O embaralhamento da frequência optogenética das oscilações teta do hipocampo dissocia a recuperação da memória de trabalho dos códigos espaçotemporais do hipocampo, parte 2

Combinando estimulação optogenética MS e imagem de cálcio do hipocampo

Para estudar os efeitos das manipulações teta nos códigos espaciais e temporais do hipocampo, combinamos a estimulação optogenética da MS com imagens de cálcio em CA1. Este paradigma experimental levanta duas questões potencialmente importantes: os implantes de lentes GRIN envolvem danos nos tecidos que podem alterar o estado fisiológico das oscilações teta, e o espectro de comprimento de onda do LED de excitação usado para excitar GCaMP6f pode potencialmente se sobrepor ao da opsina localizada nas fibras terminais das fibras GABAérgicas MS em o hipocampo.

O hipocampo é uma estrutura muito importante do cérebro. É o principal responsável por armazenar e processar informações de memória. Como todos sabemos, a memória é uma parte importante das atividades intelectuais humanas e uma forma importante de comunicarmos e interagirmos com o ambiente que nos rodeia. Portanto, a função do hipocampo é crucial para as nossas vidas.

O espaço hipocampal é uma forma de descrever como a informação espacial é processada em nossos cérebros. Refere-se à área ativa de um grupo de neurônios em nosso cérebro que processa informações espaciais. Esta área é chamada de área parahipocampal e está intimamente relacionada ao cavalo-marinho. A pesquisa mostra que a área próxima ao hipocampo processa informações relacionadas ao espaço e à memória e é uma parte fundamental do nosso processo de memória.

Especificamente, o processamento de informações espaciais pelo hipocampo inclui principalmente dois aspectos. O primeiro aspecto é nosso senso de direção e capacidade de navegar. Quando caminhamos, o hipocampo registra nossos passos e posição, mantendo nossa orientação no espaço. Se nosso hipocampo estiver danificado, isso pode causar problemas como desorientação ou impossibilidade de encontrar o caminho de casa.

Outro aspecto é a capacidade de memória. As pessoas usam as informações espaciais fornecidas pelo hipocampo para ajudar as pessoas a se lembrarem. Se vivenciarmos algo em determinado local, o hipocampo armazenará essas informações e poderemos aprender sobre essas experiências ou pessoas por meio da recordação.

Estamos constantemente a reforçar as nossas capacidades de memória através da aprendizagem, e o hipocampo desempenha um papel crucial neste processo. Devido à importância do hipocampo, precisamos estar atentos à sua saúde e protegê-lo através de alguns métodos. Sudoku, correr, aprender novas habilidades, etc. podem melhorar a nossa memória e proteger a saúde do nosso hipocampo.

Portanto, dieta, exercícios e manutenção de um bom sono podem nos ajudar a proteger nosso hipocampo e melhorar nossa capacidade de memória. Quando temos uma mente clara e uma memória forte, podemos compreender melhor o mundo e criar uma vida melhor. Percebe-se que precisamos melhorar nossa memória. Cistanche deserticola pode melhorar significativamente a memória, porque Cistanche deserticola também pode regular o equilíbrio dos neurotransmissores, como aumentar os níveis de acetilcolina e fatores de crescimento. Essas substâncias são muito importantes para a memória e o aprendizado. Além disso, a carne também pode melhorar o fluxo sanguíneo e promover o fornecimento de oxigênio, o que pode garantir que o cérebro receba nutrientes e energia suficientes, melhorando assim a vitalidade e a resistência do cérebro.

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Para verificar se os implantes de lentes GRIN alteraram a fisiologia da teta, primeiro implantamos camundongos com uma lente GRIN no hipocampo direito e dois eletrodos nos hipocampos esquerdo e direito, e encontramos sinais teta comparáveis ​​em ambos os hemisférios (Fig. 3a). Comparamos as oscilações teta durante a exploração de campo aberto em camundongos com lente GRIN e eletrodo LFP acoplado, com camundongos apenas com eletrodos, e não encontramos diferenças significativas entre os dois grupos (Fig. 3b). Não encontramos nenhuma diferença significativa entre a potência teta relativa em ratos implantados com uma lente GRIN e eletrodo LFP (0,14 ± 0.007) versus apenas um eletrodo ( 0,154 ± 0,008; teste t, t54=1,060, p=0,29).

Embora relatórios anteriores tenham descrito que a combinação da estimulação optogenética de ChrimsonR em corpos celulares com imagens de neurônios GCaMP nas proximidades dos terminais é possível com crosstalk mínimo , em seguida monitoramos qualquer ativação potencial de opsina de terminais MS no hipocampo registrando CA 1- LFP enquanto emite luz de excitação com nosso miniscópio através de uma lente GRIN. Depois de calibrar a potência de saída da luz do mini osciloscópio (Fig. 3c), não encontramos nenhum efeito da luz de excitação azul do mini osciloscópio na potência teta endógena (1ANOVA, F (4.295)=0 0,7729, p=0 0,5435 ; Fig. 3d). Como foi relatado que a luz de excitação do mini osciloscópio pode induzir uma leve despolarização de terminais transfectados com ChrimsonR53, potencialmente dificultando ainda mais a despolarização induzida pela optogenética, em seguida aplicamos estimulações MSoptogenéticas durante a geração de imagens com ~0.3mW / mm2 de potência do LED do mini osciloscópio e foram capazes de interromper ou estimular significativamente o teta usando estimulação embaralhada ou de 8 Hz, respectivamente (teste de Friedman χ2=6.000,p=0.0278; Fig. 3e) .

A interrupção dos ritmos teta modula uma pequena porção das células CA1

Em seguida, realizamos estimulações optogenéticas fásicas (5 s ON, 5 s OFF) de MS enquanto gravávamos células piramidais CA1 enquanto os ratos exploravam livremente um campo aberto (Fig. 4a). Descobrimos que uma porção das células registradas estava consistentemente excitada nessas condições, enquanto outras eram inibidas (Fig. 4b; ver Métodos). A atividade das células piramidais durante as estimulações foi geral mais baixa em comparação com a linha de base, tanto para a estimulação embaralhada durante a corrida (correlação de Pearson, R2=0.567, p menor ou igual a 0.0 0{{20}}1)e períodos de repouso (R2=0.521, p Menor ou igual a 0,0001), bem como para estimulação de 8 Hz (R{{ 14}}.6, p Menor ou igual a 0,0001 para períodos de descanso; R2=0.632, p Menor ou igual a 0,0001 para períodos de corrida; n=1849 células, N=5 ratos; Fig. 4c). No geral, ~ 6, 42 ± 0, 52% do total de células foram significativamente moduladas por estimulações optogenéticas embaralhadas (Fig. 4d). Entre essas células moduladas, 50, 56 ± 6, 38% foram inibidas, enquanto 49, 43 ± 6, 38% foram excitadas (n=1849 células, N=5 camundongos; Fig. 4e).

Em seguida, analisamos os efeitos da estimulação optogenética na sintonia espacial dos neurônios do hipocampo à medida que os ratos exploravam livremente o campo aberto. Para este fim, calculamos mapas de taxa de atividade usando época dentro ou fora dos períodos de estimulação (para a condição de linha de base, incluímos épocas que seguiram o mesmo padrão de 5 s ON, 5 s OFF usado para estimulação real; Fig. 4f). A estabilidade foi então calculada como a correlação entre os mapas de taxas para as épocas de referência e de estimulação. Apesar das mudanças acima mencionadas na atividade geral, os mapas de taxa não exibiram nenhuma mudança na estabilidade espacial para estímulos embaralhados ou de 8 Hz (Kruskal-Wallis H3=3.5, p=0.1773; Fig. 4g).

A estimulação optogenética MS altera o comportamento, mas não os códigos espaçotemporais

Para avaliar os efeitos da interrupção teta nos códigos temporais e espaciais, monitoramos a atividade do neurônio piramidal CA1 na trilha linear de 3-tom (Fig. 5a). Aqui, aproveitamos uma das principais vantagens da imagem de cálcio, que é a capacidade de registrar células registradas ao longo de vários dias enquanto realizamos estimulações embaralhadas ou de 8 Hz em dias selecionados (Figs. 5b, c, painel inferior). Focamos nossa análise em pares de dias com o mesmo tempo (48 h) entre os testes (Fig. 5c, painel superior). Para cada condição, avaliamos a porção do total de células que codifica significativamente uma ou várias variáveis ​​e não encontramos nenhum efeito de 8 Hz ou estimulação embaralhada na codificação espacial e temporal (RM-ANOVA; F2=0.807, p {{11 }} 0,453 para o efeito principal dos estímulos; F 6=1 0,283, p=0 0,285 para a interação entre a estimulação e a variável codificada, n=5 camundongos; Fig. 5d).

Embora a porção de células não tenha mudado sob condições de estimulação, avaliamos o efeito da estimulação MS na estabilidade das curvas de sintonia das células moduladas no local, no tempo e na distância. Para este fim, rastreamos neurônios ao longo dos dias (Fig. 5c; ver Métodos) e calculamos a estabilidade dos campos de lugar e tempo como a correlação de pares entre os campos ao longo de 48 horas. Como o CA1 é conhecido por exibir um remapeamento proeminente ao longo dos dias, também usamos um par de dias sem estimulação para calcular um escore de estabilidade basal para ser usado como referência (Fig. 5e-g). Não encontramos nenhuma mudança na estabilidade durante a estimulação MS para células moduladas por local (1ANOVA, F2=1.907, p=0.1511; n=205 pares de células agrupados de N=5 camundongos independentes; Fig. 5h), células moduladas no tempo (1ANOVA, F2=2.201, p=0.113; n=227 pares de células agrupados de N=5independentes camundongos; Fig. 5i) e células moduladas por distância (1ANOVA, F 2=0 0,6962, p=0 0,5024; n=64 pares de células agrupados de N=5 independentes ratos; Fig. 5j). Também estendemos a mesma análise para neurônios conjuntivos (isto é, neurônios que podem codificar mais de uma variável; Figura 5a-f suplementar) e não encontramos efeitos de estímulos optogenéticos na estabilidade do espaço conjuntivo (1ANOVA, F2=3.731, p=0.0661;N=4 ratos independentes; Figura 5g suplementar), temporal (1ANOVA,F2=1.993, p=0.8228; N {{47 }} camundongos independentes; Figura Complementar 5h) e células de distância (1ANOVA, F 2=0 0,469, p=0 0,6400; N=4 camundongos independentes; Figura Complementar 5i).

Em seguida, avaliamos a qualidade dos códigos espaço-temporais usando um classificador bayesiano anaive para decodificar localização (Fig. 6a, b), tempo (Fig. 6cd) e distância percorrida (Fig. 6e, f), usando amostras aleatórias de bootstrap (n {{3 }} amostras de bootstrap, n=160 células por amostra). Os erros de decodificação foram sistematicamente inferiores aos substitutos embaralhados, incluindo durante 8 Hz ou estimulação embaralhada para localização (2ANOVA,F5=2172, p menor ou igual a 0.0001; n=50 amostras de bootstrap de um mouse representativo; Fig. 6a), tempo (2ANOVA, F5=1292, p menor ou igual a 0,0001;n=50 amostras de bootstrap de um mouse representativo; Fig. 6c) e distância (2ANOVA, F 5=1964, p menor ou igual a 0,0001; n=50 amostras de bootstrap de um camundongo representativo; Fig. 6e) indicando que os códigos espaço-temporais foram preservados durante a estimulação. Para estimar a significância interindividual dos códigos espaço-temporais, o erro de decodificação foi avaliado usando os resultados reais e embaralhados (ver Métodos) para um determinado dia, para cada camundongo (Fig. 6b, d, f). alterar significativamente a codificação de localização (1ANOVA, F2, 11=2 0,2332, p=0 0,1432; N=5 ratos; tamanho do efeito η 2=0 0,29; Fig. 6b), tempo (1ANOVA, F2,11=0.4561, p=0.6452; N=5ratos; tamanho do efeito η2=0.07; Fig. 6d), ou distância ( 1ANOVA,F2,11=0.6102, p=0.5606; N=5 ratos; tamanho do efeito η2=0.09; Fig. 6f).

No paradigma comportamental usado para analisar a modulação temporal da atividade neuronal, os ratos são programados para beber água e treinados para coletar recompensas. Com base nessa suposição, quantificamos o número de retornos a um local de recompensa vazio como erros e calculamos a porcentagem de tentativas corretas em relação ao total de tentativas como um proxy para o desempenho (Fig. 6g). Nessas condições, encontramos um efeito significativo da estimulação optogenética no desempenho ao longo dos dias (teste de Friedmanχ2=6.000, p=0.0278) e, em particular, uma diferença significativa no desempenho entre durante a linha de base (78,70 ± 2,45%) e estimulação embaralhada (44,44 ± 5,56%; comparações múltiplas, p=0.0429; N=3 camundongos; Fig. 6h). Apenas ratos com um mínimo de 12 execuções foram incluídos nesta análise. Devido às limitações desta tarefa (baixa carga cognitiva e baixo número de camundongos testados), em seguida nos propusemos a avaliar o efeito da estimulação optogenética da MS em tarefas de memória padronizadas.

A interrupção dos sinais teta prejudica o reconhecimento espacial e a recuperação da memória de trabalho

Para testar o papel dos sinais teta na memória espacial, utilizamos um grupo dedicado de camundongos injetados com ChrimsonR e implantados com fibra óptica no MS (Fig. 7a, painel esquerdo). Os ratos foram submetidos a uma tarefa de reconhecimento de objetos novos (NPOR) (Fig. 7a, painel direito). Para avaliar o papel das oscilações teta na codificação e recuperação da memória, mostramos a Fig. 7|Os estímulos optogenéticos da EM interrompem a manutenção e a recuperação, mas não a codificação da memória episódica e de trabalho. a Ratos foram implantados com fibra óptica no MS após transfectar ChrimsonR (topo). Eles foram então submetidos à nova tarefa de reconhecimento de local de objeto (parte inferior, consulte Métodos). b Nesta tarefa, ambos os estímulos embaralhados (vermelho) e 8 Hz (azul) durante a recuperação, bem como estímulos de 8 Hz (verde), mas não embaralhados (amarelo) durante a codificação, interromperam o desempenho da memória (2ANOVA, F4, 31=3). 283 para o efeito principal do tratamento,p=0,0097; tamanho do efeito para o efeito principal do grupo, η2p=0,306; N=12 ratos). c

Para examinar melhor o efeito da estimulação MS na codificação, manutenção e recuperação da memória, os ratos foram treinados em uma tarefa retardada de não correspondência com a amostra (DNMTS) em um labirinto em T automatizado. d Camundongos transfectados com ChrimsonR (vermelho) ou YFP (preto) foram treinados (na ausência de estimulação) para escolher o braço correto e não correspondente até que o desempenho excedesse um critério de 0,8 porções de escolhas corretas por dia, para pelo menos dois dias consecutivos (faixa verde; RM-ANOVA, F8=8.738,p Menor ou igual a 0.0001 para o efeito principal dos dias de treinamento; testes de comparação múltipla de Tukey pareados entre grupos, p=0.420; N=17 ratos). e – g Desempenho durante a estimulação em diferentes fases da tarefa para camundongos injetados com controles ChrimonR (parte superior) ou YFP (parte inferior). O sombreamento vermelho indica as regiões estimuladas do labirinto. e Desempenho médio diário ao realizar estimulações MS apenas durante a codificação (RMANOVA, F11=2.197, p=0.547; N=17 ratos). f Desempenho médio diário ao realizar estimulações MS durante o período de atraso de 10 s apenas (RM-ANOVA, F11=3.483,p=0.0495; tamanho do efeito para o efeito principal do tratamento, η2p {{ 25}}.109; N=17 ratos).g Desempenho médio diário ao realizar estimulações MS durante a recuperação apenas (RM-ANOVA, F11=3.265, p=0.050; N { {33}} ratos).

Todos os gráficos de barras e linhas representam a média ± SEM de pelo menos três experimentos independentes. Artigo https://doi.org/10.1038/s41467-023-35825-5Nature Communications|(2023) 14:410 10realizou estimulações optogenéticas especificamente durante as fases de amostra e teste e calculou o índice de reconhecimento (RI; ver Métodos). Ao estimular durante a recuperação, o desempenho da memória foi significativamente reduzido para ambos embaralhados (00,472 ± 0.048 RI, n {{10}} ratos) e 8 Estimulações Hz (00,435 ± {{40}}0,057 RI, n=6 ratos) grupos, em comparação com controles YFP que exibiram um aumento significativo na exploração de objetos durante o teste (0,61 ± 0,018 IR; 2ANOVA, F4,31=3,283 para o efeito principal do tratamento, p=0,0097; tamanho do efeito para o efeito principal do grupo, η2p=0,306; N {{30 }} ratos; Fig. 7b). Por outro lado, os estímulos embaralhados durante a codificação não prejudicaram a memória no momento do teste (0,60 ± 0,034 RI, p=0 0,0157, n=6 ratos), mas a estimulação de 8 Hz durante a codificação reduziu o desempenho da memória para níveis aleatórios (0,39 ± 0,074 RI, p=0 0,8740, n=6 camundongos).

Para examinar o efeito do controle optogenético da MS em fases específicas da função da memória de trabalho (codificação, manutenção e recuperação), os camundongos foram transfectados com ChrimsonR e implantados com fibra óptica na MS e treinados em uma tarefa retardada de não correspondência com a amostra (DNMTS). . Na fase de amostragem, os ratos foram forçados a correr para um braço designado aleatoriamente para receber uma recompensa. Após um atraso (10 s), eles poderiam correr no braço oposto (escolha correta) para receber outra recompensa ou correr no mesmo braço sem recompensa (braço incorreto; Fig. 7c). A vantagem desta tarefa é permitir testes repetitivos, isolamento específico das fases da tarefa (treinamento, atraso, teste) e controles dentro dos sujeitos. Os ratos foram treinados nesta tarefa sem estimulação até que um desempenho de critério de 0,8 (uma porção de tentativas corretas) fosse alcançado por pelo menos dois dias. Os ratos de controle ChrimsonR e YFP exibiram melhora significativa ao longo do tempo (RM-ANOVA, F8=8.738,p menor ou igual a 0.00{{21} }1 para o efeito principal dos dias de treinamento). É importante ressaltar que não encontramos diferenças nas taxas de aprendizagem entre os dois grupos (Tukey pareado; p=0 0,42 0; Fig. 7d). Depois que os ratos aprenderam a regra associada à tarefa DNMTS, avaliamos o desempenho durante a entrega embaralhada (00,792 ± 0.045) ou 8 Hz (0. 850 ± 0.036) estimulação optogenética apenas na fase de codificação (escolha forçada) e não observou nenhuma diferença no desempenho em relação à linha de base (00,825 ± 0.030, RMANOVA, F11=2.197, p=0.547, N=17; Fig. 7e). Quando estimulados apenas durante o período de atraso, apenas os estímulos embaralhados diminuíram significativamente o desempenho da memória (0,733 ± 0,057) em comparação com a linha de base (0,825 ± 0,030, RM-ANOVA, F11=3 0,483, p=0 0,0495; tamanho do efeito para o efeito principal do tratamento, η2p=0.109; Fig. 7f). Em contraste, quando estimulados durante a recuperação, os ratos estimulados com 8 Hz apresentaram desempenho de memória significativamente reduzido (0,675 ± 0,049) em comparação com o valor basal (0,825 ± 0,030, RM-ANOVA, F11=3,265, p=0). 050; Figura 7g). Em contraste, os ratos de controle YFP não foram afetados por estímulos durante a codificação (RM-ANOVA, F2=0.1314, p=0.8781), o período de atraso (RMANOVA, F2=0.2020, p=0.8197), ou recuperação (RM-ANOVA, F2=0.0454,p=0.9557; tamanho do efeito para o efeito principal do tratamento, η2p=0 .196) de memória de trabalho.

O controle optogenético dos neurônios MS não altera a locomoção

É importante ressaltar que foi relatado anteriormente que a estimulação das oscilações teta poderia diminuir a velocidade locomotora e sua variabilidade, o que poderia explicar, pelo menos em parte, os efeitos dos estímulos optogenéticos na memória de trabalho e episódica. Para avaliar completamente a especificidade da estimulação optogenética da MS na memória, realizamos experimentos adicionais para descartar os efeitos diretos das estimulações optogenéticas na velocidade locomotora. Um subconjunto de camundongos injetados com ChrimsonRand implantado com fibra óptica no MS, bem como eletrodos LFP em CA1, foi autorizado a explorar um campo aberto livremente enquanto era submetido a estímulos optogenéticos de 5 s ON, 5 s OFF (Fig. Complementar 6a). levou a um ritmo consistente das oscilações do hipocampo para essa frequência (Figura 6b suplementar). Essas estimulações não foram associadas a nenhuma mudança aparente no comportamento locomotor (Fig. Complementar 6c), incluindo velocidade média (teste t bicaudal não pareado, t116=0 0,4140, p=0 0,6796; Fig. Complementar 6d) e coeficiente de variação de velocidade (CV; teste t bicaudal não pareado, t 116=0 0,8296, p=0 0,4095, n=59 épocas de estimulação; Figura 6e suplementar) . Da mesma forma, a estimulação embaralhada levou consistentemente à abolição das oscilações teta (Fig. Complementar 6f), mas nenhuma mudança aparente no comportamento locomotor (Fig. Complementar 6g), incluindo velocidade média (teste t bicaudal não pareado, t118=0.2268 , p=0.8210; n=60 épocas de estimulação; Fig. Complementar 6h) e CV de velocidade (teste t bicaudal não pareado, t118=1.838, p {{36 }}.686; n=60 épocas de estimulação; Figura 6i suplementar).

Embora a frequência teta natural e a velocidade locomotora estejam correlacionadas59, a direção exata da causalidade entre essas variáveis ​​permanece pouco compreendida. Para responder a esta questão, realizamos estimulação optogenética usando um paradigma 5s ON, 5s OFF, e uma frequência aleatória foi selecionada para cada época de estimulação (Fig. Complementar 6j). Estas frequências de estimulação cobriram todo o espectro da tetabanda (Fig. Complementar 6k). Como esperado, descobrimos que as frequências de oscilações teta naturais estão diretamente correlacionadas à velocidade de corrida para um exemplo de mouse (R 2=0 0,1114, p menor ou igual a 0 0,0001; Figura complementar 6l). É importante ressaltar que quando a frequência de oscilação teta resulta do controle MSoptogenético, a correlação cai abaixo do nível de chance (R 2=0 0,0006779, p=0 0,6244; Figura complementar 6m) sugerindo que a locomoção dita a frequência teta, mas não a oposto. Nós replicamos sistematicamente esses resultados em camundongos e observamos uma queda na correlação entre a frequência teta e a velocidade locomotora sob controle de estimulação optogenética (teste t pareado, t3=3.922, p=0.0295;N {{20 }} ratos; Figura complementar 6n). Em conjunto, estes resultados sustentam que a nossa estimulação optogenética não altera o comportamento locomotor, o que é altamente relevante para os próximos ensaios comportamentais.

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