AbstratoAs atividades antiinflamatórias da pele dos extratos de pétalas de rosa foram descritas em nosso estudo anterior. Como a inflamação da pele está intimamente ligada ao envelhecimento da pele, nosso estudo investigou os efeitos das pétalas de rosa gallica nas atividades relacionadas ao envelhecimento da pele, como clareamento da pele e propriedades anti-rugas. Cada amostra foi preparada via extração usando diferentes proporções de etanol para avaliar as condições de extração ideais para aplicações industriais. O extrato aquoso de EtOH a 50% (v/v) da pétala de R. gallica suprimiu significativamente a atividade da tirosinase, a produção de melanina e a metaloproteinase da matriz induzida por UV solar-1, uma marca registrada da formação de rugas. Além disso, o extrato aquoso de EtOH a 50% (v/v) apresentou o maior efeito antioxidante e o maior teor de flavonoides, consistente com os efeitos antienvelhecimento relatados. No geral, nossas descobertas sugerem que os extratos de pétalas de R. gallica exibem efeitos antienvelhecimento. Além disso, a extração de 50% com EtOH, em particular, foi ideal para os mais altos efeitos antienvelhecimento e antioxidantes, bem como para obter o maior teor de flavonoides.

De acordo com estudos relevantes, a cistanche é uma erva comum conhecida como "a erva milagrosa que prolonga a vida". Seu principal componente é o cistanósido, que possui diversos efeitos como antioxidante, anti-inflamatório e promotor da função imunológica. O mecanismo entre cistanche e clareamento da pele reside no efeito antioxidante dos glicosídeos cistanche. A melanina na pele humana é produzida pela oxidação da tirosina catalisada pela tirosinase, e a reação de oxidação requer a participação do oxigênio, de modo que os radicais livres de oxigênio no corpo se tornam um fator importante que afeta a produção de melanina. Cistanche contém cistanósido, que é um antioxidante e pode reduzir a geração de radicais livres no corpo, inibindo assim a produção de melanina.

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Palavras-chaveRosa gallica Envelhecimento cutâneo Flavonóide Efeito antioxidante

Introdução

A pele desempenha um papel vital como barreira protetora contra fatores nocivos associados à hereditariedade e genética, questões ambientais, alterações hormonais e processos metabólicos (Mukherjee et al., 2006). Entre eles, os fatores ambientais, como a exposição à radiação solar ultravioleta (UV), atuam como mediadores importantes que contribuem para o envelhecimento prematuro (Laga e Murphy, 2009). Os principais sintomas do envelhecimento da pele, que ocorre como resultado do fotoenvelhecimento, incluem rugas profundas, pigmentação anormal e elasticidade (Farage et al., 2013; Wlaschek et al., 2001).

A pigmentação é um sintoma do envelhecimento, causado pela produção anormal de melanina, resultando em uma variedade de distúrbios da pele, incluindo sardas, melasma, manchas senis e outras síndromes de hiperpigmentação (D'Mello et al., 2016; Seo et al., 2003). Na via da melanogênese, a tirosinase é importante como enzima limitante da taxa que converte L-tirosina em L-DOPA e oxida L-DOPA para formar DOPA-quinona (Akhtar et al., 2015). Portanto, a inibição da tirosinase está fortemente associada à síntese de melanina. Além disso, a formação de rugas, causada pela perda de fibrilas de colágeno e elastase, é outra característica do fotoenvelhecimento. A metaloproteinase de matriz-1 (MMP-1), secretada por fibroblastos da pele humana, é a principal responsável pela degradação do colágeno durante o processo de fotoenvelhecimento (Pandel et al., 2013). A regulação negativa da expressão de MMP-1, que inibe a degradação do colágeno, pode melhorar as funções de melhoria das rugas.

Pelas razões acima expostas, o uso de inibidores de tirosinase ou inibidores de MMP é considerado uma estratégia promissora para o alívio do fotoenvelhecimento da pele. Estudos anteriores indicaram que retinol, extrato de alho (ácido de cafeína e cisteína S-aliada) e fitoceramida, ácido kójico, arbutina e vitamina C podem atuar como inibidores do envelhecimento da pele (Couteau e Coiffard, 2016; Kim et al., 2013) . No entanto, o uso dessas substâncias envolve certas limitações, como vários efeitos colaterais, incluindo citotoxicidade, odor e coloração (Yamakoshi et al., 2003). Portanto, os estudos atuais estão focados no desenvolvimento de componentes de origem natural mais seguros que conferem fotoproteção eficaz à pele.

As espécies Rosa, cultivadas em todo o mundo, são consideradas uma boa fonte de suplementos dietéticos. Foi relatado que o extrato de pétala de rosa (RPE), que contém elementos como ácido fenólico, flavonóis e antocianinas, exibe muitos efeitos benéficos, como atividades antiinflamatórias da pele, além de outras funções biológicas (Bitis et al., 2 017; Lee et al., 2018; Masek et al., 2017; Navarro-Gonzalez et al., 2015). Como essas propriedades do RPE são conhecidas por estarem relacionadas ao envelhecimento da pele, ele foi proposto como um potencial candidato para proteção da pele. No entanto, pouco se sabe sobre o efeito do RPE no envelhecimento da pele. Além disso, água e etanol são considerados os melhores solventes de extração devido às diferenças de polaridade e segurança de uso (Abarca-Vargas et al., 2016). Assim, amostras com diferentes proporções de água e etanol (0, 10, 30, 50, 70, 90 e 100% etanol RPE) foram preparadas via extração.

O objetivo deste estudo foi investigar o efeito do RPE no clareamento da pele e na melhora das rugas. Extratos de RPE com diferentes proporções de solvente de extração (0, 10, 30, 50, 70, 90 e 100 por cento etanol/água) foram testados para determinar a proporção ideal de solvente para extração.

Materiais e métodos

Reagente

As pétalas de Rosa gallica foram importadas da Turquia através da GN Bio (Gyeonggi, Coréia). O meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), soro fetal bovino (FBS), penicilina-estreptomicina-neomicina e 0,5% tripsina-EDTA foram adquiridos da GIBCO Invitrogen (Auckland, NZ, EUA). Anticorpos específicos contra tirosinase e b-actina foram adquiridos da Santa Cruz Biotech (Santa Cruz, CA, EUA). O anticorpo primário de MMP-1 foi obtido de sistemas de P&D. Todos os outros produtos químicos, incluindo hormônio estimulante de alfa-melanócito (a-MSH), tirosinase de cogumelo e L-DOPA (L-3,4-diidroxifenilalanina) foram adquiridos da Sigma-Aldrich Co., LLC (St . Louis, MO, EUA).

Preparação de amostra

Pétalas de rosa foram misturadas com 100 mL de 0, 10, 30, 50, 70, 90 e 100% (v/v) de EtOH (etanol absoluto). Os componentes solúveis foram então extraídos em água a 80 graus usando um condensador de refluxo. O extrato foi filtrado em papel filtro número 2 (Whatman, Maidstone, Inglaterra), concentrado a vácuo e, posteriormente, dissolvido em água destilada e liofilizado, para serem utilizados como amostras para o teste de análise funcional.

Cultura de células

As células de melanoma B16F10 foram adquiridas no Korean Cell Line Bank (Seul, Coréia). Células de fibroblastos dérmicos humanos (HDF) foram obtidas do Dr. Jin Ho Chung (Faculdade de Medicina, Universidade Nacional de Seul, Seul, Coréia). Ambas as células foram cultivadas em DMEM suplementado com 10 por cento de soro bovino fetal (v/v) e 1 por cento (v/v) de penicilina sob condições de 37 graus e 5 por cento de CO2.

Viabilidade celular

A viabilidade celular foi medida via MTS [3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-({{7 }}sulfofenil)-2H-tetrazólio]ensaio. As células foram semeadas em 96-placas de poço e cultivadas até a confluência. Em seguida, as células foram privadas de DMEM sem soro durante a noite e tratadas com as amostras nas concentrações indicadas por 24 h. Após a exposição às amostras, 20 l de solução de MTS foram deixados reagir com as células por 1 h. A absorbância foi medida usando um leitor de microplacas (Sunrise-Basic Tecan, Tecan Austria GmbH Gro¨dig, Áustria) a 570 nm.

Atividade da tirosinase de cogumelo in vitro

O ensaio de tirosinase in vitro foi realizado de acordo com os métodos descritos anteriormente (Kim et al., 2015). Resumidamente, 40 lL de cada amostra foram adicionados ao tampão de ensaio (20 lL de fosfato de potássio 0,1 M), seguido de incubação por 30 min com 20 l de tirosinase de cogumelo (0,02 mg/mL). Em seguida, foram adicionados 40 L de substrato (L-DOPA) a cada mistura. A reação foi deixada prosseguir à temperatura ambiente por 15 min antes da formação de dopacromo ser analisada medindo a absorbância a 475 nm usando um leitor de microplacas (Infinite 2000 PRO, Tecan, Suíça).

Avaliação da produção de melanina

O ensaio de produção de melanina foi realizado de acordo com o protocolo previamente descrito (Friedmann e Gilchrest, 1987; Gordon et al., 1989). Células B16F10 (8 9 103 células) foram semeadas em 6-placas de poços com 2 mL de meio de cultura. Após 24 h, as amostras foram pré-tratadas com as células por 1 h, após o que a-MSH (100 nM) foi exposto às células. As células foram coletadas após 72 h e a produção de melanina foi medida usando um leitor de microplacas (Infinite 2000 PRO, Tecan, Suíça) a 495 nm.

Faroeste blot

As amostras de proteína foram obtidas de células, usando 19 Cell Lysis Buffer (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). A concentração de proteína foi estimada usando um Kit de Ensaio de Proteína PierceTM BCA (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, EUA). As amostras de proteína foram carregadas em um gel de SDS-poliacrilamida a 10 por cento (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Califórnia, EUA) para eletroforese e depois transferidas para uma membrana Immobilon P (Millipore, Billerica, MA, EUA). A membrana PVDF foi bloqueada com 5 por cento de leite sem gordura por 1 h e a membrana foi tratada com anticorpo primário específico durante a noite a 4 graus. Bandas de proteínas foram detectadas usando um kit de detecção de quimioluminescência (GE Healthcare, NJ, EUA) após hibridação com um anticorpo secundário conjugado com HRP (Cell Signaling).

Ensaio de eliminação de radicais DPPH

A atividade de eliminação do radical DPPH foi medida como se segue; {{0}},2 mL cada de extrato foi adicionado a 3 mL de -etanol, ao qual foram adicionados 0,8 mL de 400 lM DPPH dissolvido em etanol. Essa mistura foi agitada por 10 s e mantida em temperatura ambiente por 10 min, e a absorbância foi medida em 517 nm (Wang et al., 1999). A atividade de eliminação do radical DPPH foi expressa como uma porcentagem da absorbância do grupo ao qual nenhum DPPH foi adicionado. Todos os experimentos foram repetidos no mínimo 3 vezes.

Teor total de flavonoides

O conteúdo total de flavonóides nos extratos foi medido usando o método de cloreto de alumínio (Jia et al., 1999) que foi modificado usando catequina. A 100 lL do extrato foram adicionados 500 lL de água destilada e 30 lL de NaNO2, seguido de 60 lL de AlCl3 6 minutos depois. Após 5 min, 200 l de NaOH 1 M foram adicionados e completados para 1 mL com água destilada. A solução foi bem misturada e centrifugada a 15.928g, a 4 graus, por 5 min. Após a centrifugação, foram obtidos 200 lL do sobrenadante e a absorbância foi medida usando um leitor de microplacas (Infinite 2000 PRO; Tecan, Suíça) a 510 nm.

Análise estatística

Os experimentos foram conduzidos em triplicata e os dados são expressos como média ± desvio padrão (DP). Os testes t de Student foram usados ​​para comparações estatísticas simples. A significância estatística foi definida em (#) {{0}} p\ 0.05 e (##)=p\ 0.001 para comparação com o controle não tratado; (*)=p\ 0,05 e (**)=p \0,001 para comparação com o grupo tratado com a-MSH.

Resultados e discussão

Extração das pétalas de Rosa gallica de acordo com diferentes proporções de solvente

Anteriormente, o RPE era produzido por meio de extração aquosa de EtOH a 70% (v/v) (Lee et al., 2018). No entanto, se o RPE for destinado a fins de aplicação industrial, as condições de extração devem ser ótimas. A fim de investigar as condições ideais de extração de RPE para atividade anti-envelhecimento da pele, vários solventes foram usados ​​para RPE (Fig. 1A). Curiosamente, a cor de cada extrato variou, com base na observação visual (Fig. 1B). A cor dos extratos de EtOH, 90% ou mais, era clara, enquanto o extrato de EtOH de 50% (v/v) parecia ser o mais avermelhado. O resultado do colorímetro revelou um valor a* de vermelhidão para EtOH 50 por cento, que apresentou o maior nível entre os extratos (Fig. 1C).

Efeito dos extratos de pétalas de rosa na atividade de clareamento da pele

Como a tirosinase é uma enzima chave envolvida na hiperpigmentação via produção de melanina (Chang, 2009), analisamos o efeito inibitório dos extratos na atividade da tirosinase in vitro. A maioria dos extratos, exceto 100% de EtOH, revelou regressão dose-dependente na atividade da tirosinase in vitro (Fig. 2A). Além disso, os extratos de EtOH a 30% e 50% mostraram efeitos inibitórios mais fortes do que o ácido ascórbico. O ácido ascórbico foi descrito como um agente de clareamento da pele na literatura anterior (Chang, 2009). Para avaliar a atividade de clareamento da pele dos extratos em um modelo celular, a produção de melanina foi avaliada em células de melanoma B16F10 após o tratamento com cada extrato. Uma porção de 100 nM de a-MSH aumentou a produção de melanina e cada extrato de pétala de rosa inibiu a produção de melanina (Fig. 2B). Além disso, os extratos de EtOH a 30% e 50% mostraram o efeito inibitório mais forte na atividade da tirosinase e na produção de melanina in vitro, respectivamente. Sob condições semelhantes, foi examinado o efeito de cada um dos extratos na expressão da tirosinase. Além disso, a-MSH aumentou a expressão da tirosinase e 100 lg/mL cada um dos extratos atenuou a expressão da tirosinase (Fig. 2C). O tratamento com extratos a 100 lg/mL não causou citotoxicidade celular em células de melanoma B16F10 (Fig. 2D). Assim, a inibição da melanina pelo EPR é atribuída à dupla função da atividade da tirosinase e à ausência de citotoxicidade da expressão.

Efeito do RPE na expressão de MMP-1 induzida por UV solar (sUV) em fibroblastos dérmicos humanos

Os inibidores de MMP-1 podem ser considerados agentes antirrugas (Park et al., 2018; Yang et al., 2018). Isso ocorre porque a MMP-1 é uma enzima chave, responsável pela formação de rugas durante o processo de envelhecimento da pele (Pittayapruek et al., 2016). Para determinar os efeitos anti-rugas do RPE, a expressão de MMP-1 foi avaliada em fibroblastos dérmicos humanos usando análise de Western blot. A expressão de MMP-1 foi dramaticamente aumentada pela irradiação sUV (30 kJ/cm2), e todos os extratos inibiram a expressão de MMP-1 induzida por sUV (Fig. 3A). Enquanto os extratos de 100% de EtOH exibiram efeito moderado, os extratos de 50% de EtOH exibiram a atividade de supressão mais forte na expressão de MMP-1 induzida por sUV. Em seguida, investigamos os níveis de produção de MMP-1 em meios de cultura, porque MMP-1 é uma proteína secretada para a degradação do colágeno. Semelhante ao mostrado na Fig. 3A, o nível de MMP-1 no meio de cultura foi suprimido por cada extrato (Fig. 3B). Em particular, o extrato de EtOH a 50 por cento mostrou a maior atividade supressiva na expressão de MMP -1 induzida por sUV, e o extrato de EtOH a 100 por cento exibiu um efeito moderado em comparação com outros extratos.

Atividade antioxidante e conteúdo total de flavonoides dos extratos de pétalas de rosa

Antioxidantes que inibem a produção de ROS são conhecidos por reduzir a hiperpigmentação ou prevenir a produção de melanina induzida por UV (Yamakoshi et al., 2003). A atividade sequestradora do radical DPPH foi determinada para comparar a atividade antioxidante dos extratos. Curiosamente, todos os extratos mostraram atividade de eliminação de radicais drástica, dependente da dose. As amostras de 500 lg/mL mostraram atividade antioxidante semelhante à vitamina C. Entre os extratos, o extrato EtOH a 50 por cento apresentou o efeito antioxidante mais forte na concentração mais baixa (50 lg/mL) (Fig. 4A).

Existem muitos compostos diferentes, como terpenos, flavonóides e antocianinas em pétalas de rosa (Knapp et al., 1998; Kumar et al., 2008; Oka et al., 1998; Schieber et al., 2005). Esses produtos químicos representam muitas atividades biológicas (Kumar et al., 2009). Em particular, os flavonoides têm sido descritos como o principal grupo de compostos fenólicos responsáveis ​​por propriedades biológicas de efeitos antioxidantes e anti-inflamatórios (Du et al., 2016; Jung et al., 2015). Em seguida, foi medido o conteúdo total de flavonoides de cada extrato. Grandes quantidades de flavonóides estavam presentes em cada extrato (Fig. 4B). Os resultados indicaram que o extrato de EtOH a 50 por cento continha o maior teor de flavonoides entre as amostras. Esta tendência foi semelhante à observada no resultado do ensaio anti-oxidativo.

Supõe-se que a cor vermelha escura do solvente EtOH a 50% das pétalas de rosa esteja relacionada à antocianina, um flavonoide (Fig. 1). Este resultado corrobora os achados de um estudo anterior (Oancea et al., 2012). De acordo com o estudo anterior, as antocianinas no mirtilo (Vaccinium orymbosum L.) foram melhor extraídas em 50 por cento de solvente EtOH do que em qualquer outro solvente, incluindo 60 por cento, 70 por cento e 80 por cento de EtOH (Oancea et al., 2012). Naturalmente, as antocianinas ocorrem como glicosídeos. Assim, presumimos que a polaridade das antocianinas pode ter sido concedida pelo solvente EtOH a 50%. A forte atividade antioxidante das antocianinas é bem demonstrada em vários sistemas modelo (Kalt et al., 2003; RiceEvans et al., 1995). Como o extrato de pétala de rosa com EtOH a 50% tinha o maior teor de antocianina, a atividade antioxidante do extrato de EtOH a 50% foi a mais forte entre os extratos de 50 lg/mL.

Em resumo, nosso estudo demonstrou o potencial do RPE como ingrediente antienvelhecimento da pele. Para fins de aplicação industrial, a otimização das condições de extração é essencial para reduzir os custos de produção. O presente estudo investigou os solventes mais adequados para extração de pétalas de rosa, com referência à atividade antienvelhecimento da pele. Os flavonóides nas pétalas de rosa foram extraídos melhor pelo solvente EtOH a 50%. Este extrato mostrou a atividade antioxidante mais forte, bem como atividade anti-envelhecimento da pele, como clareamento da pele e atividade de supressão de rugas. Estudos clínicos e análises de estabilidade podem ser necessários para testar sua adequação para aplicação industrial.

ReconhecimentosEsta pesquisa foi apoiada pelo Programa Principal de Pesquisa (E0183112-02) do Korea Research Food Institute (KFRI), financiado pelo Ministério da Ciência, TIC e Planejamento Futuro e pelo Instituto Coreano de Planejamento e Avaliação de Tecnologia em Alimentos, Agricultura , Florestas e Pescas (IPET) através do Programa de Desenvolvimento de Tecnologias Alimentares de Alto Valor Acrescentado, financiado pelo Ministério da Agricultura, Alimentação e Assuntos Rurais (MAFRA) (118060-03-2- HD020).

Conformidade com os padrões éticos

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