Parte 1: Camundongos envelhecidos mostram atualização de memória prejudicada no novo paradigma de atualização de OUL

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Janine L. Kwapis1,2, Yasaman Alaghband1, Ashley A. Keiser1, Tri N. Dong1, Christina M. Michael1, Diane Rhee1, Guanhua Shu1, Richard T. Dang1, Dina P. Matheos1 e Marcelo A. Wood1

As memórias não persistem em um estado permanente e estático, mas devem ser modificadas dinamicamente em resposta a novas informações. Embora novomemóriaa formação é tipicamente estudada em um ambiente de laboratório, a maioria das associações do mundo real são modificações nas memórias existentes, particularmente no cérebro experiente e envelhecido. Até o momento, o campo carecia de um paradigma comportamental simples que possa medir se informações originais e atualizadas são lembradas em uma única sessão de teste. Para suprir essa lacuna, desenvolvemos um novomemóriaparadigma de atualização, chamado de tarefa Objects in Updated Locations (OUL) que é capaz de avaliarmemóriaatualização em uma tarefa não estressante que é apropriada para roedores jovens e velhos. Primeiro, mostramos que camundongos jovens lembram com sucesso tanto a memória original quanto as informações atualizadas no OUL. Em seguida, demonstramos que a infusão intrahipocampal do inibidor da síntese proteica anisomicina interrompe tanto a informação atualizada quanto a memória original no teste, sugerindo que a atualização da memória na OUL envolve a memória original. Para verificar isso, usamos a técnica Arc CatFISH para mostrar que a sessão de atualização OUL reativa um conjunto de neurônios amplamente sobrepostos como o originalmemória. Finalmente, usando OUL, mostramos quememóriaa atualização é prejudicada no envelhecimento, 18-mo mouses. Juntos, esses resultados demonstram que o hipocampomemóriaa atualização é prejudicada com o envelhecimento e estabelecem que o paradigma OUL é um método eficaz e sensível de avaliar a atualização da memória em roedores.

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INTRODUÇÃO

As memórias precisam ser atualizadas dinamicamente para incorporar as informações mais relevantes e recentes ao armazenamento. Essa capacidade de integrar novas informações emmemóriaé fundamental para permitir que os organismos antecipem resultados futuros e se adaptem a novas situações. A maioria das memórias não são associações novas, mas são alterações ou adições (atualizações) de memórias existentes, particularmente no cérebro experiente e envelhecido. Apesar de sua importância fundamental, os mecanismos que suportam a atualização da memória são amplamente descaracterizados, e ainda menos se entende como a desregulação desses mecanismos pode contribuir para o declínio cognitivo relacionado à idade. Compreender como as memórias são modificadas em resposta a novas informações é, portanto, um passo importante para melhorarmemóriaao longo da vida.

As memórias podem ser atualizadas por meio de um processo denominado "reconsolidação", no qual a recuperação desencadeia um período de labilidade que pode permitir que novas informações sejam incorporadas a uma memória existente e estável.memória. O processo de reconsolidação consiste em uma fase inicial de desestabilização marcada pela degradação proteica seguida por uma fase de reestabilização caracterizada pela síntese proteica [1-9]. Trabalhos recentes demonstraram que a reconsolidação só é iniciada quando novas informações são apresentadas na recuperação; quando a recuperação consiste apenas em informações familiares, o originalmemóriapermanece estável e resistente a agentes amnésicos como inibidores da síntese de proteínas [2, 10-16]. Isso sugere que novas informações desencadeiam a desestabilização da memória para permitir a modificação. Consistente com isso, numerosos estudos agora indicam que novas informações apresentadas durante a recuperação podem alterar o conteúdo da memória [2, 3, 11, 17, 18], o componente afetivo da memória [19-22], produzir extinção persistente [23-27 ], ou mesmo reorganizar a memória no nível do circuito [11, 28].

localizaçãomemóriatarefa, denominada paradigma de Objetos em Locais Atualizados (OUL). Os objetivos deste estudo foram duplos. Em primeiro lugar, pretendemos estabelecer a tarefa OUL como um novo método para estudar hipocampo-dependentememóriaatualizando. Em segundo lugar, pretendemos usar esse paradigma para determinar sememóriaatualização é prejudicada com a idade.

O paradigma OUL é novo, pois é capaz de avaliar tanto a memória original quanto as informações atualizadas em uma única sessão de teste. Além disso, a OUL usa o aprendizado incidental que aproveita a preferência inata dos roedores pela novidade, evitando estresse desnecessário e tornando-o apropriado para testar déficits relacionados à idade na atualização da memória. Aqui, primeiro validamos a tarefa OUL, demonstrando que camundongos jovens mostrammemóriatanto para o treinamento original quanto para a atualização de memória na sessão de teste OUL. Em seguida, usamos dois métodos complementares (injeções de anisomicina intra-hipocampal e Arc CatFISH) para verificar se a atualização da OUL requer a recuperação da memória original, em vez de formar uma nova memória independente. Finalmente, usando OUL, demonstramos que camundongos idosos apresentam deficiências emmemóriaatualização, sugerindo que a incapacidade de atualizar memórias pode contribuir para o declínio cognitivo relacionado à idade. Juntos, esses resultados demonstram que o paradigma OUL pode ser usado para entender os mecanismos subjacentes à atualização da memória hipocampal ao longo da vida.

MATERIAIS E MÉTODOS

Ratos

Os sujeitos eram camundongos C57BL/6 J machos adultos jovens (2–4-de idade) ou velhos (18–20 meses de idade) (Jackson Laboratory). Os camundongos foram alojados, alimentados e manuseados conforme descrito nos Métodos Suplementares. Todos os procedimentos foram aprovados pela Universidade da Califórnia, Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais de Irvine e estavam em conformidade com as diretrizes do National Institutes of Health.

NOSSA tarefa

Após manipulação e habituação (ver Métodos Suplementares), os camundongos foram treinados com dois objetos idênticos em locais específicos (A1 e A2) por 1 ou 3d no contexto habituado. Vinte e quatro horas depois, os camundongos receberam uma sessão de atualização, na qual foram atribuídos à condição Sem atualização ou à condição de atualização. Nenhum camundongo Update foi reexposto aos locais de treinamento A1 e A2. Para mouses de atualização, um objeto foi movido para um novo local (A3). Finalmente, os camundongos receberam um teste de retenção no qual foram expostos aos três objetos em locais previamente experimentados (A1, A2, A3) e o quarto objeto em um novo local A4.Memóriapara a formação de treinamento original foi inferido comparando a exploração do novo local A4 com os locais A1 e A2.Memóriapara a atualização foi inferido comparando a exploração do novo local A4 com o local A3.

Cirurgia de canulação

Os camundongos da Fig. 2 foram implantados com cânulas crônicas conforme descrito anteriormente [37] para permitir a infusão direta de anisomicina no hipocampo após a atualização (consulte Métodos Suplementares). Os camundongos se recuperaram por pelo menos 7 dias antes do início dos testes comportamentais. Imediatamente após a sessão de atualização, os camundongos foram infundidos bilateralmente com anisomicina (ANI, 125/ug/μL) ou veículo (VEH) no hipocampo dorsal (1.0 μL/lado). A colocação das cânulas foi confirmada pela coloração das fatias coronais com violeta de cresil.

Peixe-gato

A hibridização in situ de fluorescência para CatFISH foi realizada conforme descrito anteriormente [38, 39] (consulte o Suplemento para obter detalhes). A ribosonda antisense Arc marcada com DIG foi hibridizada com tecido durante a noite e visualizada com um conjugado anti-DIG-HRP, visualizada com um kit de substrato Cy3 e contrastada com DAPI.

Imagens confocais foram coletadas na área CA1b do hipocampo dorsal e as imagens foram pontuadas para identificar a localização do subcompartimento de Arc para calcular uma pontuação de similaridade conforme descrito anteriormente [39].

Análise estatística

A tarefa OUL foi pontuada manualmente para medir os tempos de exploração do objeto, conforme descrito anteriormente para a localização do objetomemóriaexperimentos [40, 41]. As análises estatísticas (ver Suplemento) foram realizadas usando testes t de Student bicaudais, ANOVAs de uma via ou ANOVAs de duas vias com testes t corrigidos por Sidak. ANOVAs de modelo misto foram usadas quando uma variável era uma medida repetida. Um valor de 0,05 foi necessário para significância.

RESULTADOS

Animais jovens mostram com sucessomemóriapara treinamento e atualização de informações em OUL

Nosso primeiro objetivo foi validar a tarefa OUL como capaz de avaliarmemóriaatualização em camundongos jovens (Fig. 1a). Após a habituação, os camundongos foram primeiro treinados para aprender a localização de dois objetos idênticos em um contexto familiar (sessão de treinamento, Dia 1). No dia seguinte, durante a sessão de atualização (Dia 2), os camundongos foram divididos em dois grupos. O grupo Sem atualização foi reexposto às duas localizações de objetos familiares (A1 e A2). O grupo Update foi exposto a um local de objeto familiar (A1) e um objeto foi movido para um novo local (A3). Todos os grupos receberam uma sessão de teste (no Dia 3) para avaliar a memória dos animais para as localizações originais do objeto e a localização atualizada. Atestar, os camundongos foram expostos a quatro objetos idênticos: três em locais previamente expostos (A1, A2 e A3) e um em um novo local (A4).Memóriapara o treinamento original foi avaliado comparando a exploração da nova localização do objeto (A4) com a exploração das localizações do objeto de treinamento (A1 e A2).Memóriapara a informação atualizada foi avaliada comparando a exploração da nova localização do objeto (A4) com a exploração da localização do objeto "atualizada" (A3). Como os camundongos preferem a novidade, a memória para a sessão de treinamento original ou a informação atualizada é demonstrada pelo aumento da exploração do objeto na nova localização (A4) em comparação com cada um dos outros três objetos (indicado por uma pontuação mais alta no índice de discriminação ( DI), ver métodos).

Durante o treinamento, os camundongos de ambos os grupos apresentaram níveis semelhantes de exploração dos objetos A1 e A2, resultando em um índice de discriminação (DI) próximo de zero para ambos os grupos (Fig. 1bi; teste t de Student bicaudal: t(17) {{ 6}}.086, p=0.40). Os níveis de exploração total também foram semelhantes entre os grupos Sem Atualização e Atualização durante o treinamento (Fig. 1bii; teste t de Student bicaudal: t(17)=0.035, p=0.97, n=10,9).

Para confirmar que a localização original do objetomemóriafoi adquirido com sucesso, em seguida avaliamos o desempenho durante a sessão de atualização (Fig. 1c). Os camundongos do grupo No Update mostraram uma preferência igual para os locais reexpostos A1 e A2, resultando em um DI próximo de zero (Fig. 1ci). Os ratos do grupo Update, por outro lado, exploraram preferencialmente o objeto movido A3 em comparação com o objeto não movido A1 e mostraram um DI significativamente maior em comparação com o grupo No Update (Fig. 1ci, teste t de Student bicaudal: t( 17)=3.57, p=0.002). A exploração total também foi significativamente maior no grupo Atualização em comparação com o grupo Sem Atualização durante a sessão de atualização (Fig. 1cii; teste t de Student bicaudal: t(17)=3.39, p {{22} }.004), sugerindo que os ratos passaram mais tempo explorando os objetos quando um novo local foi introduzido. Juntos, esses resultados confirmam que as localizações dos objetos originais foram aprendidas em camundongos jovens expostos a uma sessão de treinamento 10-min, consistente com relatórios anteriores [41, 42].

Para determinar se o originalmemóriafoi modificado para incluir a localização atualizada do objeto (A3), os camundongos receberam uma sessão de teste na qual cada local familiar (A1, A2 e A3) foi testadocontra uma nova localização de objeto (A4) (Fig. 1d). A porcentagem bruta de tempo de exploração para cada um dos quatro objetos durante a sessão de teste é mostrada na Fig. 5A suplementar. Ambos os grupos mostraram-se intactosmemóriapara a informação original, já que ambos os animais Update e No Update preferiram similarmente a nova localização A4 sobre ambas as localizações originais A1 (Fig. 1di; teste t de Student bicaudal: t(17)=0.31, p { {8}}.76) e A2 (Fig. 1dii; teste t de Student bicaudal: t(17)=1.66, p=0.12). Isso confirma que após a atualização, as informações originais são mantidas. Para testar se as informações atualizadas foram aprendidas com sucesso, também comparamos a exploração do novo local A4 com o local atualizado A3 durante a sessão de teste. Os camundongos do grupo No Update mostraram uma preferência igual pelos objetos A3 e A4, resultando em um DI que não foi significativamente diferente de zero (Fig. 1diii; teste t de uma amostra comparado a 0: t(9)=1.55, p {{30}}.156). Os camundongos que receberam a atualização, por outro lado, exploraram preferencialmente o novo local A4 sobre o local atualizado A3 (Fig. 1diii, teste t de uma amostra comparado a 0: t(8)=3.42, p { {41}} 0,009; teste t de Student bicaudal comparando Atualização com Sem Atualização: t(17)=2 0,92, p=0 0,0096), indicando que eles lembram o local atualizado. Não foram observadas diferenças na exploração total durante a sessão de teste entre os grupos (Fig. 1div; teste t de Student bicaudal: t(17)=1.27, p=0.22). Juntos, esses resultados confirmam que os animais jovens exibem comportamentos de preferência consistentes com uma recordação bem-sucedida tanto da informação original quanto da informação atualizada no teste.

Fig. 1 Camundongos jovens realizam com sucessomemóriaatualização na tarefa OUL. um desenho experimental. b Comportamento da sessão de treino. Os camundongos mostram um baixo DI, indicando nenhuma preferência pelo objeto A1 ou A2 (esquerda), e têm níveis semelhantes de exploração total do objeto (direita). c Atualize o comportamento da sessão. (i) Os camundongos na condição de atualização preferem a nova localização A3 à localização familiar A1, enquanto os camundongos sem atualização mostram exploração semelhante das localizações familiares A1 e A2, com um DI próximo de zero. (ii) Os mouses de atualização mostram significativamente mais exploração total de objetos do que os mouses sem atualização. d Comportamento durante a sessão de teste. (i) Ratos nos grupos Update e No Update mostram memória intacta para a localização original do objeto de treinamento A1. (ii) Ambos os grupos também mostrammemóriapara o local de treinamento original A2. (iii) Apenas o grupo Update mostra uma preferência pelo novo local A4 sobre o local atualizado A3; Nenhum mouse Update prefere objetos A3 e A4 igualmente. (iv) Os ratos mostram níveis semelhantes de exploração total do objeto durante a sessão de teste. Os dados são apresentados como média ± SEM. **p <>

A inibição da síntese proteica do hipocampo pós-atualização interrompe tanto a informação atualizada quanto a original.memóriaEm seguida, testamos se as informações atualizadas aprendidas na tarefa OUL modificam o originalmemóriaou forma uma nova associação independente. Para que a tarefa OUL seja um modelo útil de atualização de memória, a memória original precisa ser recuperada e alterada para incorporar as novas informações de localização do objeto apresentadas durante a atualização. Para testar isso, usamos dois métodos complementares para examinar se o originalmemóriaestá envolvido na sessão de atualização da OUL: infusões de anisomicina e análise catFISH.

Primeiro, testamos se a anisomicina aplicada após a sessão de atualização afetariamemóriapara obter as informações originais de treinamento. Numerosos estudos demonstraram que a infusão pós-recuperação do inibidor da síntese proteica anisomicina (ANI) pode bloquear a reconsolidação sob certas condições [43, 44] pelo menos temporariamente [ver 45]. Provavelmente, o originalmemóriatorna-se lábil pela nova informação apresentada durante a recuperação, mas não consegue se reestabilizar adequadamente na ausência de síntese proteica de novo, levando a uma ruptura da memória original [6-9]. Quando nenhuma informação nova é apresentada durante o teste de recuperação, por outro lado, as infusões de ANI não têm efeito, pois novas informações são necessárias para iniciar a reconsolidação [6].

Para determinar se as informações atualizadas na tarefa OUL envolvem o originalmemória, infundimos anisomicina imediatamente após a sessão de atualização e avaliamos se isso atenuou a associação original (fig. 2a). Infundimos ANI diretamente no hipocampo dorsal (DH) após a sessão de atualização (Fig. 2b, posicionamentos de cânulas individuais mostrados na Fig. 1A suplementar), pois as memórias de localização de objetos espaciais são particularmente sensíveis a manipulações nesta região [40, 46, 47 ] e isso nos permitiria localizar omemóriaatualizar e evitar efeitos fora do alvo da inibição global da síntese de proteínas. Os camundongos mostraram exploração semelhante dos objetos A1 e A2 no treinamento (ANOVA de duas vias, sem efeitos principais significativos ou atualização x interação medicamentosa) e tiveram níveis semelhantes de exploração total (ANOVA de duas vias, sem efeitos principais significativos ou atualização x interação medicamentosa) (Fig. 1B, C suplementar). Durante a sessão de atualização, os camundongos na condição de atualização mostraram uma preferência significativa pelo objeto em movimento, e os camundongos na condição sem atualização continuaram a mostrar exploração semelhante dos objetos em ambos os locais familiares (Fig. 2ci; ANOVA de duas vias, principal significativo efeito de atualização (F(1,29) {{10}},31, p < 0,0001),="" mas="" nenhum="" efeito="" significativo="" de="" droga="" ou="" interação="" significativa,="" n="6,6,12,9" )).="" não="" foram="" observadas="" diferenças="" de="" grupo="" entre="" os="" animais="" destinados="" a="" receber="" anisomicina="" ou="" veículo="" e="" nenhuma="" diferença="" na="" exploração="" total="" do="" objeto="" foi="" observada="" durante="" a="" atualização="" (fig.="" 2cii;="" anova="" de="" duas="" vias,="" sem="" efeitos="" principais="" ou="" interação="" significativos).="" isso="" sugere="" que="" antes="" da="" infusão="" de="" anisomicina,="">

Fig. 2 Interrupção da síntese de proteínas apósmemóriaatualização prejudica tanto o originalmemóriae as informações atualizadas em camundongos jovens. um desenho experimental. b Colocação de cânula representativa visando a área CA1 do hipocampo dorsal. c Atualize o comportamento da sessão. (i) Ambos os grupos de camundongos na condição de atualização preferiram a nova localização A3 sobre a localização familiar A1, enquanto os camundongos sem atualização mostram um DI próximo de zero, indicando nenhuma preferência. (ii) Os ratos mostram uma exploração total semelhante entre os grupos. d Comportamento durante a sessão de teste. (i) Para o objeto de treinamento original A1, camundongos na condição Sem Atualização mostram memória intacta, independentemente do tratamento com drogas. Para a condição de atualização, camundongos tratados com anisomicina mostram um DI significativamente reduzido para A1 em comparação com controles de veículo, indicando que a anisomicina prejudicoumemóriapara obter as informações originais de treinamento em Atualizar animais. (ii) Para o objeto de treinamento original A2, nenhum efeito significativo da anisomicina foi observado nos animais No Update ou Update. (iii) Para o local atualizado A3, os animais No Update apresentaram um DI baixo em relação ao objeto A4, independentemente da infusão da droga. Os animais de atualização que receberam anisomicina mostraram um DI significativamente menor do que os controles do veículo, indicando que a anisomicina prejudicou a memória para as informações atualizadas. iv) Não foram observadas diferenças significativas na exploração total no teste. Os dados são apresentados como média ± SEM. **p < 0.01,="" ***p="">< 0,001,="" ****p="">< 0,0001.="" veh,="" veículo;="" ani,="">