Visão geral dos constituintes dos florotaninos em Fucales Parte 3

O glicosídeo de cistanche também pode aumentar a atividade de SOD nos tecidos do coração e do fígado e reduzir significativamente o conteúdo de lipofuscina e MDA em cada tecido, eliminando efetivamente vários radicais reativos de oxigênio (OH-, H₂O₂, etc.) e protegendo contra danos ao DNA causados por radicais OH. Os glicosídeos feniletanóides cistanche têm uma forte capacidade de eliminação de radicais livres, uma capacidade redutora maior do que a vitamina C, melhoram a atividade de SOD na suspensão de esperma, reduzem o conteúdo de MDA e têm um certo efeito protetor na função da membrana espermática. Os polissacarídeos Cistanche podem aumentar a atividade de SOD e GSH-Px em eritrócitos e tecidos pulmonares de camundongos experimentalmente senescentes causados ​​por D-galactose, bem como reduzir o conteúdo de MDA e colágeno no pulmão e no plasma e aumentar o conteúdo de elastina, têm um bom efeito de eliminação no DPPH, prolongar o tempo de hipóxia em camundongos senescentes, melhorar a atividade de SOD no soro e retardar a degeneração fisiológica do pulmão em camundongos experimentalmente senescentes Com degeneração morfológica celular, experimentos mostraram que Cistanche tem boa capacidade antioxidante e tem potencial para ser um medicamento para prevenir e tratar doenças de envelhecimento da pele. Ao mesmo tempo, o echinacoside em Cistanche tem uma capacidade significativa de eliminar os radicais livres DPPH e pode eliminar espécies reativas de oxigênio e prevenir a degradação do colágeno induzida por radicais livres, e também tem um bom efeito de reparo nos danos causados ​​pelos radicais livres da timina.

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Quanto aos Eckols, devido à presença de estruturas de dibenzodioxinas, estes podem ser diferenciados dos demais grupos com base em seus íons moleculares desprotonados, que geralmente são 2 Da menores que outros PTs com DPs iguais, para cada motivo de dibenzodioxina presente na estrutura (Figura 5D). Por exemplo, eckol apresenta um [MH]− em m/z 371, enquanto trifocal, triphlorethol e fucophlorethol estão todos presentes [MH]− em m/z 373. Por sua vez, acena, que tem duas estruturas de dibenzodioxina em sua espinha dorsal, apresentam um [MH]− em m/z 741, enquanto seus equivalentes hexâmeros apresentam [MH]− em m/z 745. O mesmo se aplica aos carmalols, que são essencialmente halls contendo estruturas de dibenzodioxinas [120]. Finalmente, alguns PTs que contêm anéis furanos, como fucofuroeckol e florofuroeckol, são caracterizados por um íon molecular desidratado-desprotonado, ou seja, um [MH]− que é 18 Da menor, em comparação com seus equivalentes sem furano com DPs iguais (por exemplo, estruturas de fucofuroeckol vs. floroeckol diferem apenas na presença/ausência do anel furano e mostram [MH]− em m/z 496 e 478, respectivamente) [120]. A Tabela 3 mostra os dados do MS coletados de diferentes estudos focados na identificação de PTs em Fucales.

Embora esses fundamentos possam ser úteis para a identificação estrutural razoável de PTs de baixo peso molecular, grandes dificuldades surgem quando se trata de oligômeros e polímeros de alto peso molecular, pois sua isomerização aumenta exponencialmente e as múltiplas possibilidades de arranjos e combinações de floroglucinol dificilmente podem ser elucidados por MS ou MS/MS. No entanto, nesses casos, o MS ainda pode fornecer informações valiosas sobre o DP dos compostos presentes em uma mistura de florotaninos. A este respeito, a dessorção/ionização do laser assistida por matriz de tempo de vôo MS (MALDI-TOF-MS) constitui uma abordagem mais adequada para a análise de oligômeros maiores, uma vez que pode detectar moléculas com m/z acima do limite superior de ESI- EM. Esta técnica tem sido utilizada para estudar a fração de florotanino de Sargassum wightii, permitindo confirmar a presença de dímeros, trímeros e hexâmeros de floroglucinol [125]. MS de alta resolução (HRMS) é uma abordagem alternativa que também pode ser usada para a análise de PTs com altos pesos moleculares, contando com íons de carga múltipla e mudanças no padrão isotópico 1 13C positivo. Em outras palavras, quando um composto tem carga dupla ou tripla, ele mostra um padrão de isótopo 1 13C positivo com diferenças m/z de 0,5 e 0,33, respectivamente . Com base nesse princípio, Steevensz et al. [78] foram capazes de traçar o perfil da composição PT de P. canaliculata, F. spiralis, F. vesiculosus e A. nodosum em termos de DP, detectando compostos com pesos moleculares de até 6000 Da que, caso contrário, excederiam a faixa de massa do ESI-MS.

No geral, embora a espectrometria de massa possa ser uma técnica engenhosa para a análise qualitativa de PTs e até poderosa o suficiente para obter uma caracterização razoavelmente boa de compostos de baixo peso molecular, ela falha em recuperar detalhes suficientes sobre o tipo e a posição de ligação das formas isoméricas dos compostos. com maior DPS. Portanto, quando o objetivo é elucidar completamente as características estruturais dos PTs, a RMN é o único método eficaz que pode oferecer uma resolução suficiente para uma análise tão aprofundada.

5.2.3. RMN

A espectroscopia de RMN compreende uma análise direta e não destrutiva que pode ser útil não apenas para acessar o conteúdo dos PTs, mas também para elucidar completamente as características estruturais dos PTs. Quando se pretende obter dados quantitativos, os sinais de ressonância 1H NMR de todos os compostos fenólicos contidos em extratos de algas são integrados e comparados com os de um padrão interno apropriado; esses compostos precisam ser estáveis, quimicamente inertes, disponíveis em forma altamente pura e completamente solúveis no(s) mesmo(s) solvente(s) deuterado(s) da amostra. No geral, os autores têm usado diferentes abordagens e metodologias para quantificar compostos fenólicos e/ou PTs por meio dessa técnica, inclusive em amostras derivadas de Fucale.

Em 2009, Parys et al. descreveram, pela primeira vez, o uso de 1H NMR (RMN) quantitativo para determinar a variabilidade do teor de florotaninos de A. nodosum durante o ano. Em seu trabalho, o ácido trimésico foi usado como padrão interno (2,0 mg de ácido trimésico em 0,8 mL de metanol deuterado e 0,2 mL de óxido de deutério) e uma curva de calibração foi produzida usando floroglucinol. Apesar de maior conteúdo de PTs ser detectado por qHNMR, em comparação com aqueles obtidos usando o método colorimétrico FC, ambos os métodos seguiram a mesma tendência de variações sazonais [126]. É importante notar que, ao contrário do ensaio colorimétrico, que não é específico para PTs ou mesmo para compostos fenólicos, a integração dos sinais de ressonância dos espectros de 1H RMN em qHNMR é comparada com os do padrão interno. Devido a essas diferenças principais, uma comparação direta não pode ser feita com precisão entre as duas metodologias [127,128].

Usando uma abordagem distinta, Stiger-Pouvreau e colegas de trabalho usaram rotação de ângulo mágico de alta resolução (HR-MAS) para quantificar PTs na alga marrom, Cystoseira tamariscifolia. Neste estudo, NMR de estado sólido foi usado para detectar floroglucinol (monômero) in vivo e 1H qNMR foi aplicado para estimar a quantificação do monômero (usando trimetilsilil-propionato –d4 (TSP) como padrão interno). O singleto floroglucinol em δ 6,02 ppm, integrado em três prótons, confirmou sua presença na amostra. A precisão deste método foi avaliada usando uma solução padrão de floroglucinol e os resultados foram validados por comparação com os do ensaio FC. Em última análise, os autores alegaram que a metodologia apresentada consiste em um método inovador e rápido para quantificar o floroglucinol, que pode ser aplicado a todas as espécies de algas. A única limitação do método qNMR reside na necessidade de pelo menos um dos sinais do espectro (singleto, dupleto, etc.) ser inequivocamente atribuído a um e apenas um composto [129].

No início de 2010, os mesmos autores já demonstraram o potencial da RMN 1H HR-MAS in-vivo associada à espectrometria de massas (LC/ESI–MSn ) para observar o perfil químico global de cinco espécies do gênero Cystoseira, presentes ao longo das costas da Bretanha na França: C. baccata, C. foeniculacea, C. humilis, C. nodi caulis e C. tamariscifolia [130]. O

O principal objetivo de seu trabalho foi identificar espécimes de Cystoseira e discutir sua taxonomia. Os resultados comprovaram a eficiência da abordagem apresentada para distinguir principalmente C. nodicaulis e C. tamariscifolia, pois seus espectros evidenciaram a presença de sinais característicos, permitindo sua identificação inequívoca. No caso de um singleto de 2,91 ppm para o primeiro e para o segundo, um pico precisamente de 6.00 ppm caracterizou a espécie e indicou a possível ocorrência de um florotanino simples. Foeniculacea e C. humilis foram geralmente caracterizados pela ocorrência de dois dupletos de igual intensidade a 7,90 e 7,36 ppm. No entanto, a discriminação absoluta entre os dois sinais permaneceu impossível. A similaridade dos sinais de RMN in vivo, em conjunto com a pequena diversidade química intraespecífica de ambas as espécies, justificam estes resultados. Por fim, no caso de C. baccata, apesar de apresentar a diversidade química mais importante, muitos sinais permitiram uma discriminação constante das demais espécies.

Em 2020, Walsh e colaboradores [131] demonstraram o potencial antimicrobiano de dois extratos de florotaninos purificados de A. nodosum e F. serratus, duas algas marrons intertidais. Nesse trabalho, as análises de RMN de 1H e 13C permitiram não apenas uma estimativa quantitativa e qualitativa dos compostos fenólicos totais, mas também o acesso a diferenças no perfil de ligação entre os extratos fenólicos purificados de ambas as espécies. Quanto ao ensaio de FC, um nível significativamente maior de compostos fenólicos totais foi encontrado em A. nodosum do que em F. serratus, e os resultados foram validados pelo ensaio de FC. Além disso, os resultados alcançados usando o ensaio de qNMR e FC demonstraram a existência de variações entre as amostras coletadas a cada mês e entre as duas metodologias.

Para elucidar a estrutura dos PTs, a análise de 1H e 13C NMR foi aplicada pela primeira vez por Glombitza e seu grupo nos anos 70, quando identificaram o floroglucinol em diferentes espécies de algas marrons. A complexidade dos espectros associados a esses derivados permitiu apenas a identificação de estruturas polifenólicas menores. Assim, em 1974, foi a primeira vez que as estruturas químicas de bifuhalol e diphlorethol foram elucidadas a partir de um extrato de etanol 80 por cento de C. tamariscifolia [132].

No entanto, desde então, mais de cem estruturas de PTs foram elucidadas usando RMN [133]. Para isso, os extratos são geralmente submetidos a uma etapa de pré-tratamento com hexano ou éter de petróleo para precipitar grandes PTs. Além disso, para evitar a instabilidade dos PTs, facilitar a análise de RMN e alterar a polaridade desses compostos, eles são frequentemente acetilados usando anidrido acético e piridina, permitindo assim sua purificação por cromatografia de sílica em fase normal [119]. Nos espectros de 1H RMN desse tipo de composto, dois aspectos devem ser destacados: a ressonância dos prótons aromáticos aparece entre δ 6.0 e 7,5 ppm, e os grupos acetil aparecem como picos singletos entre δ 2 e 3 ppm . Esta é uma ferramenta útil para estabelecer o número de grupos hidroxila livres nos compostos fenólicos desprotegidos originais. Os dois tipos de sistemas de anéis aromáticos que podem ocorrer estão representados na Figura 6. O ambiente químico distinto dos dois tipos de prótons (Ha e Hb) altera a multiplicidade dos sinais observados em 1H RMN, bem como sua integração.

Juntamente com espectroscopia de 1H NMR, 13C e HSQC, e espectros de HMBC NMR, foram usados ​​para esclarecer as estruturas de PTs purificados, inclusive em Fucales. A abordagem espectroscópica de correlação NMR heteronuclear é útil para identificar a classe de PTs de uma matriz de amostra (monômero, combustível, cloroetil, full, fucophloroethol, etc.) [134]. Os sinais característicos de 13C-NMR de PTs estão resumidos na Tabela 4. Aparecendo em deslocamentos químicos característicos, as ressonâncias de carbono de um tipo distinto de carbonos, juntamente com sua intensidade, permitem a atribuição de alguns sinais a classes específicas de PTs, particularmente os floretois e halls .

Em 1997 Glombitza et al. [135] descreveram o isolamento e caracterização de 33 PTs da alga marrom, Cystophora torulosa. Diferentes classes de PT foram identificadas, incluindo phlorethols e halls, e fucophlorethols e hydroxyfucophlorethols (exemplos na Figura 7). Além disso, em relação a este último, sete novos hidroxifucofloretois contendo grupos hidroxila adicionais foram identificados e caracterizados (NMR e MS). Conforme referido anteriormente, para prevenir a oxidação e aumentar a lipofilicidade dos derivados isolados da PT, os autores descreveram o seu isolamento como acetatos [82].

Koch et ai. também demonstraram a aplicação de 1H e 13C NMR para caracterizar fuhalolacetatos maiores em B. bifurcado [136]. As técnicas espectroscópicas de HSQC e HMBC (2D) NMR foram usadas por Cérantola et al. para mostrar a presença de estruturas de fucol e fucofloretol nos extratos de Fucus spiralis [137]. A mesma abordagem foi usada com Halidrys siliquosa, abundante na Bretanha. O uso de RMN 1D e 2D e análise de MS permitiu a identificação de quatro derivados fenólicos: trifualóis e tetrafualóis e, pela primeira vez, dicloretóis e tricloretóis [125]. A Tabela 5 resume os estudos mencionados acima nos quais 1H e 13C NMR contribuíram para a elucidação da estrutura de PTs extraídos de algas pertencentes a Fucales.

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