Lactobacillus Plantarum GKM3 Promove Longevidade, Retenção de Memória e Reduz o Estresse de Oxidação Cerebral em Camundongos SAMP8 Parte 1

Abstrato: (1) Antecedentes: Um declínio cognitivo relacionado à idade é comumente afetando a vida dos idosos com sintomas envolvidos em prejuízos progressivos para a memória e aprendizagem. Foi proposto que os probióticos poderiam modular os distúrbios neurológicos relacionados à idade por meio do eixo intestino-cérebro. (2) Métodos: Para investigar o efeito antienvelhecimento do probiótico Lactobacillus plantarum GKM3, foram realizados testes de sobrevivência e experimentos cognitivos no modelo de camundongos SAMP8. Os SAMP8 de seis meses (n{{10}} em cada sexo) foram alimentados com probiótico GKM3 na dosagem de 5,1 × 109 e 1,0 × 109 ufc/kg PC/dia até sua morte natural. Em seguida, o tempo de vida foi investigado. SAMP8 de três meses (n=10 em cada sexo) foi administrado com GKM3 por 14 semanas. Em seguida, foram registrados os testes de comportamento e os parâmetros de oxidação. (3) Resultados: os grupos GKM3 apresentaram latência significativamente aumentada no teste de esquiva passiva e tempo de esquiva bem-sucedida no teste de esquiva ativa. O TBARS e 8-OHdG de cérebros de camundongos também mostraram uma redução significativa nos grupos tratados com GKM3. Além disso, menor acúmulo de proteína amilóide foi encontrado em cérebros de camundongos SAMP8 com o suplemento de GKM3. (4) Conclusões: Esses resultados indicaram que L. plantarum GKM3 atrasou o processo de envelhecimento, aliviou o comprometimento cognitivo relacionado à idade e reduziu o estresse oxidativo.

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Palavras-chave: propensão 8 de camundongo acelerada à senescência (SAMP8); probióticos; 8-hidroxi-20 -desoxiguanosina (8-OHdG); substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS); amiloide- (A); envelhecimento

1. Introdução

Tem sido um problema que o comprometimento cognitivo sofrido pela população tem se tornado maior após o crescimento da quantidade de indivíduos mais velhos na última década [1]. De acordo com o relatório da Organização Mundial da Saúde (OMS), o número de pessoas com declínio cognitivo, que era de mais de 46,8 milhões em 2015, chegará a mais de 74,7 milhões em 2030, quase pela metade em quinze anos [2] . O envelhecimento, reconhecido como uma forte correlação com o comprometimento cognitivo, é geralmente associado ao estresse oxidativo, que está envolvido no acúmulo de radicais livres e promoveu muitas disfunções fisiológicas, especialmente no cérebro, um órgão sensível ao oxigênio, levando a doenças degenerativas. sintomas como perda de memória e declínio da capacidade de aprendizagem [3-5].

Como o envelhecimento é inevitável e seus sintomas negativos relativos são complicados, as pessoas buscam tratamentos antienvelhecimento, variando de terapias dietéticas a mais do que tratamentos medicamentosos [6,7]. Por exemplo, o extrato de raiz de ginseng (Panax quinquefolius) demonstrou melhorar a função cognitiva e foi marcado como favorito pelos coreanos [8]. O extrato de Ginkgo biloba, outro exemplo, foi amado pelos japoneses por suas funções no aprimoramento cognitivo e na redução da oxidação [9]. Embora muitos relatórios tenham sugerido que dietas à base de plantas fornecem efeitos antioxidantes e retardam o processo de envelhecimento, há focos mais interessantes na microbiota intestinal ou mesmo em um grupo de bactérias específicas no intestino que podem metabolizar esses nutracêuticos e fornecer multimodulação positiva efeitos para o hospedeiro, incluindo longevidade [10-14]. As bactérias intestinais podem produzir ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs), como acetato, propionato ou butirato da dieta [15]. As crianças que consumiram nutrição enteral à base de plantas apresentaram SCFAs mais elevados do que as crianças normais em suas amostras de fezes [16]. Esses SCFAs podem desempenhar um papel importante no epitélio gastrointestinal humano [17]. O acetato pode atravessar a barreira hematoencefálica, induzindo ativação hipotálamo-neuronal [18]. Além disso, o butirato foi estudado em relação ao efeito de suprimir a inflamação colônica no intestino humano [19]. Portanto, importa que tipo de microbiota ou bactéria específica está no intestino humano, especialmente em termos de influência na saúde e longevidade do corpo [20,21].

A microbiota intestinal também pode afetar o eixo intestino-cérebro e retardar o processo de envelhecimento, impedindo assim o progresso de doenças relacionadas à idade, como amnésia, demência ou até mesmo a doença de Alzheimer [22,23]. O neurotransmissor ácido gama-aminobutírico (GABA), por exemplo, pode ser produzido por certas cepas de bactérias que foram relatadas com a proliferação de células-tronco epiteliais no intestino e a melhora do comportamento do tipo depressivo em camundongos [24,25]. Com dados de suporte atuais, a adição de probióticos como método de prevenção tem sido uma tendência para esses distúrbios neurológicos relacionados à idade [26,27].

Lactobacillus é o probiótico mais comum que mostrou uma grande possibilidade de desenvolver alimentos funcionais, já que existe na alimentação humana há muito tempo [28]. No entanto, espécies bacterianas individuais têm bioatividades únicas, de cepa para cepa, que requerem confirmação experimental. Em nossos estudos anteriores, isolamos a cepa probiótica Lactobacillus plantarum GKM3 da folha em conserva (Brassica juncea), também conhecida como vegetal da longevidade na sociedade hakka taiwanesa, e realizamos estudos funcionais para aumentar o trato gastrointestinal e a imunidade in vivo [29–31] . Portanto, esperávamos a probabilidade de L. plantarum GKM3 aliviar o processo de envelhecimento e o comprometimento cognitivo relacionado à idade.

2. Materiais e métodos

2.1. assuntos

L. plantarum GKM3 foi isolado da mostarda chinesa (Brassica juncea) e preservado no Bioresource Collection and Research Center, Taiwan (BCRC), com o número de coleção 910787. Primeiramente, o GKM3 foi cultivado em caldo MRS (BD Co., Franklin Lakes, NJ, EUA) a 37 ◦C por 18 horas no tubo de ensaio. Com {0}}.01% de inoculação, a cultura de sementes GKM3 foi ampliada em um fermentador de 50 L sob pH 6.0 controle em 37 ◦C por 18 h com um meio projetado (5 por cento de glicose, 2 por cento de extrato de levedura, 0,05 por cento de MgSO4, 0,1 por cento de K2HPO4 e 0,1 por cento de Tween 80). Em seguida, as bactérias fermentadas foram colhidas por centrifugação a 3800 rpm por 10 min, lavadas com tampão fosfato salino duas vezes e o pellet foi misturado com 10% de leite para liofilização. As dosagens de pó liofilizado de L. plantarum GKM3 neste estudo foram ajustadas para 5,1 × 109 cfu/kg PC/dia como dose alta e 1,0 × 109 cfu/kg PC/dia como dose baixa para o modelo de camundongo por gavagem .

Os camundongos propensos à senescência acelerada P8 (SAMP8) foram introduzidos neste estudo como um modelo animal de envelhecimento. Todos os camundongos SAMP8 foram aplicados e mantidos em ciclo claro/escuro de 12 horas sob 25 ± 2 ◦C, 65 ± 5 por cento UR com comida e água ad libitum. Os seguintes procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Manejo Animal do Departamento de Alimentos e Nutrição da Universidade de Providence (Taichung City, Taiwan), com o número IACUC 20170629-A02.

2.2. Teste de Sobrevivência

No teste de sobrevivência, camundongos SAMP8 de seis meses de idade foram agrupados com 20 fêmeas e 20 machos da seguinte forma: controle, grupo de alta dose de GKM3 e grupo de baixa dose de GKM3. O probiótico L. plantarum GKM3 foi fornecido diariamente aos camundongos do tratamento até que eles atingissem sua morte natural. Os camundongos SAMP8 vivos/mortos em cada grupo foram registrados e os tempos de vida médios foram calculados.

2.3. Projeto de Experimento para Comprometimento Cognitivo Relacionado à Idade

Camundongos SAMP8 de três meses de idade foram alojados para o experimento de comprometimento cognitivo. Camundongos SAMP8 machos e fêmeas foram agrupados da seguinte forma (n=10 em cada gênero): grupo de controle, grupo de alta dose de GKM3 e grupo de baixa dose de GKM3. Os camundongos nos grupos de tratamento receberam oralmente L. plantarum GKM3 por 14 semanas. A atividade de locomoção foi realizada na 11ª semana do experimento. O teste de esquiva passiva e o teste de esquiva ativa foram conduzidos respectivamente na 13ª e 14ª semana, e então os camundongos foram sacrificados para análise bioquímica e exame histológico.

2.4. Atividade de locomoção

Cada camundongo foi colocado no centro de uma gaiola de transporte (25 cm × 25 cm × 25 cm, Coulbourn Instruments Modelo E61-21, Lehigh, PA, EUA) e suas locomoções foram registradas por um analisador de caminho de vídeo monitor de atividade por 10 min. O tempo médio de movimento do camundongo foi analisado a cada 5 min (s/5 min). Esta procissão foi conduzida sob condições de pouca luz e silêncio.

2.5. Teste de Evitação Passiva

Uma gaiola de transporte (35 cm × 17 cm × 20 cm, Coulbourn Instruments Modelo E10-15, Lehigh, PA) foi dividida em uma sala escura e clara. Havia uma porta guilhotina (7,5 cm × 6,5 cm, Coulbourn Instruments Modelo E10-15GD, Lehigh, PA, EUA) entre as duas salas. No teste de treinamento para o teste de evitação passiva, um camundongo foi colocado na sala de luz para uma adaptação minuciosa e, em seguida, a porta da guilhotina foi aberta. O camundongo receberia 00,5 µA de choque elétrico por 0,5 s quando entrasse na sala escura. O choque ocorreu continuamente três vezes a cada cinco segundos. O camundongo foi substituído sob a mesma operação em 24 h, 48 h e 72 h após a sessão de treinamento para o teste de memória, exceto que nenhum choque foi aplicado. Foram medidos os tempos médios de permanência dos camundongos na sala de luz. Foi definido um tempo de corte superior de 180 s.

2.6. Teste de Evitação Ativa

No teste de treinamento para o teste de esquiva ativa, o camundongo receberia um estímulo condicionado (CS) de 10 s baseado em luz e som e, em seguida, 5 s de choque elétrico de 0,3 mA (estímulo incondicional, UCS) se o camundongo permaneceu na mesma sala, ao passo que não houve recepção de choque se o camundongo se mudou para a outra sala. Cada camundongo treinou por 5 ciclos de CS e UCS. O camundongo foi testado sob a mesma operação (sistema CS/UCS) com intervalos entre as tentativas de 15 a 20 minutos quatro vezes ao dia e testado continuamente por quatro dias. O tempo médio de evitação foi medido como o efeito da memória de aprendizagem.

2.7. Análise de Estresse Oxidativo

Para a detecção de 8-hidroxi-20 -desoxiguanosina (8-OHdG) do DNA mitocondrial do cérebro, 30 mg de tecido cerebral foram extraídos pelo Sistema Miniprep de Extração Genômica de DNA de Sangue e Tecidos (Viogene Biotek Corp., Taipei, Taiwan) e o kit altamente sensível 8-OHdG Check ELISA (Nikken SEIL Co. Ltd., Shizuoka, Japão) foi aplicado com uma absorbância a 450 nm. Para a análise de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), 25 mg de tecido cerebral foram triturados com 250 µL de tampão RIPA e centrifugados a 16,000× g por 10 min a 4 ◦C. No total, 100 µL de sobrenadante foram coletados e adicionados com 100 µL de solução SDS e 4 mL de reagente de cor, depois fervidos por uma hora antes do tratamento de resfriamento. As amostras tratadas foram centrifugadas a 16,000× g por 10 min e colocadas por 30 min em temperatura ambiente. O conteúdo de TBARS (mM/g de proteína) de cada amostra de 150 µL foi medido a 535 nm de absorbância com a curva padrão.

2.8. Medições da Proteína Amiloide Cerebral

A proteína amilóide (A) da secção de tecido cerebral foi corada pelo método de imuno-histoquímica. A porcentagem de acúmulo de A foi analisada por sistema de imagem (Leica, Q500, Wetzlar, Germany) com um microscópio sob um campo de 40×. O cálculo foi baseado na porcentagem da área de acúmulo A em todo o cérebro: (-área de deposição de amilóide/área cerebral total) × 100 por cento.

2.9. Histologia

Os cérebros foram extirpados e fixados com formalina a 10 por cento. O tecido hipocampal foi processado através do processo de desidratação, limpeza, infiltração e inclusão para seccionamento. Em seguida, o tecido da região do hipocampo foi examinado pela coloração de Hematoxilina e Eosina (H&E).

2.10. Estatística

O banquinho estatístico SPSS 19.0 foi utilizado neste estudo. Todos os dados são expressos como média ± SEM e avaliados por ANOVA one-way para comparação de médias entre os diferentes grupos. Uma diferença significativa foi considerada quando o valor-p foi inferior a 0,05 pelos testes de intervalo múltiplo de Duncan. No teste de sobrevivência, foi aplicado o teste de Kaplan–Meier para análise e o teste de log-rank para verificar as diferenças entre os grupos.

3. Resultados

3.1. Efeito de L. plantarum GKM3 no teste de sobrevivência SAMP8

No experimento de sobrevivência, o tempo de vida dos camundongos SAMP8 foi observado até sua morte natural e levou 21 meses para completar todos os registros individuais. A expectativa de vida média de camundongos machos SAMP8 não tratados foi de 11,90 ± {{10}},18 meses e para fêmeas foi de 11,20 ± 0,21 meses. Nos grupos de alimentação com probiótico GKM3, a expectativa de vida masculina média aumentou para 12,05 ± 0,15 meses e 13,50 ± 0,14 meses em doses baixas e altas de tratamentos com GKM3, respectivamente. O efeito dose-dependente do probiótico GKM3 na extensão da expectativa de vida em mulheres também pode ser observado com 12,15 ± 0,21 meses no grupo de baixa dose e com 14,30 ± 0,17 meses no tratamento com alta dose (dados não mostrados).

Para resumir a expectativa de vida, a taxa de sobrevivência foi estimada. Com uma sobrevida de 50 por cento, a baixa dosagem de GKM3 no grupo masculino foi de 12,67 meses e a alta dosagem de GKM3 no grupo masculino foi de 13,33 meses, enquanto o grupo controle masculino apresentou apenas 12,50 meses (Figura 1A). Semelhante à observação em camundongos fêmeas SAMP8, 12,00 meses e 15,50 meses com uma taxa de sobrevivência de 50 por cento foi mostrado em grupos alimentados com probiótico GKM3 em uma dosagem de 1,0 × 109 CFU/kg PC/dia e 5,1 × 109 UFC/kg PV/dia, respectivamente; no entanto, 10,50 meses com taxa de sobrevida de 50 por cento foi observada no grupo controle feminino (Figura 1B). Os camundongos fêmeas SAMP8 apresentaram expectativa de vida menor que os machos como base neste experimento; Curiosamente, o efeito de L. plantarum GKM3 em termos de longevidade teve maior impacto nas fêmeas. Sugere-se que L. plantarum GKM3 pode aumentar a longevidade em camundongos SAMP8 de ambos os sexos, especialmente em espécies femininas.

3.2. Peso corporal, ingestão de alimentos e ingestão de água em camundongos SAMP8

No experimento sobre comprometimento cognitivo relacionado à idade, não houve diferenças significativas no consumo de energia e mudança de peso entre todos os camundongos SAMP8 dos diferentes grupos de tratamento antes do sacrifício (Tabela 1). Isso significa que o probiótico GKM3 não afetou esses parâmetros metabólicos no modelo de camundongo idoso.

3.3. Efeito de L. plantarum GKM3 na retenção de memória e aprimoramento do aprendizado

Um teste de atividade de locomoção mostrou que não houve diferença significativa entre todos os camundongos SAMP8 no primeiro intervalo de 5-min, independentemente do gênero (Tabela 2). Embora tenha havido uma diminuição no segundo intervalo 5-min, quando comparado ao primeiro intervalo 5-min, não houve mudança significativa entre os grupos tratados e não tratados.

Testes de evitação passiva foram realizados em grupos machos e fêmeas de camundongos SAMP8 (Figura 2). Não houve diferenças significativas entre todos os grupos durante o teste experimental (p > 0.05). A latência de camundongos machos SAMP8 alimentados com probiótico GKM3 aumentou significativamente em comparação com o grupo controle no primeiro dia (p < 0.05) (Figura 2A). O tempo de camundongos fêmeas SAMP8 permanecendo na sala de luz também foi aumentado no primeiro dia no tratamento GKM3, com um valor-p inferior a 0,05 no grupo de baixa dose e um valor-p inferior a 0,01 no grupo de alta -dose quando comparado ao controle. No entanto, não houve diferenças significativas após o segundo dia do teste de esquiva passiva. Uma latência mais longa realizada no grupo de alimentação GKM3, tanto em camundongos machos quanto fêmeas SAMP8, indicou que o probiótico GKM3 poderia contribuir para a retenção de memória relacionada à idade e aprimoramento do aprendizado.

Em um procedimento de evitação ativa, os camundongos foram obrigados a tomar qualquer ação para evitar o estímulo nocivo. No dia do teste de evitação ativa, tanto os camundongos SAMP8 machos quanto as fêmeas alimentados com GKM3 apresentaram uma tendência de maior sucesso na evitação (Figura 3), mas não atingiram a diferença estatística (p > 0.{{ 9}}5) quando comparado com o grupo controle. No entanto, o resultado nos dias um e dois do teste de evitação ativa mostrou que o tempo de sucesso aumentou significativamente nos grupos machos com GKM3 alimentados quando comparados aos camundongos machos SAMP8 não tratados (Figura 3A) (p < 0,05). Resultado semelhante também foi observado nos grupos femininos (Figura 3B). Curiosamente, não houve diferenças estatísticas (p=0.157) no resultado do quarto dia entre os grupos controle e probiótico. Isso significa que os camundongos de controle precisaram de treinamento por quatro dias para acompanhar a presença dos camundongos alimentados com probióticos. Sugere-se que a adição do probiótico GKM3 à dieta pode ajudar na cognição do hospedeiro, o que afeta o comportamento adequado em ambos os sexos.

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