Cistanche deserticola é uma planta em extinção usada para remédios e alimentos. Nosso objetivo é explorar as diferenças no metabolismo entre inflorescências em partes não medicinais e hastes suculentas em partes medicinais para fortalecer a aplicação e desenvolvimento das partes não medicinais de C. deserticola. Realizamos análises metabolômicas por LC-ESI-MS/MS nas inflorescências e hastes suculentas de três ecótipos (terreno salino-alcalino, campestre e arenoso) de C. deserticola. Um total de 391 metabólitos comuns em seis grupos foram identificados, dos quais isorhamnetin O-hexoside (inflorescência) e rosinidin O-hexoside (caules suculentos) podem ser usados ​​como marcadores químicos para distinguir caules e inflorescências suculentas. Comparando as diferenças metabólicas entre os três ecótipos, descobrimos que a maioria dos diferentes metabólitos relacionados ao estresse sal-álcalis eram flavonoides. Em particular, mapeamos a via biossintética dos glicosídeos feniletanóides (PhGs) e mostramos as diferenças metabólicas nos seis grupos. Para entender melhor os mecanismos farmacodinâmicos e os alvos de C. deserticola, examinamos 88 componentes químicos e 15 potenciais alvos de doenças por meio de docking molecular. Os ingredientes ativos de C. deserticola têm um notável efeito de ancoragem nos alvos de doenças do envelhecimento, como osteoporose, doenças vasculares e aterosclerose. Para explorar o valor de uso da inflorescência, analisamos o encaixe molecular dos metabólitos flavonóides únicos na inflorescência com alvos de inflamação. Os resultados mostraram que o crisoberil e o cinarosídeo tiveram pontuações mais altas para alvos de inflamação. Este estudo fornece uma base científica para a descoberta e industrialização do valor dos recursos das partes não medicinais de C. deserticola e a realização do desenvolvimento sustentável de C. deserticola. Ele também fornece uma nova estratégia para explorar indicações de ervas chinesas.

De acordo com estudos relevantes, a cistanche é uma erva comum conhecida como "a erva milagrosa que prolonga a vida". Seu principal componente é o cistanósido, que possui diversos efeitos como antioxidante, anti-inflamatório e promotor da função imunológica. O mecanismo entre cistanche e clareamento da pele reside no efeito antioxidante dos glicosídeos cistanche. A melanina na pele humana é produzida pela oxidação da tirosina catalisada pela tirosinase, e a reação de oxidação requer a participação do oxigênio, de modo que os radicais livres de oxigênio no corpo se tornam um fator importante que afeta a produção de melanina. Cistanche contém cistanósido, que é um antioxidante e pode reduzir a geração de radicais livres no corpo, inibindo assim a produção de melanina.

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1. Introdução

Cistanche deserticola é uma planta comestível e medicinal que é frequentemente chamada de "ginseng do deserto". 1 C. deserticola foi registrada pela primeira vez na Matéria Médica Chinesa de Shen Nong há cerca de 1800 anos e tem sido amplamente usada como um tônico tradicionalmente considerável na China e no Japão por muitos anos. Os compostos que foram isolados de C. deserticola são glicosídeos feniletanóides (PhGs), iridóides, lignanas, ácidos graxos, alditóis, carboidratos e polissacarídeos, entre os quais PhGs é o principal ingrediente ativo.2 A farmacologia moderna mostra que os extratos de C. deserticola (como glicosídeos feniletanóides, polissacarídeos, etc.) têm uma ampla gama de funções medicinais, especialmente na melhoria da função sexual, aumento da memória, regulação imunológica, proteção hepática, atividade laxante, atividade antioxidante, etc.3-5 Além de sua valor medicinal, C. deserticola tem valor ecológico para o controle do deserto devido à sua capacidade de crescer em ambientes áridos, bem como sob condições de estresse salino-alcalino.6 No entanto, as fontes selvagens de C. deserticola foram consideradas ameaçadas nos últimos anos devido ao rápido crescimento da demanda do mercado e à superexploração. Ela foi listada como uma das plantas de classe II que precisam de proteção na China.2 Consequentemente, é urgente desenvolver efetivamente os recursos de C. deserticola e determinar o melhor ambiente para o crescimento de C. deserticola.

Partes medicinais tradicionais de plantas medicinais são amplamente utilizadas, enquanto partes não medicinais são frequentemente descartadas. Um grande número de estudos mostrou que algumas partes não medicinais, como Salvia miltiorrhiza, Paris polyphylla e Crocus sativus, têm composições químicas e efeitos farmacológicos semelhantes aos das partes medicinais. A pesquisa de partes não medicinais conduz à expansão de recursos médicos, especialmente para a proteção de plantas medicinais ameaçadas de extinção.7,8 Qiao et al. usou a tecnologia GC-MS para identificar 40 componentes voláteis na inflorescência de C. deserticola.9 Peng et al. usaram transcriptômica e metabolômica para analisar de forma abrangente os efeitos analgésicos de diferentes partes da citronela.10 Yang et al. isolaram tipos de flavonoides das partes aéreas da Salvia miltiorrhiza e estudaram sua atividade antioxidante.8 A parte medicinal da C. deserticola é um caule suculento, que faz com que um grande número de inflorescências sejam descartadas todos os anos, resultando em um grande desperdício de recursos .

Os metabólitos, como produtos finais de vários processos bioquímicos catalisados ​​por enzimas, fornecem informações moleculares úteis para a bioquímica dos organismos em um determinado momento.11 O metabolismo está intimamente relacionado à qualidade da planta. Os metabólitos primários afetam o crescimento e o desenvolvimento da planta, e os metabólitos secundários podem ajudar as plantas a resistir ao estresse ambiental.12 Portanto, a tecnologia metabolômica é amplamente utilizada na avaliação da qualidade da planta.13–15 Anteriormente, integramos o transcriptoma e o metaboloma para avaliar a qualidade dos caules suculentos de os três ecótipos de C. deserticola e explorar o mecanismo molecular de variação de qualidade.16 Descobrimos que 20 -acetilacteosídeo pode ser usado como um marcador químico para distinguir três ecótipos. Wenjing Liu e outros. com base na estratégia de metabolômica direcionada baseada em 1H NMR sem direcionamento para LC-MS, conduziu uma comparação aprofundada do grupo químico de quatro espécies suculentas de Cistanche e identificou equinacosídeo, acetonido, betaína, manitol, 6-desoxicatalpol, sacarose, e ácido epi-orgânico 8- podem ser usados ​​como marcadores químicos para distinguir quatro espécies de Cistanche.17 Pingping Zou et al. aplicou metabolômica baseada em 1 H NMR para identificar as partes superior e inferior do caule de C. deserticola e descobriu que metabólitos primários em série, especialmente carboidratos e metabólitos do ciclo do ácido tricarboxílico, são as moléculas primárias que governam a discriminação.18 HaiLi Qiao et al. ilustraram que um maior teor de ésteres e aromáticos foram encontrados nas flores, que foram significativamente aumentados em comparação com os compostos voláteis dos botões através da análise GC-MS dos componentes voláteis da inflorescência de C. deserticola. 9 Atualmente, ainda faltam pesquisas sobre a variação de qualidade entre o caule suculento e a inflorescência de C. deserticola do ponto de vista do metabolismo.

Estudos existentes usaram simulação de rede de docking molecular para explorar os alvos e mecanismos da medicina chinesa no tratamento de doenças.19–21 Jianling Liu et al. investigou as combinações de drogas eficazes com base na farmacologia do sistema entre compostos de Cistanche tubulosa. Eles examinaram preliminarmente 61 compostos e 43 alvos relacionados à neuroinflamação, dos quais o verbascosídeo e o tubulosídeo B poderiam desempenhar papéis importantes na neuroproteção.22 YingQi Li et al. farmacologia de rede integrada e modelo de peixe-zebra para investigar componentes de efeitos duplos de Cistanche tubulosa para tratamento de osteoporose e doença de Alzheimer.23 Os componentes químicos de C. deserticola são complexos e têm uma ampla gama de efeitos farmacológicos. No entanto, os mecanismos terapêuticos ainda não estão claros. É de grande importância esclarecer alvos de doenças e mecanismos para o desenvolvimento de C. deserticola.

Neste estudo, usamos metabolômica para investigar as diferenças metabólicas das inflorescências e caules suculentos dos três ecótipos (terra salina-alcalina, pastagem e terra arenosa) de C. deserticola e comparamos os ecótipos pastagem e terra arenosa com os ecótipos salino- ecótipo de terra alcalina para explorar a variação metabólica em C. deserticola que é afetada pelo estresse alcalino salino. Particularmente, identificamos e analisamos os metabólitos de seis grupos envolvidos na biossíntese de PhGs. Aplicamos o docking molecular para filtrar os potenciais compostos e alvos e desenhamos diagramas de simulação de rede, bem como análises de enriquecimento GO e KEGG. Nossas descobertas fornecem novos insights sobre as diferenças metabólicas entre a inflorescência e os caules suculentos dos três ecótipos de C. deserticola.

2. Materiais e métodos

2.1 Materiais vegetais e coleta de amostras

Coletamos as inflorescências (o sufixo do número de série da amostra é "1") e hastes suculentas (o sufixo do número de série da amostra é "2") para C. deserticola na fase de escavação (abril a maio de 2017) de três ecótipos diferentes: Lago Ebinur de Xinjiang (A1 e A2: terra salina-alcalina), Tula Village de Xinjiang (B1 e B2: pastagem) e Faixa Esquerda Alxa da Mongólia Interior (C1 e C2: terra arenosa) no noroeste da China (Tabela 1 e Fig. 1a) . Os espécimes foram depositados no herbário do Instituto de Desenvolvimento de Plantas Medicinais da Academia Chinesa de Ciências Médicas em Pequim, China. As amostras foram coletadas no campo e armazenadas em nitrogênio líquido rapidamente. Após a limpeza com PBS, os tecidos do caule suculento foram cortados em pequenos pedaços e imediatamente armazenados em freezer a 80 graus Celsius até o processamento posterior. 18 amostras (três réplicas biológicas por habitat, duas partes de tecido por amostra) foram retiradas das partes grossas da inflorescência e hastes carnudas para análise do metaboloma.

2.2 Extração e separação de metabólitos

A amostra liofilizada foi moída usando um moinho misturador (MM 400, Retsch) com um cordão de zircônia por 1,5 min a 30 Hz. 100 mg de pó foram pesados ​​e extraídos durante a noite a 4 graus com 1,0 mL de metanol aquoso a 70 por cento. Após centrifugação a 10 000 g por 10 min, os extratos foram absorvidos antes da análise por LC-MS.

O sistema LC-ESI-MS/MS (UPLC, Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30Um sistema) foi usado para analisar o extrato da amostra liofilizada. As condições analíticas foram as seguintes: coluna UPLC, Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 (1,8 mm, 2,1 mm×100 mm); solvente, água (0.04 por cento de ácido acético): acetonitrila (0.04 por cento de ácido acético); programa gradiente, 100 : 0 v/v em 0 min, 5: 95 v/v em 11,0 min, 5: 95 v/v em 12,0 min, 95: 5 v/v em 12,1 min e 95 : 5 v/v a 15,0 min; taxa de fluxo, 0,40 mL min 1; temperatura, 40 graus; e volume de injeção, 2 mL. O efluente foi conectado alternativamente a um ESI-triple quadrupole-linear ion trap (Q TRAP)-MS. Neste experimento, uma amostra de controle de qualidade foi preparada por mistura uniforme; durante a análise, as amostras de controle de qualidade foram processadas a cada 10 injeções para monitorar a estabilidade das condições de análise.24-26

As varreduras Linear Ion Trap (LIT) e triplo quadrupolo (QQQ) foram adquiridas em um espectrômetro de massa triplo quadrupolo-linear ion trap (Q TRAP), sistema API 6500 Q TRAP LC/MS/MS, equipado com um Interface ESI turbo ion-spray, operando no modo de íon positivo e controlada pelo software Analyst 1.6 (AB Sciex). Os parâmetros de operação da fonte ESI foram os seguintes: uma fonte de íons, turbo spray; temperatura da fonte 500 graus; tensão de pulverização de íons (IS) 5500 V; gás de fonte de íons I (GSI), gás II (GSII), gás de cortina (CUR) foram ajustados para 55, 60 e 25,0 psi, respectivamente; o gás de colisão (CAD) estava alto (12 psi). O ajuste do instrumento e a calibração de massa foram realizados com soluções de polipropileno glicol 10 e 100 mmol L 1 nos modos QQQ e LIT, respectivamente. Varreduras QQQ foram adquiridas como experimentos MRM com gás de colisão (nitrogênio) ajustado para 5 psi. O potencial de desagregação (DP) e a energia de colisão (CE) para transições MRM individuais foram realizados com otimização adicional. Um conjunto específico de transições MRM foi monitorado para cada período com base nos metabólitos eluídos nesse período.

2.3 Identificação e Quantificação de Metabólitos

A análise qualitativa dos dados primários e secundários de MS foi realizada por comparação dos valores de íons precursores (Q1), íons fragmentos (Q3) (janelas de isolamento (±15 Da), tempo de permanência (ms) ou tempo de ciclo (1 segundo)), tempo de retenção (RT) e padrões de fragmentação com aqueles obtidos pela injeção de padrões usando as mesmas condições se os padrões estivessem disponíveis ou conduzidos usando um banco de dados autocompilado MWDB (NetWare Biological Science and Technology Co., Ltd Wuhan, China) e disponível publicamente bancos de dados de metabólitos se os padrões não estiverem disponíveis. Sinais repetidos de K plus, Na plus, NH4 plus e outras substâncias de grande peso molecular foram eliminados durante a identificação. A análise quantitativa dos metabólitos foi baseada no modo MRM. Os íons característicos de cada metabólito foram rastreados através do espectrômetro de massa QQQ para obter as intensidades do sinal. A integração e correção dos picos cromatográficos foram realizadas usando o Multi Quant versão 3.0.2 (AB SCIEX, Concord, Ontário, Canadá). Os conteúdos metabólicos relativos correspondentes foram representados como integrais de área de pico cromatográfica.

Os valores de VIP (variável importante na projeção) de amostras de C. deserticola (três réplicas biológicas) foram calculados pelo software SIMCA-P (versão 14.1, Sartorius Stedim Biotech, Ume˚a, Suécia) com base na análise de componentes principais e mínimo parcial ortogonal análise discriminante de quadrados. Definimos Fold-change $ 2 ou #0.5 e valor VIP $ 1 como o limite para rastrear os metabólitos significativamente diferentes. Os dados metabólitos foram normalizados, a análise de mapa de calor de cluster foi realizada em todas as amostras e o script do programa R foi usado para desenhar mapas de calor de cluster.

2.4 Ancoragem molecular

2.4.1 Recolha de compostos químicos.Por meio dos resultados experimentais preliminares de nosso grupo de pesquisa e dos resultados da pesquisa na literatura, um total de 127 compostos isolados dos caules suculentos de C. deserticola foram coletados e baixados do site do Chemical Book ou usaram o ChemDraw para desenhar a estrutura molecular 2D. Além disso, encontramos 4 evita (chrysoberyl, cynaroside, hesperetin e homoeriodictyol) detectados apenas na inflorescência através de resultados de metaboloma. A estrutura 2D foi convertida em uma estrutura tridimensional com o software ChemDraw 3D e a otimização preliminar foi realizada. Em seguida, a estrutura tridimensional otimizada preliminar foi verificada pelo software Avogadro e a otimização de energia adicional foi usada para gerar o formato de arquivo composto final necessário para o encaixe molecular subsequente.

2.4.2 Coleta de Coleta de Metas.Procuramos alvos de proteínas da doença por meio da literatura e do banco de dados STITCH. Obtivemos os alvos gênicos correspondentes usando o banco de dados Uniport e recuperamos o PDB ID do haplótipo da proteína e a estrutura de pequenas moléculas por RCSB. Ao determinar a droga positiva, usamos a literatura e o site Yaodu para identificar preliminarmente 45 alvos de doenças relacionadas que foram relatadas, incluindo 10 doenças relacionadas aos caules suculentos de C. deserticola na literatura. Essas dez doenças eram aterosclerose, osteoporose, demência senil, doença de Alzheimer, Parkinson, constipação crônica, torsades de pointes, taquicardia ventricular, doença vascular, lesão miocárdica e câncer retal. Além disso, coletamos 467 alvos relacionados à inflamação e obtivemos 2 alvos importantes (6KBA e 7AWC) por triagem, que foram usados ​​para análise de docking molecular de flavinóides específicos de inflorescência.

2.4.3 Simulação de docking molecular.Para avaliar a afinidade de ligação de compostos em C. deserticola a alvos candidatos, realizamos uma simulação de docking molecular por meio do software QuickVina 2.0, um utilitário de código aberto desenvolvido pelo grupo de pesquisa Alhossary. Para verificar a afinidade de ligação entre os alvos e os compostos, calculamos uma pontuação de encaixe por meio do QuickVina 2.0. As pontuações de ancoragem que excederam as dos medicamentos positivos (dados para cada medicamento positivo podem ser obtidos dos alvos correspondentes no RCSB ou na literatura) indicaram uma forte afinidade de ligação entre os alvos candidatos e os compostos correspondentes.27–30 Nós usou PyMOL (Versão 2.0 Schr¨odinger, LLC) para plotar os resultados de acoplamento do composto e do alvo.

2.4.4 Construção de rede componente-alvo-caminho e análise da função GO/KEGGA construção da rede componente-alvo-caminho foi realizada usando o software de visualização de rede Cytoscape. Nas interações de rede, os nós representam componentes, alvos e caminhos, enquanto as arestas representam a interação entre si. Usamos o valor de pontuação do docking molecular do composto e o gene alvo como um indicador da cor da conexão. Quanto mais verde a cor, maior o valor da pontuação. Uma rede de interação proteína-proteína (PPI) associada a alvos de genes foi construída e analisada com STRING.31

Para descobrir ainda mais as funções biológicas dentro da rede construída, usamos o módulo de anotação funcional do banco de dados DAVID29 para realizar análises de Gene Ontology (GO) e enriquecimento KEGG em genes alvo.

3. Resultados

3.1 Perfis metabólicos de C. deserticola

Para obter uma visão geral das alterações metabólicas das inflorescências e caules suculentos de três ecótipos de C. deserticola, foi realizada uma análise de metaboloma amplamente direcionada usando LC-ESI-MS/MS. Conforme mostrado na Fig. 1b, as inflorescências e hastes suculentas de C. deserticola de diferentes ecótipos apresentaram diferentes separações, sendo que a separação de diferentes tecidos foi maior que a de diferentes ecótipos. E as três amostras replicadas têm pontuações de PC semelhantes, indicando que os metabólitos de C. deserticola mostraram pouca separação entre as amostras replicadas. Além disso, as amostras de controle de qualidade (mistura) agrupadas no centro do gráfico de pontuação do PCA. O diagrama de pétala (Fig. 1c) e o diagrama de cabeça para baixo (Fig. 1d) indicaram que havia 391 metabólitos comuns nos seis grupos, e o número de metabólitos detectados na inflorescência foi geralmente maior do que no caule suculento. O número de metabólitos detectados na inflorescência salino-alcalina (A1) foi o maior, com um total de 515, dos quais 18 metabólitos foram detectados apenas em A1. O número de metabólitos detectados em hastes suculentas de campo (B2) foi o menor, com um total de 458, sem seus metabólitos exclusivos.

Os conteúdos relativos de 578 metabólitos foram determinados, incluindo 35 categorias de metabólitos (ESI File S1). Os metabólitos mais abundantes das inflorescências e caules suculentos em ambos os três ecótipos foram lipídios, glicerolipídios, aminoácidos, nucleotídeos e seus derivados, glicosídeos feniletanóides (PhGs) e flavonóides (Fig. S3a,3b e c). Após a normalização, o conteúdo proporcional de cada metabólito foi determinado pela área de resposta média do pico durante UPLC-MS/MS, conforme mostrado na Fig. 1e com um mapa de calor, e foi posteriormente realizado com análise de agrupamento hierárquico. Mais metabólitos secundários apresentaram altos níveis de concentração relativa em A1 e C2 do que em outros grupos. Entre os metabólitos secundários em todos os três ecótipos, o conteúdo relativo de glicosídeos feniletanóides (PhGs) nas hastes suculentas foi maior do que nas inflorescências, enquanto o conteúdo relativo de flavonóides nas inflorescências foi maior do que nas hastes suculentas.

Nesta análise do metaboloma, foram detectados 12 principais componentes ativos de C. deserticola, incluindo 2'-acetilacteoside, acteoside, cistanoside A, coniferin, echinacoside, formononetin-7-O-glucoside, inosine, isoacteoside, ononin, pinoresinol, seringas e uridina. Um mapa de calor de agrupamento hierárquico (Fig. 1f) foi desenhado para os principais componentes ativos de C. deserticola detectados pelo metaboloma, mostrando que o conteúdo relativo dos principais componentes ativos no caule da suculenta foi maior do que na inflorescência. Em comparação com diferentes tecidos, os ingredientes ativos com teor relativamente alto na inflorescência foram 2'-acetilacteosídeo e coniferina, enquanto os ingredientes ativos com teor relativamente alto em hastes suculentas foram acteoside, cistanoside A, echinacoside e isoacteoside. Comparado com diferentes ecótipos, o conteúdo relativamente alto de ingredientes ativos na terra salina-alcalina era 2'-acetilacteosídeo, acteosídeo, coniferina, equinacosídeo e isoacteosídeo. O teor relativamente alto nas pastagens foi o echinacosídeo, e os teores relativamente altos nas terras arenosas foram o cistanósido A.

3.2 Diferença metabólica entre inflorescência e caule suculento de C. deserticola

Para entender a diferença no metabolismo entre inflorescência e caule suculento de C. deserticola em três ecótipos, examinamos os diferentes metabólitos. Observou-se alta previsibilidade (Q2) dos modelos OPLS-DA para gerar uma comparação pareada entre inflorescência versus caule suculento em terra salina-alcalina (Q2 = 0.996), pastagem (Q2 = 0.997) , e terra arenosa (Q2 = 0.997) (Fig. S1a). Os valores de Q2 e R2 foram maiores no teste de permutação do que no modelo OPLS-DA (Fig. S1b). Para identificar possíveis variáveis, definimos fold-change maior ou igual a 2 ou menor ou igual a 0,5 e valor VIP maior ou igual a 1 como o limite para rastrear os metabólitos significativamente diferentes em cada par de comparações. Os 10 principais metabólitos diferentes das três inflorescências de ecótipo e hastes suculentas foram mostrados na Tabela S1. Comparado com hastes suculentas, o conteúdo relativamente alto de metabólitos diferenciais em inflorescências foram flavonóides, como flavonol, flavona e flavona C-glicosídeos.

Em terra salina-alcalina, em comparação com as inflorescências, os caules suculentos tinham 43 metabólitos diferenciais regulados positivamente e 71 metabólitos diferenciais regulados negativamente (Fig. 2a). O mapa de calor (Fig. 2b) mostrou que o conteúdo relativo das inflorescências foi maior do que o das hastes suculentas. Comparando hastes suculentas com inflorescências, os principais metabólitos regulados positivamente foram cianidina 3-O-rutinoside (keracyanin), icariin (kaempferol 3,7-O-diglucoside 8-derivado prenyl), ácido homovanílico , éster metílico do ácido clorogênico e O-hexosídeo de rosinidina. Os principais metabólitos diferenciais regulados negativamente incluíram N', N''-di-p-cumaroilspermidina, 8-C-hexosil-luteolina O-hexosídeo, ácido cafeico, isorhamnetin O-hexoside e isorhamnetin 5- O-hexosídeo (Fig. 2c). A análise de enriquecimento da via metabólica KEGG (Fig. 2d) classificou os metabólitos diferenciais identificados na inflorescência e no caule suculento em biossíntese de flavonoides, biossíntese de flavonas e flavonoides, biossíntese de isoflavonos, biossíntese de fenilpropanoides e metabolismo de éter lipídico.

Nas pastagens, em comparação com as inflorescências, os caules suculentos tinham 35 metabólitos diferenciais regulados positivamente e 54 metabólitos diferenciais regulados negativamente (Fig. 2a). O mapa de calor (Fig. 2b) mostrou que o conteúdo relativo das inflorescências foi maior do que o das hastes suculentas. Comparando hastes suculentas com inflorescências, os principais metabólitos regulados positivamente foram l-( mais )-arginina, ácido adípico, N-metilnicotinamida, 4-ácido hidroxibenzóico e diidromiricetina. Os principais metabólitos diferenciais regulados negativamente incluíram rosinidin O-hexoside, ácido cafeico, isorhamnetin O-hexoside, vendendo 5-O-hexoside e isorhamnetin 5-O-hexoside (Fig. 2c). A análise de enriquecimento da via metabólica KEGG (Fig. 2d) classificou os metabólitos diferenciais identificados na inflorescência e no caule suculento em biossíntese de flavonoides, biossíntese de flavonas e flavonoides, biossíntese de diterpenoides, biossíntese de isoflavonoides e arrastamento circadiano.

Em terra arenosa, em comparação com as inflorescências, os caules suculentos tinham 40 metabólitos diferenciais regulados positivamente e 87 metabólitos diferenciais regulados negativamente (Fig. 2a). O mapa de calor (Fig. 2b) mostrou que o conteúdo relativo das inflorescências foi maior do que o das hastes suculentas. Comparando hastes suculentas com inflorescências, os principais metabólitos regulados positivamente foram O-feruloil 4-hidroxilcumarina, seringa, rosinidina O-hexosídeo, ácido 3-(4-hidroxifenil) propiônico e ácido homovanílico. Os principais metabólitos diferenciais regulados negativamente incluíam ácido crisoeriol O-ramnosil-O-glucurônico, C-hexosil-apigenina O-cafeoilhexosídeo, O-malonilhexosídeo, isorhamnetin O-hexosídeo e 8-C-hexosil-luteolina O- hexósido (Fig. 2c). A análise de enriquecimento da via metabólica KEGG (Fig. 2d) classificou os metabólitos diferenciais identificados na inflorescência e no caule suculento em biossíntese de flavona e flavonol, biossíntese de flavonoide, biossíntese de isoflavonoide, biossíntese de diterpenoide e degradação de compostos aromáticos.

3.3 Diferenças metabólicas relacionadas ao estresse salino-alcalino em três ecótipos de C. deserticola

Para compreender as características metabólicas únicas dos três ecótipos da terra salina-alcalina de C. deserticola, examinamos os diferentes metabólitos em terra salina-alcalina versus pastagem e terra arenosa versus terra salino-alcalina. Observou-se alta previsibilidade (Q2) dos modelos OPLS-DA para gerar uma comparação pareada entre terra salina-alcalina versus pastagem de inflorescência (Q2 = 0.997) e caule suculento (Q2 = 0.991) . Enquanto isso, alta previsibilidade (Q2) dos modelos OPLS-DA entre terra arenosa versus terra salino-alcalina de inflorescência (Q2 = 0.988) e caule suculento (Q2 = 0.995). Os valores de Q2 e R2 foram maiores no teste de permutação do que no modelo OPLS-DA (Fig. S2†). Para identificar possíveis variáveis, definimos fold-change maior ou igual a 2 ou menor ou igual a 0,5 e valor VIP maior ou igual a 1 como o limite para rastrear os metabólitos significativamente diferentes em cada par de comparações. A Tabela 2 mostrou os diferentes metabólitos de inflorescências e caules suculentos relacionados ao estresse salino-alcalino (terra salino-alcalina vs. pastagem e terra arenosa vs. terra salino-alcalina), classificados por categoria de metabólitos, e demonstrou que a classe de metabólitos mais foi flavonoide . Entre eles, o conteúdo relativo de antocianinas, flavonóides, flavonol, flavanona, catequina e seus derivados e isoflavonas são os mais altos em terras salino-alcalinas. Além disso, o mapa de calor (Fig. 3d) mostrou que os grupos com maior conteúdo relativo de metabólitos diferenciais de flavonóides foram A1 e C1. O teor relativo de antocianinas foi maior no grupo A2, e o teor relativo de flavonoides e flavonóis foi maior no grupo A1.

Os mapas vulcânicos (Fig. 3a) mostraram que o número de metabolismo diferencial regulado positivamente em solos salino-alcalinos é maior do que em pastagens e solos arenosos, seja em inflorescências ou caules suculentos. Os 20 principais metabólitos diferenciais de cada comparação foram mostrados na Fig. 3b. Em terra salina-alcalina vs. pastagens, as vias KEGG de metabólitos diferenciais de inflorescência foram enriquecidas principalmente na biossíntese de flavonóides, flavonol e biossíntese de flavonóis, biossíntese de diterpenóides, biossíntese de isoflavonóides e biossíntese de fenilpropanoides. Além disso, as vias KEGG dos diferentes metabólitos do caule suculento foram enriquecidas principalmente na sinapse dopaminérgica, metabolismo da purina, biossíntese de flavonoides, metabolismo da pirimidina e arrastamento circadiano. Em terreno salino-alcalino vs. pastagem, as vias KEGG de metabólitos diferenciais de inflorescência foram enriquecidas principalmente na biossíntese de isoflavonoides, biossíntese de metabólitos secundários, biossíntese de flavona e flavonol, agentes antineoplásicos de produtos naturais e asma. Além disso, as vias KEGG dos diferentes metabólitos do caule suculento foram enriquecidas principalmente na biossíntese de aminoacil-tRNA, digestão e absorção de proteínas, metabolismo central do carbono no câncer, biossíntese de aminoácidos e biossíntese de fenilpropanóides (Fig. 3c).

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