotídeo é detectada emCistanchesProdutos funcionais contendo ervas, podem ser identificados como um ingrediente adulterante ou falsificado. Foi fornecida uma nova solução para a detecção de ingredientes falsificados ou Cistanches Herba adulterados que não estava disponível anteriormente através de métodos de detecção química na Farmacopeia Chinesa. Além disso, esse método pode ser usado para validar tipos crescentes de medicamentos e ampliar as aplicações de ferramentas de diagnóstico molecular baseadas em DNA para supervisão de mercado.

Para aliviar ocrônicarimdoençacomcistache

CONTRIBUIÇÕES DO AUTOR

JH concebeu o estudo e participou de sua concepção. XW, RX e JC contribuíram com amostras e realizaram os experimentos. XW analisou os dados. XW, JH, ZZ, S-GN, JS e SC redigiram o manuscrito. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

FINANCIAMENTO

Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China [número de concessão 81673552], o CAMS Innovation

Fundo para Ciências Médicas [número de concessão 2016-I2 M- 3-016] e o Projeto-chave do Fundo Unido da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China [número de concessão U1403224].

AGRADECIMENTOS

Gostaríamos de agradecer aos nossos colegas que ajudaram na coleta de amostras, identificação, trabalho de laboratório e preparação do manuscrito, incluindo Chaokui Sun, Dianyun Hou e Piao Zhang.

MATERIAL SUPLEMENTAR

O Material Suplementar para este artigo pode ser encontrado online em: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2018. 01643/completo#material-complementar

Figura suplementar S1|O resultado do alinhamento da sequência ITS2 de seis espécies.

Figura suplementar S2|Eletroforese em gel de agarose de todas as amostras.

Tabela complementar S1|Informações de amostragem de Cistanches Herba e seus adulterantes.

Tabela Complementar S2|Informações de sequência de espécies relacionadas baixadas do GenBank.

Tabela Complementar S3|As composições declaradas de diferentes amostras de medicamentos patenteados chineses.

Folha de Dados Complementares S1|Todas as sequências obtidas neste estudo.

Cistanchedeserticola tem muitos efeitos

REFERÊNCIAS

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Declaração de Conflito de Interesses: Os autores declaram que a pesquisa foi realizada na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que possam ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

Copyright © 2018 Wang, Xu, Chen, Song, Newmaster, Han, Zhang e Chen. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Creative Commons Attribution License (CC BY). O uso, distribuição ou reprodução em outros fóruns é permitido, desde que o(s) autor(es) original(is) e o(s) proprietário(s) dos direitos autorais sejam creditados e que a publicação original nesta revista seja citada, de acordo com a prática acadêmica aceita. Não é permitido nenhum uso, distribuição ou reprodução que não esteja em conformidade com estes termos.